La variazione genetica associata alla percezione del

LABORATORIO DIDATTICO DI GENETICA MOLECOLARE
Bitter receptor gene TAS2R38
La variazione genetica associata alla percezione
del gusto amaro
QUADRO GENERALE DELL’ATTIVITA’
MODULO DI GENETICA MOLECOLARE:
- Laboratorio di bioinformatica
Copie del testo
Testi in PP
- Laboratorio di Genetica molecolare
TECNICHE UTILIZZATE IN LABORATORIO
- Estrazione di DNA dalle cellule
della mucosa boccale
- PCR
- Elettroforesi
ADATTA PER :
Triennio della scuola superiore
CONCETTI CHIAVE
-
MATERIALE:
TEMPO DI REALIZZAZIONE
DNA/mRNA/
Gene/Locus/Allele
Polimorfismo allelico
Aplotipo
Linkage Disequilibrium
- 2 ore Bioinformatica
- 2 moduli di 4 ore hands-on Lab
ATTIVITA’ WEBSITE
- http://learn.genetics.utah.edu/
Virtual lab
- http:// www.dnalc.org
PREREQUISITI
1
2..
3.
4
5.
6.
7.
8.
La struttura del DNA.
Dal DNA al cromosoma
Aploidia/Diploidia
Gene/Locus/Allele
Genotipo/Fenotipo
Duplicazione del DNA
Trascrizione del mRNA
Traduzione
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Struttura dei geni
Regolazione dell’espressione genica.
Il promotore
Splicing .
Enzimi di restrizione
Polimorfismi
Polimorfismo allelico
Polimorfismi di sequenza
1
INDICE
GUIDA PER IL DOCENTE
A. Obiettivi
B. Background di conoscenze da fornire allo studente
C. Argomenti correlati all’attività di Laboratorio:
1. Trascrizione e maturazione dell’RNA
2. Struttura ed espressione dei geni. Il promotore
3. Polimorfismi di sequenza del DNA
4. Enzimi di restrizione
5. SNPs
6. Aplotipi
7. Analisi di Linkage
D. Strategia d’insegnamento:
1. Attività di Bioinformatica
Abstract . Prerequisiti. Concetti chiave
2. Attività hands-on in laboratorio
Abstract. Prerequisiti
Tecniche utilizzate in laboratorio per
l’ Analisi molecolare del DNA:
- Estrazione del DNA
- PCR
Termociclatori
Taq polimerasi
Scelta dei primer
- Elettroforesi su gel di agarosio
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3
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4
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5
8
9
10
12
14
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“ Bitter receptor gene TAS2R38. La variazione genetica associata alla
percezione del gusto amaro”
Bioinformatica
La percezione dell’amaro
Il Gusto.
Genetica del gusto amaro
I recettori dell’amaro. La famiglia TAS2R
Polimorfismo rs1726866 o V262A
Laboratorio
Bitter Taste Sensitivity Test Laboratorio
Bibliografia
PAGINE PER LO STUDENTE
- Background di conoscenze
- Glossario
- Test per studenti:
Basic Knowledge Test
Post Test
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18
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26
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pag. 30
pag. 33
pag. 34
pag. 35
2
Guida per il docente
A. Obiettivi:
In questa attività si studia la condizione nota come “Percezione del gusto amaro”
correlata con il gene TAS2R38 che codifica per il recettore per l’amaro. Tre SNPs
sono implicati nella espressione fenotipica che identifica soggetti “taster” e “non
taster”; gli studenti potranno identificare due dei tre SNPs, in linkage
disequilibrium, associati ai fenotipi AV/AV,AV/AI e AI/AI.
B. Background di conoscenze da fornire allo studente
1. Leggi di Mendel e terminologia della Genetica mendeliana
2. Struttura chimica del DNA e livelli di organizzazione molecolare.
3. Duplicazione, trascrizione, traduzione
4 Meccanismi di regolazione
C. Argomenti correlati all’attività di laboratorio
1. Meccanismi di regolazione
2. I polimorfismi di sequenza del DNA: i RFLP e gli SNP. Frequenza degli SNP e
individuazione degli SNP
3. Aplotipi
4. Sudi di Linkage
D. Strategia d’insegnamento:
1. Attività di Bioinformatica:
Abstract:
Gli studenti navigano in Internet
Internet
utilizzando il Modulo
”Percorso di Bioinformatica”
SNP
per compiere una ricerca web e per
imparare l’approccio metodologico
di un lavoro di ricerca
Materiale:
Computers con accesso a
Concetti chiave: Geni, alleli,
Durata: Due ore
2. Laboratorio di Genetica Molecolare
Abstract:
Il DNA genomico viene estratto dalle cellule
della mucosa buccale.
Il polimorfismo C/T è identificato mediante
PCR e successivo sequenziamento per definire
gli aplotipi AV/AV, AV/AI (taster) e AI/AI
(non taster) relativi ai due SNPs A262V(C/T)
Durata: 2 mezze giornate
e I296V(A/G) in linkage disequilibrium
Concetti chiave:
Lo studio del carattere “Percezione del gusto amaro”,
mediante l’analisi di due SNPs in linkage disequilibrium,
introduce al concetto di aplotipo e alla loro definizione
Età: 17-18 anni
3
Argomenti correlati all’attività di laboratorio
1. I meccanismi di regolazione della trascrizione
L’informazione genetica contenuta nelle sequenze del DNA viene trasferita all’RNA e dall’RNA
al polipeptide corrispondente.
Durante la trascrizione, un complesso proteico, comprendente l’enzima RNA polimerasi,
sintetizza le molecole di RNA sullo stampo delle sequenze di DNA che costituiscono le unità di
trascrizione.
La RNA polimerasi si lega al sito d’inizio della trascrizione insieme ad altre proteine, dette
fattori di trascrizione. Questi fattori, mediante l’interazione con brevi sequenze di DNA
presenti nella regione a monte dell’inizio della trascrizione (promotore), servono a
posizionare la RNA polimerasi nel sito giusto e a separare i due filamenti di DNA per formare la
bolla di trascrizione. L’enzima usa come stampo uno dei due filamenti di DNA in direzione 5’>3’,catalizzando il legame fosfodiestere tra il gruppo ossidrilico legato al C3’ del ribonucleotide
precedente e il fosfato del nuovo ribonucleotide. Il processo continua fino a che la polimerasi
incontra una sequenza di arresto. A questo punto si stacca e libera la catena di RNA, mentre
la bolla di trascrizione si richiude e il DNA riassume la conformazione a doppia elica.
L’RNA neosintetizzato ha la sequenza di basi identica a quella di uno dei due filamenti di DNA
(il filamento senso), anche se la Timina è sostituita dall’Uracile.
Da uno stesso gene possono essere trascritte consecutivamente numerose copie di RNA e il
livello di trascrizione dipende da complessi meccanismi (vedi la regolazione della trascrizione).
E’ importante ricordare che le cellule eucariotiche possiedono tre tipi di RNA polimerasi:
- RNA polimerasi I trascrive i geni degli RNA ribosomiali
- RNA polimerasi II trascrive i geni che codificano proteine sintetizzando
i precursori degli RNA messaggeri e anche alcuni piccoli RNA
- RNA polimerasi III trascrive i geni di tutti gli RNA transfer, un RNA ribosomiale e altri
piccoli RNA.
I precursori degli mRNA neosintetizzati (trascritti primari) devono subire una serie di
modificazioni prima di essere trasferiti nel citoplasma per venire tradotti sui ribosomi.
Questo processo di maturazione degli mRNA include le seguenti modificazioni:
• Aggiunta all’estremità 5’ di un cappuccio (cap). Al primo nucleotide all’estremità 5’ della
molecola di RNA nascente viene rimosso il fosfato terminale e viene aggiunta una molecola di
Guanosina monofosfato (GMP) metilata in posizione 7’. Il capping serve per proteggere il
trascritto dall’attacco delle esonucleasi che lo degraderebbero, e per facilitare il trasporto dal
nucleo al citoplasma.
