Saggio immunoenzimaBco ELISA
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Saggio immunoenzima,co ELISA Enzyme-­‐Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-­‐Assorbente legato ad un Enzima) Dire4o (o “sandwich”): accertare la presenza di un an,gene Indire4o: accertare la presenza di un an,corpo ELISA Ø diagnos@ca clinica Ø ricerca scien@fica Ø economico, rapido, quan@ta@vo, specifico Ø sensibilità (pg/ml) Ø automa@zzazione (robot) INDIRECT: ELISA TO DETECT SPECIFIC ANTIBODIES ü screening hybridoma supernatants ü detec@ng clinically important an@bodies -­‐ autoan@bodies -­‐ (HIV, HBV,) -­‐ allergens COATING 1. Antigen BLOCKING 2. BSA 1. Antigen SAMPLE 3. Sample antibody 2. Blocking 1. Antigen SECONDARY Ab 4. Anti- Ig-enzyme (alkaline phosphatase coniugate) 3. Sample antibody 2. Blocking 1. Antigen E Phosph. A E E RIVELAZIONE 5. Substrate (paranitrophenyl phosphate) 4. Anti-(human) Ig-enzyme 3. Sample (human) antibody 2. Blocking 1. Antigen E E E Paranitrophenyl phosphate (PNP) Alkaline phosphatase Yellow, 450 nm Spectrophotometer Direct: sandwice ELISA to detect Antigenes Coating 1. Anti-analyte capture antibody purified Blocking 2. BSA 1-3% 1. Anti-analyte Sample + Standard 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte Detection 4. Antibody-biotinilated 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin biotin Conjugation 5. Streptavidin-enzyme HRP 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes Streptavidin-HRP biotin Streptavidin-HRP biotin Substrate 6. TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte Streptavidin-HRP biotin Streptavidin-HRP biotin Streptavi din-HRP bi Develop TMB Streptavi din-HRP bi ot in ot in 6. TMB 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte Streptavidin-HRP biotin Streptavidin-HRP biotin Stop reaction Streptavidi n-HRP bi oti n 7. H2SO4 1N Streptavidi n-HRP bi oti n 6. TMB 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte Streptavidin-HRP biotin Streptavidin-HRP biotin Analisi Quantitativa: la retta standard nel saggio diretto Sandwich, y=mx+q L’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di enzima La quantità di enzima presente nel pozzetto è proporzionale alla quantità di anitcorpo secondario La quantità di anticorpo secondario è proporzionale alla quantità di ANTIGENE Quindi l’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di antigene! Streptavidin-HRP biotin Streptavidin-HRP biotin La retta standard (o di taratura) la si prepara, dopo il blocking, aggiungendo in alcuni pozzetti quantità note di antigene. Sarà quindi possibile associare a quantità note di antigene una determinata assorbanza allo spettrofotometro Determinazione concentrazione IL-2 0,8 y = 0,1273x + 0,0386 R2 = 0,9823 O.D. 450 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 ng/ml 4 5 6 Determinazione concentrazione IL-2 es. O.D. = 0.516 0,8 y = 0,1273x + 0,0386 R2 = 0,9823 O.D. 450 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 ng/ml 4 5 6 y = mx + q y = 0,1273x + 0,0386 y = nota x = y – (+ q) / m x = 0,516 – (+ 0,0386) / 0,1273 = 3,750
