Saggio immunoenzima,co ELISA Enzyme-­‐Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-­‐Assorbente legato ad un Enzima) Dire4o (o “sandwich”): accertare la presenza di un an,gene Indire4o: accertare la presenza di un an,corpo ELISA Ø diagnos@ca clinica Ø ricerca scien@fica Ø economico, rapido, quan@ta@vo, specifico Ø sensibilità (pg/ml) Ø automa@zzazione (robot) INDIRECT: ELISA TO DETECT SPECIFIC ANTIBODIES ü screening hybridoma supernatants ü detec@ng clinically important an@bodies -­‐ autoan@bodies -­‐ (HIV, HBV,) -­‐ allergens COATING
1. Antigen
BLOCKING
2. BSA
1. Antigen
SAMPLE
3. Sample antibody
2. Blocking
1. Antigen
SECONDARY Ab
4. Anti- Ig-enzyme
(alkaline phosphatase coniugate)
3. Sample antibody
2. Blocking
1. Antigen
E
Phosph. A
E
E
RIVELAZIONE
5. Substrate
(paranitrophenyl phosphate)
4. Anti-(human) Ig-enzyme
3. Sample (human) antibody
2. Blocking
1. Antigen
E
E
E
Paranitrophenyl phosphate (PNP)
Alkaline phosphatase
Yellow, 450 nm
Spectrophotometer
Direct: sandwice ELISA to detect Antigenes
Coating
1. Anti-analyte
capture antibody purified
Blocking
2. BSA 1-3%
1. Anti-analyte
Sample + Standard
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Detection
4. Antibody-biotinilated
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
biotin
biotin
Conjugation
5. Streptavidin-enzyme HRP
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Substrate
6. TMB
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB)
Liquid Substrate System for ELISA
5. Streptavidin-enzyme
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavi
din-HRP
bi
Develop TMB
Streptavi
din-HRP
bi
ot
in
ot
in
6. TMB
5. Streptavidin-enzyme
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Stop reaction
Streptavidi
n-HRP
bi
oti
n
7. H2SO4 1N
Streptavidi
n-HRP
bi
oti
n
6. TMB
5. Streptavidin-enzyme
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Analisi Quantitativa:
la retta standard nel saggio diretto Sandwich, y=mx+q
L’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di enzima
La quantità di enzima presente nel pozzetto è proporzionale alla quantità di
anitcorpo secondario
La quantità di anticorpo secondario è proporzionale alla quantità di ANTIGENE
Quindi l’intensità della
reazione colorimetrica
è proporzionale alla
quantità di antigene!
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
La retta standard (o di taratura) la si prepara, dopo
il blocking, aggiungendo in alcuni pozzetti quantità
note di antigene.
Sarà quindi possibile associare a quantità note di
antigene una determinata assorbanza allo
spettrofotometro
Determinazione concentrazione IL-2
0,8
y = 0,1273x + 0,0386
R2 = 0,9823
O.D. 450
0,6
0,4
0,2
0
0
1
2
3
ng/ml
4
5
6
Determinazione concentrazione IL-2
es. O.D. = 0.516 0,8 y = 0,1273x + 0,0386 R2 = 0,9823 O.D. 450 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 ng/ml
4 5 6 y = mx + q
y = 0,1273x + 0,0386
y = nota
x = y – (+ q) / m
x = 0,516 – (+ 0,0386) / 0,1273 = 3,750