• Rimozione di alcune sequenze che non vengono tradotte (processo di splicing). Quasi tutti
i geni eucariotici sono divisi in sequenze codificanti, chiamate esoni, e sequenze non tradotte,
dette introni. Questi ultimi vengono rimossi dai trascritti primari mediante il processo di
splicing. Gli introni sono quindi sequenze di DNA, situate tra due esoni, le quali sono trascritte
ma non tradotte. Salvo rare eccezioni, gli introni iniziano sempre con i nucleotidi GT e
terminano con i nucleotidi AG (regola GT-AG). Nel processo di splicing si verifica prima la
scissione all’inizio dell’introne (5’), poi l’estremità libera dell’introne si ripiega su se stessa
formando una struttura simile ad un laccio e infine avviene il taglio a livello della giunzione 3’
dell’introne. Quindi i due esoni si uniscono mentre l’introne va perso. Una struttura
macromolecolare (costituita da varie subunità di molecole di piccoli RNA nucleari, gli snRNP,
e da una serie di proteine specifiche) promuove e controlla le reazioni dello splicing.
• Aggiunta all’estremità 3’ di una coda poli-A. La maggior parte delle unità di trascrizione
hanno una breve sequenza (AATAAA) che specifica il sito di termine della trascrizione. Circa
15-30 nucleotidi a valle di questo sito, l’RNA neosintetizzato viene scisso da un enzima, una
endonucleasi, e alla molecola di RNA vengono aggiunti circa 200 residui di Adenosina
monofosfato (AMP). Questa coda di poli-A ha lo scopo di stabilizzare le molecole degli mRNA
maturi e di facilitare il loro trasporto dal nucleo al citoplasma.
4
2. STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI
Dal punto di vista della genetica molecolare per gene s’intende una sequenza di DNA
potenzialmente trascrivibile in RNA funzionalmente attivo. Tale RNA può svolgere direttamente
una funzione strutturale e/o catalitica (rRNA, tRNA) oppure trasportare l’informazione per
la sintesi di una proteina (mRNA). Nel genoma umano si stima che siano presenti circa
23.000geni codificanti proteine e 1000-2000 geni codificanti RNA strutturali. Da recenti studi
emergerebbe però l’esistenza di diverse migliaia (o decine di migliaia) di trascritti non
codificanti che potrebbero non avere alcuna funzione o, viceversa, svolgere un ruolo
fondamentale nella regolazione della conformazione della cromatina e della trascrizione di geni
codificanti proteine.
IL PROMOTORE
La regione a monte del sito d’inizio della trascrizione è detta promotore. La numerazione dei
nucleotidi inizia da -1, che corrisponde al nucleotide che precede il sito d’inizio della
trascrizione (indicato con +1). In questa regione, di lunghezza variabile, si trova una serie di
brevi sequenze che vengono riconosciute e legate da fattori di trascrizione. I fattori di
trascrizione favoriscono il legame dell’RNA polimerasi al sito giusto per iniziare la sintesi di
RNA. I geni che presentano elevati livelli di trascrizione, presentano nel promotore delle
sequenze specifiche ( i TATA box a circa -25 bp dal sito d’inizio della trascrizione; il CAAT box,
a -80 bp dal sito d’inizio della trascrizione, i GC box). Accanto a sequenze comuni a molti
promotori vi sono elementi che sono riconosciuti da fattori di trascrizione tessuto-specifici.
Anche i geni che mostrano un’espressione tessuto-specifica vengono spesso trascritti a livelli
molto bassi in tutte le cellule. Vi sono altre sequenze che vengono riconosciute da fattori di
trascrizione quali gli elementi di risposta, localizzati nel promotore o nella regione 5’ del gene,
e gli elementi indicati come enhancer (intensificatori), che servono per aumentare i livelli
basali della trascrizione e sono localizzati a distanza variabile dal gene, talvolta anche a valle
del sito d’inizio della trascrizione, vale a dire all’interno della regione trascritta.
5
3. REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE
Due sono le condizioni perché si abbia una efficace trascrizione:
1. La presenza nella cellula di specifici fattori di trascrizione che interagiscono con
brevi sequenze nel promotore del gene e con sequenze enhancer e consentono
l’assemblaggio del complesso di trascrizione
2. Una conformazione della cromatina del gene “aperta”,ovvero i nucleosomi non
compattati e, possibilmente, il DNA non associato agli istoni nel promotore.
Il controllo dell’espressione genica mediante il legame di fattori proteici con le
sequenze di regolazione è estremamente complesso e coinvolge numerosi fattori che
possono essere grossolanamente distinti in fattori ubiquitari e tessuto-specifici.
L’interazione di fattori specifici con gli elementi enhancer è importante per
l’espressione genica tessuto-specifica.
Elementi regolatori della trascrizione
1.fattori di trascrizione
2.elementi cis-acting
3.elementi di regolazione distanti anche 1 Mb
4.Promotori alternativi/multipli
5.Modificazioni in DNA e istoni(acetilazioni,metilazione)/accessibilità alla cromatina
6.piccoli RNAs di tanti tipi.
Enhancers
Gli enhancers sono sequenze nucleotidiche cis-agenti che esplicano la loro funzione
aumentando notevolmente (fino a 200 volte) la frequenza di trascrizione del gene che
controllano. Dal punto di vista strutturale, un enhancer non differisce molto da un
promotore.Gli enhancers non devono necessariamente essere vicini ai promotori: è
possibile infatti trovare degli enhancer a parecchie centinaia di migliaia di paia di basi
di distanza a valle o a monte del sito d'inizio della trascrizione.
Elementi cis-acting
“Cis-acting” generalmente significa “che agisce sulla stessa molecola”. Nel contesto
della regolazione della trascrizione, sono generalmente considerati “elementi
cisacting” delle sequenze di DNA, che attraverso i fattori di trascrizione,regolano
l’espressione dei geni sullo stesso cromosoma.
Un esempio di sequenza regolatoria cis-acting è l’”operatore” dell’operone lac.
Questa sequenza di DNA è legata dal repressore lac che impedisce la trascrizione dei
geni adiacenti sulla stessa molecola di DNA. Possiamo dire quindi che l’operatore lac
“agisce in cis” nella regolazione dei geni vicini. L’operatore non codifica per alcuna
proteina o RNA.
Vi sono inoltre numerosi altri meccanismi da cui dipende il meccanismo
dell’espressione genica, come l’attivazione dei fattori di trascrizione in seguito al
legame di un ligando, per esempio un ormone, ad uno specifico recettore sulla
6
superficie cellulare. Infatti l’espressione di molti geni è controllata da un ormone, da
un fattore di crescita o da una molecola di segnale intracellulare (es. cAMP) i quali
legandosi a recettori specifici determinano l’attivazione o inattivazione di determinati
fattori di trascrizione (es. mediante la loro fosforilazione o defosforilazione). I fattori
attivati interagiscono quindi con gli elementi di risposta presenti nel promotore e
inducono l’espressione del gene corrispondente.
Notevoli progressi sono stati fatti recentemente nell’identificazione di modificazioni
della cromatina associate a una conformazione aperta (attiva) o compatta (inattiva).
Tali modificazioni sono dette epigenetiche, perché non modificano la sequenza
primaria del DNA. Generalmente la cromatina attiva è caratterizzata da un alto livello
di acetilazione degli istoni H3 e H4. Al contrario, gli istoni associati alla cromatina
inattiva, non trascritta, sono tutti de-acetilati. Un’altra modifica degli istoni è la
metilazione. La metilazione epigenetica più studiata riguarda però lo stesso DNA e
consiste nella metilazione delle citosine, tipica delle regioni non trascritte e dei
promotori di geni trascrizionalmente inattivi. Le citosine metilate vengono riconosciute
da proteine determinando il reclutamento di altre proteine che modificano la
cromatina e la compattano, facilitando l’inattivazione trascrizionale del gene stesso.
Struttura di esoni e introni
Il primo esone comincia al sito d’inizio della trascrizione, ma il primo tratto (fatto di
200-300 bp) non è codificante; questo segmento pertanto è trascritto, ma non
tradotto e viene indicato come regione 5’UTR ( UnTraslated Region). La regione
5’UTR è importante per l’efficienza della traduzione in quanto facilita il legame
dell’mRNA ai ribosomi.
La regione tradotta inizia generalmente con ATG, nel 1° esone. Il numero degli esoni
presenti nei geni umani è altamente variabile. Vi sono geni piccoli costituiti da un
singolo esone e altri che possiedono più di 100 esoni. Il numero medio è di 9-10 esoni
per gene. I singoli esoni sono generalmente piuttosto piccoli con dimensioni medie di
circa 200bp, ma esistono alcuni esoni eccezionalmente lunghi che possono superare
anche le 5 kb. Al contrario degli esoni, la dimensione degli introni è molto variabile.
