Saggio Immunoenzimatico ELISA
diretto o a "sandwich”: accertare la
presenza di un antigene;
indiretto: accertare la presenza di un
anticorpo specifico contro un antigene
ELISA DIRETTO:
1) Ieri coating con anticorpo anti IL-2
2) Stamattina blocking con PBS-BSA3%
3) CAMPIONI e curva standard: su piastra diversa preparare diluizione
campioni MLR e curva standard.
Campionià tal quale + 3 diluizioni 1:2, partire da volume di 250 µl,
diluire in 125µl di reagent diluent
Curva standardà fare 7 diluizioni a partire da 2ng/ml, dil 1:2, da volume
di 250 µl, diluire in 125µl di reagent diluent, 8° pozzetto SOLO reagent
diluent.
CONC. Iniziale rIL-2 140 ng/ml
4) 2 lavaggi con 200µl PBS-TWEEN 0,05%, poi 50 µl/well
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 PIASTRA ELISA
1:2
1:2
1:2
1:2
1:2
1:2
PIASTRA “gemella” x diluizioni
prepare 250µl di IL-2 2ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng)
PIASTRA “gemella” x diluizioni
prepare 250 ul di IL2 2 ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng)
1:2
1:2
1:2
Dilute1:2 from well A1; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A1)
Dilute1:2 from well A2; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A2)
Dilute1:2 from well A3; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A3)
…
1:2
1:2
1:2
ONLY 125 ul RD
250 µl
STD
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
125 µl
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
bianco
PIASTRA ELISA
PIASTRA “gemella” x diluizioni
Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes
eg. hormones
drugs
tumour antigens
cytokines
Direct: sandwice ELISA to detect Antigenes
Coating
1. Anti-analyte
capture antibody purified
Blocking
2. BSA 1-3%
1. Anti-analyte
Standard-Sample
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Detection
4. Antibody-biotinilated
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
biotin
biotin
Conjugation
5. Streptavidin-enzyme HRP
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Substrate
6. TMB
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB)
Liquid Substrate System for ELISA
5. Streptavidin-enzyme
Streptavidin-HRP
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Stop reaction
7. H2SO4 1N
6. TMB
5. Streptavidin-enzyme
4. Anti-analyte-biotin
3. Sample
2. Blocking
1. Anti-analyte
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Analisi Quantitativa:
la retta standard nel saggio diretto Sandwich, y=mx+q
L’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di enzima
La quantità di enzima presente nel pozzetto è proporzionale alla quantità di
anitcorpo secondario
La quantità di anticorpo secondario è proporzionale alla quantità di ANTIGENE
Quindi l’intensità della
reazione colorimetrica
è proporzionale alla
quantità di antigene!
Streptavidin-HRP
biotin
Streptavidin-HRP
biotin
Per domani portare un computer per gruppo analisi elisa sandwich [email protected]
Lab. 5013 - ed. U4, 5° piano
Studio 2027/B - ed. U3, 2° piano