Generalmente i geni piccoli hanno introni piccoli, mentre in quelli più grandi gli introni
possono avere anche una lunghezza di 10-20 kb. Quasi tutti gli introni cominciano con
GT (sito donatore di splicing) e terminano con AG (sito accettore di splicing).
Questi dinucleotidi sono circondati da sequenze consenso, altamente conservate nel
corso dell’evoluzione e molto simili tra loro. Il processo di splicing deve essere molto
preciso dato che lo spostamento anche di un singolo nucleotide determinerebbe lo
slittamento del modulo di lettura e quindi la sintesi di una proteina alterata. L’ultimo
esone, così come il primo, contiene una sequenza trascritta, ma non tradotta, detta
regione 3’UTR.
Trascritti alternativi e isoforme proteiche
Un tempo si riteneva che ogni gene codificasse per un unico prodotto polipeptidico o
molecola di RNA, mentre oggi si sa che la maggioranza di geni umani specifica due o
più forme alternative di proteine (isoforme). I meccanismi con i quali vengono
generate queste diverse isoforme sono:
- l’uso di promotori alternativi
- lo splicing alternativo
- la poliadenilazione alternativa
Si conoscono diversi geni umani che hanno due o più promotori che sono attivi
specificamente in determinati tessuti e dirigono la sintesi di isoforme tessutospecifiche
oppure vengono attivati durante un particolare stadio dello sviluppo. Il
meccanismo più frequente con il quale si generano delle isoforme diverse è lo
splicing alternativo, che consiste nell’assemblaggio diffrenziale di esoni durante la
maturazione dell’RNA. Si stima che oltre il 60% dei geni umani produca due o più
7
proteine mediante questo meccanismo. Molti esoni specificano domini proteici
strutturali distinti che possono essere combinati in modo diverso nelle cellule dei
diversi tessuti nei quali il gene è espresso. Pertanto a partire da un singolo gene
possono venire generate proteine simili, ma non identiche che possono avere funzioni
diverse nei vari tessuti.
4. POLIMORFISMI DI SEQUENZA DEL DNA
Il termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”.
In genetica, il polimorfismo può essere analizzato sia a livello proteico che di materiale
genetico. In questo secondo caso, le forme diverse, ossia le varianti genetiche possono
riguardare un gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina (polimorfismo
allelico), oppure un tratto di DNA non codificante (polimorfismo di sequenza).
Queste diversità di sequenza si definiscono polimorfismi e dato che più del 98% del DNA
umano è DNA non codificante, e che quindi la maggior parte di queste differenze è localizzata
in sequenze non codificanti, il fenotipo di un polimorfismo di sequenza del DNA non è
riconoscibile dall’esterno (ex. nei gruppi sanguigni). Dato l’elevato numero di loci polimorfici, i
polimorfismi di sequenza sono molto più frequenti dei polimorfismi allelici tradizionali (gruppi
sanguigni, albinismo, colore degli occhi, ecc..) e conseguentemente più utili nella ricerca
biologica e medica.
E’ stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000.
Quando un polimorfismo interessa una sequenza riconosciuta da un Enzima di Restrizione,
la variazione, creando o distruggendo il sito di restrizione, darà luogo a differenze nei siti di
taglio di quel dato enzima all’interno della popolazione. Digerendo con quell’enzima il DNA di
individui diversi, si osserva quindi un polimorfismo di lunghezza dei frammenti di
restrizione – RFLP - e cioè dal DNA di individui diversi si generano frammenti di restrizione
diversi.
Come tutti i polimorfismi, i RFLP possono essere equiparati ad alleli codominanti di un locus
mendeliano: la presenza o assenza di uno o dell’altro allele può essere riconosciuta in ogni
individuo, consentendo la distinzione in omozigoti ed eterozigoti.
Il fenotipo di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze di numero e/o dimensione dei
frammenti di DNA ottenuti con la digestione con un certo enzima di restrizione. I frammenti
sono visibili dopo migrazione elettroforetica su un gel.
L’avvento della genetica molecolare ha permesso di identificare i polimorfismi del DNA, che
sono diventati i marcatori genetici più comunemente usati. Attualmente si utilizzano tre tipi di
polimorfismi del DNA:
1. i Polimorfismi di Lunghezza dei Frammenti di Restrizione, o RFLP
2. i Polimorfismi del Singolo Nucleotide, o SNP
3. i Polimorfismi di Lunghezza di Sequenze Semplici, o SSLP che vengono poi distinti in
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) o minisatelliti, e i STR (Simple Tandem
Repeats ) o microsatelliti.
5. GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE
Un sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di
DNA riconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la
molecola di DNA.
Questi siti sono generalmente palindromici (cioè possono essere letti in entrambe le
direzioni) la cui successione di basi è identica su entrambi i filamenti quando ciascuno di essi
venga letto in direzione 5’ -> 3’. La sequenza riconosciuta non è unica e varia da enzima ad
enzima, anche se con la stessa specificità di sequenza. Infatti, sebbene gli enzimi di restrizione
isolati siano oltre 3500, le sequenze bersaglio che possono essere tagliate sono molto meno
numerose (poco più di 200 ).
I siti di restrizione sono delle normali sequenze di basi, lunghi dai 4 fino a diverse decine di
paia di basi, per cui si possono trovare più o meno facilmente nel genoma.
Un enzima di restrizione può tagliare all’interno di una sequenza o nelle sue vicinanze, oppure
8
la sequenza consenso può anche essere distante diverse centinaia di basi.
Il taglio prodotto dagli enzimi può generare frammenti di DNA con estremità piatte (blunt), o
sporgenti ( 5’-protruding e 3’-protruding).
Le estremità prodotte sono “appiccicose”, cioè possono formare ponti Idrogeno tra le due code
a filamento singolo complementari. Le estremità coesive facilitano inoltre la reazione della DNA
ligasi.
L’enzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità coesive a singolo filamento
al 5’ (5’-protruding): 5’...G/ AATTC.. 3’
3’...CTTAA /G...5’
L’enzima HhaI opera un taglio sfalsato creando due estremità coesive a singolo filamento al 3’
(3’-protruding ) : 5’… G C G /C… 3’
3’… C/G C G… 5’
enzima
Organismo di
provenienza
Sequenza d
riconoscimento e
posizione di taglio
Pronuncia
E.Coli RY13
G/A A T T C
C T T A A/G
Eco-ri-uno
HindIII
Haemophilus
influenzae Rd
A/A G C T T
T T C G A /A
Acca-ind-tre
BamHI
Bacillus
amyloliquefaciens
G/G A T C C
C C T A G/G
Bam-accauno
EcoRI
ENZIMI DI RESTRIZIONE. Sono prodotti dai batteri che li utilizzano per
difendersi da un DNA estraneo, esempio un virus Altri enzimi (le metilasi )
proteggono il DNA batterico grazie all’azione delle proprie endonucleasi di
restrizione. Gli ER si indicano con un sistema di lettere e numeri che si riferisce al
ceppo batterico da cui sono stati isolati.
6. POLIMORFISMO A SINGOLO NUCLEOTIDE o SNP
Un polimorfismo a singolo nucleotide (o Single Nucleotide Polymorphism o SNP9 è un
polimorfismo (cioè una variazione a livello di una sequenza di acidi nucleici) che si presenta tra
individui della stessa specie, caratterizzata da una differenza a carico di un unico nucleotide
CT A
A/G

G
T
A
SNP
Gli SNPs sono sostituzioni di un singolo nucleotide di una base con un’altra.
Naturalmente,possiamo avere 4 versioni per ogni SNP,una per ogni nucleotide,A,C,G,T
e la distribuzione nella popolazione potrebbe risultare in una delle seguenti
combinazioni.
9
Sono stati individuati molti SNPs nella sequenza del DNA e la sfida per la ricerca è
identificare gli SNPs correlati con un particolare effetto nel fenotipo.
Gli SNP si verificano nella popolazione con una frequenza maggiore all’1%.
Nel genoma umano si verificano SNPs all’incirca uno ogni 300 paia di basi.
Questo significa che su 3 miliardi di nucleotidi presenti nel genoma umano avremo
circa 10 milioni di SNPs.
Gli SNPs costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane.
Un polimorfismo noto è quello dei gruppi sanguigni, ~20 loci
Non bisogna confondere una mutazione puntiforme con uno SNP!
Anche se si assomigliano, non sono la stessa cosa:
- sono entrambe differenze di singoli nucleotidi, ma per parlare di SNP bisogna che
questo sia presente in almeno l’1% della popolazione.
- molte mutazioni correlate a malattie si trovano all’interno delle regioni codificanti
del gene o in quelle regolatorie e interessano la proteina corrispondente a quel
gene. Viceversa, gli SNPs non sono necessariamente localizzati nei geni, e non
sempre alterano la funzione di una proteina.
Gli SNPs sono divisi in due principali categorie:
1. Linked SNPs (detti anche indicative SNPs) non si trovano all’interno dei geni e non
alterano la funzione della proteina. Tuttavia sono correlati con una particolare risposta
ai farmaci o al rischio di ammalarsi di una certa malattia prodotta.
2. Causative SNPs alterano il funzionamento di una proteina, correlando con una
malattia o influenzando la risposta individuale ad una terapia (farmaco).
Si distinguono ancora 2 tipi di Causative SNPs:
- Coding SNPs,localizzati nella regione codificante del gene, cambiano la sequenza
di aminoacidi nella proteina.
- Non Coding SNPs
I POLIMORFISMI DEL DNA sono utili come:
- IDENTIFICATORI INDIVIDUALITA’ :
o controllo relazioni parentali in famiglie con malattie mendeliane
o Genetica di popolazione
o Indagini di paternità
o Indagini di medicina legale
- MARCATORI GENETICI ANALISI DI LINKAGE
• per identificare geni-malattia (àdiagnosi portatore)
• mappaggio sia genetico (ordinamento dei geni sui cromosomi) che fisico
(distanza fisica tra i geni)
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Come si individuano i Polimorfismi?
Per analisi diretta della sequenza del DNA :
- PCR + elettroforesi ( agarosio+ et.br./acrilamide+ et.br./acrilamide+fluoresc.)
-ჼ microchip
Un metodo utile per individuare gli SNPs è la valutazione dei cosiddetti polimorfismi di
lunghezza dei frammenti di restrizione (Restriction fragment length polymorphisms) o RFLP.
Se un allele contiene un sito di riconoscimento per un enzima di restrizione ed un altro no, la
digestione dei due alleli genererà due frammenti di dimensione differente.
In realtà oggi gli SNPs sono studiati principalmente attraverso i microarrays, che permettono
l’analisi simultanea di centinaia di migliaia di diversi SNPs ed una veloce analisi elaborata da un
computer.
Al fine di trovare una associazione tra SNPs e la risposta a un farmaco, gli scienziati
hanno considerato una serie di SNPs su un segmento più lungo di DNA.
C T/C G A C T A A/G G A C C G/T A



SNP
SNP
SNP
Questi tre SNPs possono combinarsi in 2 ( ognuno dei tre SNPs con i due possibili
nucleotidi), cioè otto differenti combinazioni
3
C
C
C
C
C
C
C
C
TG
TG
TG
TG
CG
CG
CG
CG
A
A
A
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
A
A
A
A
A
A
A
A
AGTACCGA
AGTACCTA
GGTACCGA
GGTACCTA
AGTACCGA
AGTACCTA
GGTACCGA
GGTACCTA
POSSIBILI
COMBINAZIONI
DI SNPs
Ogni combinazione di SNPs è chiamata APLOTIPO.
Quindi, possiamo dire che in questa regione di DNA ci sono 8 possibili aplotipi.
C
C
C
C
C
C
C
C
TG
TG
TG
TG
CG
CG
CG
CG
A
A
A
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
T
T
T
A
A
A
A
A
A
A
A
AGTACCGA
AGTACCTA
GGTACCGA
GGTACCTA
AGTACCGA
AGTACCTA
GGTACCGA
GGTACCTA
APLOTIPO 1
APLOTIPO 2
APLOTIPO 3
APLOTIPO 4
APLOTIPO 5
APLOTIPO 6
APLOTIPO 7
APLOTIPO 8
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RICORDA !
Nel mondo della Genetica, ogni cosa è “in paia”:
noi riceviamo un aplotipo dalla madre e uno dal padre.
Questo significa che abbiamo due aplotipi ( o un paio di aplotipi).
SNP PROFILE…………..
che cos’è ?
LA COPPIA DI APLOTIPI è lo “SNP PROFILE”
8. ANALISI DI LINKAGE
(o di Associazione o di Concatenazione)
Permette di determinare la posizione cromosomica del locus responsabile di un carattere
genetico o di una determinata malattia rispetto a ”marcatori genetici” di cui è nota la
posizione.
Un marcatore genetico è un qualunque carattere che risponde alle seguenti caratteristiche:
- è polimorfico
- è facile da identificare e stabile nelle generazioni
- segrega in modo mendeliano
Quali sono ? RFLP,VNTR, STR, SNP.
Ogni individuo possiede due copie di ciascun allele, uno ereditato dal padre e uno dalla madre.
Durante la meiosi i cromosomi omologhi segregano separatamente. Quindi, se consideriamo
due loci polimorfici situati su cromosomi diversi, un particolare allele del primo locus
avrà il 50% di probabilità di segregare insieme ad un particolare allele del secondo locus.
Se consideriamo invece due loci situati sullo stesso cromosoma, ci aspettiamo che i loro
alleli vengano ereditati insieme ( cioè co-segregano) in base alla distanza che intercorre tra oro
sul cromosoma. Più grande è la loro distanza, più è facile che un evento di crossing over separi
i due alleli.
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L’evento di crossing over dà luogo alla formazione di gameti ricombinanti
La probabilità che avvenga questa ricombinazione, espressa in percentuale, è nota come
frequenza di ricombinazione.
La frequenza di ricombinazione ci dice quindi la distanza genetica tra loci diversi.
L’analisi di concatenazione nell’uomo si basa sullo studio degli alberi genealogici e sulla ricerca
delle meiosi informative (cioè quelle in cui si può identificare se un gamete è o non è
ricombinante).
Allo stesso modo si può mappare anche un numero consistente di loci,considerandone sempre
due per volta.
Un altro approccio è quello di studiare gli aplotipi, ovvero l’ordine degli alleli sui rispettivi
cromosomi omologhi. E’ quindi necessaria una rielaborazione statistica dei dati riguardanti
l’associazione tra i marcatori e la comparsa della malattia.
Quali sono i problemi di uno studio di linkage ?
1.le famiglie da analizzare solitamente contano pochi individui
2. in famiglie poco numerose vi è un basso numero di ricombinanti
3. i risultati così ottenuti hanno una bassa significatività statistica
Quali sono le possibili soluzioni ?
1. Analizzare più famiglie insieme
Quali popolazioni studiare ?
1. Popolazioni geneticamente isolate
2. Popolazioni giovani, con poche generazioni dal momento del fondatore, con pochi
crossing over, con poche ricombinazioni
3. Popolazioni omogenee, cioè con poche famiglie fondatrici
Esempi di popolazioni che presentano queste caratteristiche sono:
- I Finlandesi: geneticamente e linguisticamente molto diversi dai loro vicini slavi.La
popolazione è giovane in quanto fondata circa 2000 anni fa da poche famiglie fondatrici
- I Sardi in Italia
LINKAGE EQUILIBRIUM: indica una combinazione casuale di alleli a loci associati.
Consideriamo per esempio il caso di due loci associati 1 e 2 con 2 possibili alleli ciascuno (A e a
per il locus 1 e B e b per il locus 2) Gli aplotipi possibili in una determinata popolazione (AB
Ab, aB, ab) si verificheranno con una frequenza che è il prodotto delle frequenze dei singoli
alleli per ciascun aplotipo.
Esempio: A = 0,2 B = 0,6
a = 0,8 b = 0,4
 4 aplotipi possibili: AB Ab aB ab
AB 0,2 x 0,6 = 0,12
Ab 0,2 x 0,4 = 0,08
aB 0,8 x 0,6 = 0,48
ab 0,8 x 0,4 = 0,32
} equilibrio di linkage
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LINKAGE DISEQUILIBRIUM: indica una combinazione non casuale di alleli a loci
associati. Il linkage disequilibrium è spesso la conseguenza di un effetto "founder" (fondatore),
cioè di una mutazione in un singolo individuo. Perchè l'effetto fondatore sia evidenziabile in
una popolazione è necessario che i due loci siano vicini, in maniera tale che gli eventi di
ricombinazione siano rari tra i due loci, e che non sia trascorso abbastanza tempo dalla
comparsa del fondatore poichè la ricombinazione puo' ristabilire nel tempo l'equilibrio.
Il linkage disequilibrium (LD) indica la presenza di associazione preferenziale tra specifici
alleli relativi a due o più loci, presenti sullo stesso cromosoma, che costituiscono di solito un
particolare aplotipo ancestrale, diffuso nella popolazione in cui è rilevato, perché trasmesso
lungo la discendenza da un comune progenitore.
Riprendiamo l’esempio dei 4 aplotipi AB, Ab, aB, ab.
Se si trovassero questi valori
AB = 0,04 –
Ab = 0,16 +
aB = 0,56 +
ab = 0,24 –
}
linkage disequilibrium
TECNICHE UTILIZZATE PER L’ANALISI MOLECOLARE DEL DNA
1. ESTRAZIONE DEL DNA.
Il DNA può essere estratto da qualunque cellula nucleata. I tipi cellulari più utilizzati sono
rappresentati dai leucociti di sangue periferico, colture cellulari (fibroblasti, amniociti, villi
coriali). L’isolamento del DNA richiede l’utilizzo di enzimi capaci di distruggere le membrane
cellulari e nucleari e di solventi organici in grado di separare le proteine dagli acidi nucleici.
Nella procedura di estrazione del DNA genomico, le cellule vengono lisate e sottoposte a
trattamento proteolitico con Proteinasi K. Il DNA purificato mediante lavaggi in colonnina viene
quindi raccolto con una soluzione di eluizione. La determinazione quantitativa della
concentrazione del DNA estratto, calcolata in ng/µl, viene effettuata mediante lettura
spettrofotometrica valutando l’assorbanza del campione a 260 nm.oppure mediante corsa su
gel.
2. LA TECNICA DELLA PCR PER L’ANALISI DEI RFLP
L’introduzione della PCR, la tecnica che consente di amplificare selettivamente un tratto di
DNA, ha rivoluzionato la genetica molecolare e le sue applicazioni sono praticamente
infinite. Uno degli ambiti di utilizzo è la diagnosi di malattie genetiche mediante analisi di RFLP.
L’utilizzo della PCR semplifica molte cose. Ad esempio, la PCR consente di analizzare uno
specifico tratto di DNA, invece di dover lavorare su tutto il DNA nucleare di una cellula,ossia sul
DNA genomico.
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica di amplificazione in vitro di un frammento di
DNA di cui si conosca la sequenza nucleotidica delle regioni terminali.
Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA genomico a doppio filamento e due
corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complementare ad un tratto di filamento
a una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l’altra complementare ad un altro
tratto posto all’altra estremità (reverse primer), in presenza di una DNA polimerasi
termostabile e di una miscela di desossinucleotiditrifosfati (dNTPs), in appropriate
condizioni di reazione, è possibile copiare numerosissime volte (30-40 volte) il tratto compreso
tra i due primer, semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione.
Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (92-95°C), la doppia elica si apre (fase di
denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per la sintesi delle catene complementari. Se
la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i
primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si
rinaturi e in presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa
72°C), inizierà la sintesi di DNA a partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension),
procedendo lungo i filamenti singoli. Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di
DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo denaturazione – annealing – extension numerose
volte (in genere da 30 a 40 volte), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un dato
tratto di DNA, corrispondente a DNA in quantità tale da essere visualizzabile in un gel di
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agarosio mediante colorazione specifica. La PCR ha rivoluzionato la genetica molecolare. Le
applicazioni della PCR sono praticamente infinite. I principali ambiti di utilizzo sono la diagnosi
prenatale delle malattie genetiche e le indagini di medicina legale.
I termociclatori
Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero processo in
modo automatico all’interno di strumenti detti termociclatori (thermal cyclers) in grado di
variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Un esempio di profilo
di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore è il seguente:
1. denaturazione del DNA: 30 sec. a 94°C
2. appaiamento(annealing)dei primer: 30 sec. a 50°-60°C 35 cicli
3. sintesi (extension)di DNA: 30 sec-5 min. a 72°C
Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi termostabile
estratta da batteri termofili (che vivono ad elevate temperature).
Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio
Thermus aquaticus. L’isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori
dall’ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione!
Scelta dei primer
Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse).
La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere
l’amplificazione di un tratto di DNA in modo specifico.
I primer devono essere “disegnati” a monte e a valle dei siti di restrizione. Si tratta di
oligonucleotidi, con dimensioni comprese tra le 15 e le 30 basi che ibridano su filamenti
opposti in posizioni fiancheggianti la regione di interesse del DNA.
Per minimizzare la formazione di artefatti è importante che le loro sequenze non contengano
basi complementari (all’interno dello stesso primer o tra i due primer); inoltre la Temperatura
di fusione dei due oligonucleotidi deve essere identica o almeno molto vicina.
3. DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE (ER)
Come abbiamo detto, gli ER sono endonucleasi che tagliano il legame fosfodiesterico nel DNA a
doppia elica a livello di sequenze specifiche (siti di restrizione). La digestione con ER va
condotta a 37°C in una soluzione tampone (fornita insieme all’enzima dal produttore) che
garantisce le condizioni ottimali (di salinità e pH) per la digestione. Il tempo di incubazione
varia a seconda se si digerisce DNA genomico o frammenti di DNA corti .Nel primo caso la
digestione richiede almeno 8 ore (o tutta la notte). Nel secondo caso sono sufficienti da 1-4
ore. Gli ER sono reagenti costosi e delicati. Temono le contaminazioni (usare precauzioni nel
prelevare l’enzima dalla soluzione stock) e l’inattivazione (si devono conservare a -20°C e, al
momento dell’uso, mantenere sempre in un bagno di ghiaccio).
4. ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare)
molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel
può essere immaginato come una rete tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le
molecole sotto l’azione di un campo elettrico. Il campo elettrico è generato da un apparecchio,
detto alimentatore.
Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le molecole di DNA sono cariche
negativamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo (catodo) verso il
polo positivo (anodo). Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è
funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è la
velocità di migrazione. E, viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più
velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in
base alla diversa velocità di migrazione. Per poter determinare la lunghezza delle molecole di
DNA in esame separate mediante elettroforesi, vengono “caricati” sul gel anche i cosiddetti
marcatori di peso molecolare,ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso
molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso molecolare noto con quella dei
frammenti di DNA in esame, è possibile calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza. Dato
che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di
nucleotidi (basi) che lo costituiscono, di solito esso viene espresso in paia di basi (bp). La
separazione elettroforetica dura circa 45 minuti circa. Al termine, i vari frammenti di DNA,
essendo incolori, possono essere visualizzati, con particolari sistemi di colorazione. Il DNA delle
diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette
15
bande di DNA. Comunemente, per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel si
aggiunge all’agarosio il bromuro di etidio, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e
di emettere fluorescenza se esposta a luce UV. Alla fine della corsa, le bande si visualizzano
esponendo il gel alla luce ultravioletta. Il bromuro di etidio va maneggiato con estrema cautela
in quanto è un agente intercalante del DNA e, come tale, ha proprietà mutagene. Noi
utilizzeremo il GEL RED, intercalante non tossico che non richiede precauzioni particolari.
5. PCR ALLELE-SPECIFICA
Nel 2001 è stata messa a punto una PCR per identificare gli SNPs in assenza di siti di
restrizione. Questo metodo si basa su Primers Allele-Specifici ed è chiamata “TetraPrimer ARMS-PCR”(ARMS= amplification refractory mutation system). Sono
necessari 4 primers per amplificare il frammento grande di DNA templato contenente
lo SNP e i due frammenti più piccoli che rappresentano i due prodotti allele specifici. I
Primers sono disegnati in modo da ottenere frammenti che differiscono in lunghezza
e che possono essere evidenziati con elettroforesi in gel di agaroso. Sotto condizioni
molto stringenti, il primer mismatched non inizierà la trascrizione, mentre invece il
primer matched la iniziarà. Il prodotto che si ottiene con l’amplificazione indica il
genotipo.
Nel caso del nostro gene Tas2R38 contenente il polimorfismo C/T potremo avere:
PCR
-- Fouter
5’______________ 3’
3’________________5’
R outer-
F
____________
____________
Amplimero
247 bp
R
Mismatch
-Fouter
---T 
5’__________ G __________3’
3’__________ C ________ 5’
C -R inner
______ G_____
______ C____ Allele C
125 bp
F inner
- ---T
5’__________ T __________3’
3’__________ A __________5’
C Mismatch -R
_____ T _______
_____A_______
Allele T
177 bp
outer
16
Frammento Fo/Ri = allele C = 125 bp
Frammento Fi/Ro = allele T = 175 bp
Gel Elettroforesi
CC
C/T
TT
247 bp
177 bp
125 bp
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BIOINFORMATICA
PREMESSA:
Principali siti di riferimento
www.ncbi.nlm.nih.gov
L’NCBI (National Centre for Biotecnology Information) sorto nel 1988, crea database pubblici,
conduce ricerche in bioinformatica, sviluppa software per analizzare dati genomici e divulga
informazioni biomediche. L’obiettivo è una migliore comprensione dei processi molecolari
riguardanti la salute umana e le malattie. Sul sito si trovano banche dati relative al menoma
umano e di altri organismi, a sequenze nucleotidiche e aminoacidiche, a strutture molecolari, a
pubblicazioni scientifiche (come PubMed, la principale banca dati bibliografica, pubblica e
gratuita, del settore biomedico). In particolare NCBI –Entrez comprende un database di
strutture biomolecolari 3D determinate sperimentalmente: MMDB ossia Molecular Modeling
DataBase. Tali strutture sono ottenute principalmente con cristallografia a raggi e
spettroscopia di risonanza magnaticanucleare (NMR); forniscono informazioni sulla funzione
biologica, la storia evolutiva e le relazioni tra le macromolecole. Il database è ovviamente più
piccolo rispetto ai data base proteici o nucleotidici (solo di una frazione delle proteine si è
determinata la struttura 3D), ma molte proteine possono considerarsi omologhe a quelle
presenti.
http://genome.ucsc.edu/
UCSC ( University of California Santa Cruz). Questo sito contiene le sequenze di riferimento e
le schermate che mostrano un’ampia collezione di genomi.
Fornisce inoltre un portale di accesso al Progetto Encode.
www.ensembl.org
ENSAMBL ( un gioco di parole tra ensamble -insieme- e EMBL, European Molecular Biology
Laboratory) è un progetto sviluppato in collaborazione tra il Sanger Center di Cambridge e
EMBL per sviluppare un software di annotazione automatica dei genomi animali.Con il termine
“annotazione” si intende l’inserimento di tutte le informazioni riguardanti la funzione di una
determinata sequenza. Ensambl aggiorna i dati almeno 10 volte l’anno.
OBIETTIVI DELL’ATTIVITA’ :
1.
2.
3.
4.
5.
Cos’è il recettore per il gusto amaro?
Come si fa a localizzare il gene d’interesse ?
Una volta che l’ho localizzato, come trovo tutte le informazioni necessarie ?
Come si caratterizza il gene ?
Come trovare il polimorfismo a singolo nucleotide rs 1766866 correlato con la
percezione del gusto amaro?
6. Come interpretare i dati statistici sulle frequenze alleliche nelle popolazioni
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1°. OBIETTIVO: COS’E’ IL RECETTORE PER IL GUSTO AMARO ?
Andiamo su GOOGLE . digitiamo NCBI. Si apre la Home Page.
2° OBIETTIVO: Come si fa a localizzare il gene TAS2R38 ?
Search: Nucleotide. TAS2R38. Andare su GO. Si apre la pag seguente
Cliccare su TAS2R38 (Homo Sapiens). Si aprirà la pagina contenente le informazioni sul gene
3° OBIETTIVO: Come si trovano tutte le informazioni necessarie ?
Nella pagina aperta leggiamo:
- Summary.
Sotto:
19
Sotto ancora:
La Bibliografia:
4° OBIETTIVO: Come si caratterizza il gene TAS2R38?
Se torniamo sopra a Genomic regions….Puntiamo il mouse su NM176817.4 Leggiamo una
seri di informazioni sul gene.
Lunghezza: 1143 bp. Proteina 333 AA
Clicchiamo sopra. Si ha una ulteriore grafica sul gene.
Clicchiamo su GeneBank
Scorriamo la pagina. Troviamo le informazioni su
- gene 1….1143
- mRNA 1..1143
- CDS 85…1086
Ciccando sul rif NM176817.4 dell’mRNA mi compare anche
exon 1…1143
Sotto troviamo la sequenza del gene.
Andiamo al Capitolo Genomic contest.
Chr 7. Location 7q34
20
Vogliamo vedere il gene in un altro database: UCSC
Clicchiamo sul gene e andiamo ad una pagina molto ricca di informazioni
5. Individuazione del Polimorfismo SNP rs1766866
Torniamo al NCBI nella pagina che avevamo lasciato aperta. Al Cap General gene
information c’è un sotto cap Genotypes. Andare a TAS2R38 SNP e Ciccare su VarView
Vediamo i tre SNPs interessanti per la variazione di percezione dell’amaro.
A noi interessa il secondo, A262V o rs1726866. Clicchiamo sopra. Si apre la pagina con lo SNP
C/T. E’ un missense alla posizione 262 della proteina.
Scorrendo la pagina avremo in Fasta la sequenza intorno allo SNP.
6. Genetica delle popolazioni
Quali frequenze alleliche di riferimento si riscontrano nella popolazione europea?
21
LA PERCEZIONE DELL’AMARO
INTRODUZIONE
Gli studi sulla genetica del gusto iniziarono casualmente nel 1931 nel laboratorio del chimico
britannico A. F. Fox. Un giorno, durante un esperimento per sintetizzare il composto PTC
(feniltiocarbamide), una sostanza di sapore amaro appartenente alla famiglia delle tiouree,
avvenne un’esplosione che disperse la sostanza nell’aria. Alcuni colleghi presenti percepirono
un forte sapore amaro mentre Fox non percepì assolutamente nulla. A questa prima
osservazione sono seguiti diversi studi che hanno dimostrato che l’incapacità di percepire il
PTC (o un composto simile chiamato PROP) varia da popolazione a popolazione da un minimo
del 3% nell’Africa occidentale a oltre il 40% in India.
È interessante notare come circa il 25% della popolazione non percepisce assolutamente il
sapore di questo costituente, anche alle alte concentrazioni. Queste persone hanno una
particolare insensibilità a questa sostanza veramente amara, diversamente dal restante 75%.
La feniltiocarbamide è uno dei composti più amari, la cui soglia di identificazione è 6,5 · 10-8
mole/l (circa 10 mg/l), pertanto sono necessarie circa 1013 molecole in 1 ml per identificarne il
sapore amaro.
L'intensità dell'amaro dipende dalla sostanza assaggiata, dalla sua concentrazione e dal tempo
di reazione nella bocca. La percezione dell'amaro si sviluppa e raggiunge il suo massimo in
pochi secondi, in contrasto con altri gusti che vengono percepiti quasi istantaneamente.
Le
soluzioni
contenenti
sostanze
amare
che
vengono
degustate
a
bassa
temperatura tendono ad essere riconosciute più amare rispetto a quelle percepite a
temperature più alte. Se presente nella soluzione, l'alcol intensifica la percezione dell'amaro,
mentre i composti dolci la riducono.
I composti amari più noti ed utilizzati nella ricerca come sostanze di riferimento nei test
gustativi sono la chinina, la naringina e la caffeina.)
Tale caratteristica influenza le nostre abitudini alimentari e ci induce a preferire o eliminare
dalla dieta determinati cibi. L'amaro è percepito come un avvertimento contro gli alimenti
pericolosi, come indicazione della presenza di veleno o di cibi alterati. Viene anche associato ai
preparati medicinali e alle erbe terapeutiche. D'altra parte, l'amaro costituisce in molti casi la
necessaria componente del gusto in certi tipi di alimenti, consentendone un'estensione del
flavor.
Nella nostra popolazione il 30% è classificato come non taster, mentre il 70% è taster. I
taster ovvero quelli che hanno una percezione molto elevata e che in genere allontanano
subito la sostanza amara con repulsione (soglia di circa 1,0 x 10-4 mol al litro), i medium
taster e i non taster ovvero quelli che percepiscono molto poco o per nulla l’amaro (soglia
maggiore di 2,0 x 10-4 M). I taster, più sensibili all’amaro, non prediligono i cibi come le
crucifere ricchi in tiouree (cavoli, broccoli, cavoletti di Bruxelles, rape ecc.), quelli contenenti
caffeina, chinino, isoumuloni (amaro della birra), naringina (pompelmi). Sono inoltre più
sensibili alla percezione del piccante (irritante per effetto di sostanze quali la capsaicina del
chili, la piperina del pepe nero, e lo zingerone presente nel ginger) e del grasso (distinguono
meglio rispetto ai non taster tra insalate con il 40% e il 10% di grassi) per una maggiore
presenza di terminazioni del nervo trigemino sulla lingua e nel cavo orale.
Ovviamente i non taster tendono a comportarsi in maniera completamente opposta.
Oggi sappiamo che altri geni sono coinvolti, oltre che nell'amaro, nelle scelte dei vari cibi e che
l'olfatto, così come la vista e l'udito, giocano un ruolo importante nella scelta e nell'appetibilità
di un cibo. Altri fattori determinanti sono l’età, il sesso, l’etnia,la cultura,il carattere.
Se ora ricordiamo la notevole diversa distribuzione di non taster nelle popolazioni dell’Africa
Occidentale (3%) rispetto a quelle dell’India (40%), sulla base di quanto sinora detto ci
aspetteremo in India una cucina mediamente più piccante, grassa e con presenza di cibi amari
rispetto a quella dell’Africa Occidentale.
PROP sensitivity  Food Perception  Preference  Selection
22
La capacità di percepire l’amaro ha avuto e sicuramente ha ancora delle notevoli implicazioni e
conseguenze sia positive che negative. Vediamone alcune:
a) in passato ha comportato sicuramente un importante vantaggio selettivo permettendo di
evitare l’ingestione di cibi amari che spesso in natura sono tossici o velenosi;
b) porta a eliminare dalla dieta cibi come le crucifere che, se introdotti in consistenti quantità,
interagiscono con il metabolismo dello iodio producendo gozzo, una grave malattia della tiroide
(a riprova di ciò va ricordato che i deficit tiroidei sono rari tra i taster);
c) porta a preferire diete povere in frutta e vegetali (cosa che può tradursi in una ridotta
prevenzione di tumori, specie quelli intestinali);
d) si associa mediamente a una massa corporea inferiore valutata come indice di massa
corporea o BMI (body mass index): i non-taster consumano una maggiore varietà di cibi e
sono associati ad un maggior peso corporeo. E’ stata trovata una forte associazione tra lo stato
di non taster e una maggiore adiposità nelle donne.
e) comporta un numero percentualmente inferiore di carie.
Per capire meglio l’influenza dei geni su malattie complesse, come l’obesità, sono state
studiate popolazioni isolate geneticamente e geograficamente
Geographical distribution of PTC allele frequencies (modified from Cavalli-Sforza et al. 1994).
IL GUSTO
Il gusto è uno dei cinque sensi i cui recettori sono costituiti dai calici gustativi presenti nelle
papille gustative della lingua, nel palato molle, nella faringe, nelle guance e nell' epiglottide. Il
gusto dipende dalla percezione sinergica di cinque gusti fondamentali:amaro,aspro,dolce,salato
e umami.
Lo spazio gustativo è continuo. I profili di risposta dei diversi stimoli dolci possono essere
estremamente diversi gli uni dagli altri, e lo stesso vale per gli stimoli amari. Anche gli stimoli
amari sono molto diversi gli uni dagli altri. Oltre agli stimoli dolce e amaro, nello spazio
gustativo sono situati altri stimoli di qualità non definita, in diverse direzioni dello spazio. Lo
spazio gustativo è pluridimensionale.
Nei mammiferi la percezione gustativa si realizza attraverso le gemme gustative, unità
morfologiche e funzionali specializzate, che sono localizzate in tutto l’epitelio orale, sulla
lingua, sul palato e sulla faringe. Le gemme gustative, a seconda delle specie, contengono
aggregazioni di 50–150 cellule, includendo cellule precursori, cellule di supporto e cellule
recettrici del gusto.
Sulla lingua, le gemme gustative sono localizzate su specifiche protrusioni, le papille, che
vengono generalmente classificate in tre tipi morfologici con proprietà funzionali distinte. Si
riconoscono papille circumvallate, fungiformi e foliate. Le papille circumvallate si trovano nella
zona posteriore della lingua, in un numero di circa 1000 nell’uomo e sono particolarmente
sensibili alle sostanze amare. Le papille foliate sono localizzate nella porzione latero-posteriore
della lingua, contengono da dozzine a centinaia di gemme gustative e sono sensibili al salato e
all’amaro. Le papille fungiformi contengono una singola o poche gemme gustative, sono
localizzate nella porzione anteriore della lingua sembrano mediare la percezione di composti
dolci.
23
Nel diagramma sono evidenziate le regioni specializzate per definiti stimoli gustativi (amaro,
aspro, dolce e salato). Si nota che mentre differenti aree della lingua presentano forti
preferenze per specifiche modalità gustative, esiste anche una significativa sovrapposizione tra
le varie regioni. I tre tipi di papille gustative sono mostrate ingrandite e ne è mostrata la
localizzazione nelle rispettive regioni .
Le cellule deputate al riconoscimento di stimoli gustativi sono cellule epiteliali modificate
connesse al cavo orale attraverso un sottile processo simile ad un dendrite. Le cellule recettrici
del gusto presentano proprietà eccitatorie e sono attivate da stimoli gustativi. Un’apertura alla
superficie dell’epitelio, il poro gustativo permette l’accesso degli stimoli chimici ai recettori
localizzati sui microvilli apicali delle cellule gustative. Il recettore, attivato in seguito alla
stimolazione, genera una cascata trasduzionale che culmina nel rilascio di neurotrasmettitori al
livello delle sinapsi con le fibre nervose (nervi facciale, vago e glossofaringeo) alla base delle
gemme gustative. Le fibre nervose eccitate conducono lo stimolo, via talamo, ai centri corticali
del gusto, dove l’informazione è integrata e processata. Questo processo è ancora in larga
parte sconosciuto.
I recettori presentano un corto dominio amino-terminale extracellulare e sequenze
conservate in alcuni domini transmembrana. La percezione di ognuno dei sapori
fondamentali è associata ad una particolare via di trasduzione del segnale che
schematicamente può essere riportata a due tipologie principali: recettori legati a
proteine G per l’amaro,il dolce e umami, o attraverso canali ionici di membrana per
aspro e salato. Dalla stimolazione della cellula si ottiene un potenziale di recettore che
stimola l'ingresso di ioni Calcio nella cellula determinando la liberazione di
neurotrasmettitori a livello basale e la genesi di un potenziale d'azione nelle fibre
afferenti.
Il gusto amaro viene trasdotto secondo almeno tre vie possibili. Nella prima, sostanze
come la chinina determinano blocco dei canali apicali del potassio. Un secondo
meccanismo sembra essere legato ad un particolare proteina G,la quale attiva una
fosfodiesterasi che fa diminuire le concentrazioni intracellulari di cAMP e cGMP. Il terzo
consiste sempre nell'attivazione di una proteina G la quale attiva una fosfolipasi C che
fa aumentare la concentrazione di IP3 che determina liberazione di ioni calcio dai
depositi intracellulari depolarizzando la cellula.
24
GENETICA DEL GUSTO AMARO
Questa diversa capacità percettiva è un tipico carattere genetico ereditario ed è dovuta a un
gene chiamato TAS2R38, responsabile della produzione di recettori gustativi per l’amaro. Uno
studio pubblicato da un gruppo di ricercatori dell’Istituto di Biologia Evolutiva di Barcellona
dimostra come anche l’uomo di Neanderthal, 48.000 anni fa, fosse in grado di percepire il
gusto amaro dei cibi che ingeriva, proprio come l’uomo moderno. Lo studio genetico condotto
dal gruppo del dottor Carles Lalueza-Fox dell’Istituto di Biologia Evolutiva di Barcellona ha
analizzato il gene TAS2R38 in un campione di osso prelevato da un uomo di Neanderthal
rinvenuto nel 2000 a El Sidron, nel nord della Spagna. I ricercatori hanno estratto il DNA dal
fossile d’osso e hanno ottenuto la sequenza del gene specifico per il recettore delle sostanze
amare e hanno scoperto che anche 48.000 anni fa, i nostri antenati erano in grado di percepire
il gusto amaro dei cibi. Il dato rilevante è che nella loro popolazione, come oggi nella nostra,
esistevano due gruppi di persone: quelle capaci di percepire l’amaro e quelli insensibili a
questa sostanza.
La ricerca, pubblicata su Biology Letters, dimostra la vicinanza genetica tra l’Homo Sapiens e
l’Homo Neanderthalensis, che condividono un gene ereditato da un comune antenato, vissuto
più di 300.000 anni fa.
Hypotheses for the origin of PTC taster and nontaster alleles. (Left) Fisher et al.’s (1939)
‘‘Single Origin’’ hypothesis. Under this hypothesis, the taster (T) and nontaster (t) alleles diverged
prior to the human–chimpanzee species divergence. Then both alleles were maintained separately in
each species up to the present time. The maintenance of both alleles for such an extended period [Fisher
(1939b) thought that it must be 1 million generations, or 20–30 million years] is unlikely if balancing
selection has not been active because one allele or the other would be expected to go to fixation. (Right)
Wooding et al.’s (2006)
‘‘Separate Origin’’ hypothesis.Under this hypothesis, nontaster alleles were derived from taster alleles
twice—once in each species—after the human–chimpanzee species divergence.
(Arrows indicate divergence events)
L’abilità di percepire le sostanze amare rappresenta quindi una difesa contro le tossine vegetali
e i veleni spesso contenuti in piante dal sapore amaro.
I risultati di questo studio aprono però anche altre prospettive. La presenza di individui
portatori del gene che li rende insensibili all’amaro, anche dopo 48.000 anni di evoluzione,
suggerisce il fatto che questo tratto genetico si sia conservato per un vantaggio dei portatori.
Questi individui potrebbero essere in grado di percepire la presenza di sostanze ancora
sconosciute e inoltre la capacità di mangiare anche cibi amari sembra essere importante, viste
le proprietà medicinali di alcuni cibi amari. Il TAS2R38 non è l’unico recettore per l’amaro.Il
fatto che oggi circa il 30% della popolazione non percepisce l’amaro se stimolato dal PTC
(Phenylthiocarbamide, una sostanza utilizzata per eseguire il test del gusto e discriminare tra
individui capaci o incapaci di percepire l’amaro) significa che evolutivamente c’è stato qualche
svantaggio, altrimenti ci sarebbe un equilibrio al 50% tra taster e non taster. Questa
situazione però potrebbe essere stata almeno in parte controbilanciata per far sì che i non
taster siano ancora presenti nella popolazione.
Tre diversi recettori sono stati sinora identificati per il gusto dolce, chiamato dolce-umami
(T1Rs), e almeno 30 per l’amaro (T2Rs). Diversi altri recettori, molecole e vie di trasmissione
del segnale che fornisce poi la percezione del gusto devono ancora essere identificati. Diversi
composti presenti nei cibi come amminoacidi, peptidi, esteri e lattoni, fenoli e polifenoli,
flavonoidi e terpeni, metilxantine (caffeina), sulfimidi (saccarina) ecc. stimolano la percezione
dell’amaro.
25
I recettori dell’amaro: la famiglia TAS2R
La famiglia GPCR dei geni codificanti chemiorecettori di composti amari, TAS2R, è stata
inizialmente individuata mediante un approccio combinato bioinformatico e di analisi genetica
(Adler et al., 2000). Alcuni dei geni, identificati mediante analisi di banche dati genomiche
murine e umane, mappavano all’interno di loci associati con varie sensibilità a composti amari.
Queste evidenze suggerivano che i geni codificanti recettori GPCR, appartenenti alla famiglia
TAS2R, rappresentassero i recettori del gusto amaro.
Allo stato attuale la famiglia genica TAS2R comprende 25 membri potenzialmente funzionali
nell’uomo. Le proteine TAS2R all’interno della stessa specie mostrano dal 23% all’80% di
identità.
Nel genoma umano i geni codificanti queste proteine risiedono in tre regioni:
- 15 geni sono raggruppati sul cromosoma 12p
- 9 sul cromosoma 7q
- 1 sul cromosoma 5p
Questi geni contengono tutti un singolo esone codificante un recettore a serpentina della
lunghezza media di 330 aminoacidi.
GENE ORIGIN 1-.1143 = EXON total length: 1143
1 cctttctgca ctgggtggca accaggtctt tagattagcc aactagagaa gagaagtaga
61 atagccaatt agagaagtga catcatgttg actctaactc gcatccgcac tgtgtcctat
121 gaagtcagga gtacatttct gttcatttca gtcctggagt ttgcagtggg gtttctgacc
181 aatgccttcg ttttcttggt gaatttttgg gatgtagtga agaggcaggc actgagcaac
241 agtgattgtg tgctgctgtg tctcagcatc agccggcttt tcctgcatgg actgctgttc
301 ctgagtgcta tccagcttac ccacttccag aagttgagtg aaccactgaa ccacagctac
361 caagccatca tcatgctatg gatgattgca aaccaagcca acctctggct tgctgcctgc
421 ctcagcctgc tttactgctc caagctcatc cgtttctctc acaccttcct gatctgcttg
481 gcaagctggg tctccaggaa gatctcccag atgctcctgg gtattattct ttgctcctgc
541 atctgcactg tcctctgtgt ttggtgcttt tttagcagac ctcacttcac agtcacaact
601 gtgctattca tgaataacaa tacaaggctc aactggcaga ttaaagatct caatttattt
661 tattcctttc tcttctgcta tctgtggtct gtgcctcctt tcctattgtt tctggtttct
721 tctgggatgc tgactgtctc cctgggaagg cacatgagga caatgaaggt ctataccaga
781 aactctcgtg accccagcct ggaggcccac attaaagccc tcaagtctct tgtctccttt
841 ttctgcttct ttgtgatatc atcctgtgtt gccttcatct ctgtgcccct actgattctg
901 tggcgcgaca aaataggggt gatggtttgt gttgggataa tggcagcttg tccctctggg
961 catgcagcca tcctgatctc aggcaatgcc aagttgagga gagctgtgat gaccattctg
1021 ctctgggctc agagcagcct gaaggtaaga gccgaccaca aggcagattc ccggacactg
1081 tgctgagaat ggacatgaaa tgagctcttc attaatacgc ctgtgagtct tcataaatat
1141 gcc
26
CDS ORIGIN total length: 1,002
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
atgttgactc taactcgcat ccgcactgtg tcctatgaag tcaggagtac atttctgttc
atttcagtcc tggagtttgc agtggggttt ctgaccaatg ccttcgtttt cttggtgaat
ttttgggatg tagtgaagag gcaggcactg agcaacagtg attgtgtgct gctgtgtctc
agcatcagcc ggcttttcct gcatggactg ctgttcctga gtgctatcca gcttacccac
ttccagaagt tgagtgaacc actgaaccac agctaccaag ccatcatcat gctatggatg
attgcaaacc aagccaacct ctggcttgct gcctgcctca gcctgcttta ctgctccaag
ctcatccgtt tctctcacac cttcctgatc tgcttggcaa gctgggtctc caggaagatc
tcccagatgc tcctgggtat tattctttgc tcctgcatct gcactgtcct ctgtgtttgg
tgctttttta gcagacctca cttcacagtc acaactgtgc tattcatgaa taacaatac
aggctcaact ggcagattaa agatctcaat ttattttatt cctttctctt ctgctatct
tggtctgtgc ctcctttcct attgtttctg gtttcttctg ggatgctgac tgtctccctg
ggaaggcaca tgaggacaat gaaggtctat accagaaact ctcgtgaccc cagcctggag
gcccacatta aagccctcaa gtctcttgtc tcctttttct gcttctttgt gatatcatcc
tgtgttgcct tcatctctgt gcccctactg attctgtggc gcgacaaaat aggggtgatg
gtttgtgttg ggataatggc agcttgtccc tctgggcatg cagccatcct gatctcaggc
aatgccaagt tgaggagagc tgtgatgacc attctgctct gggctcagag cagcctgaa
gtaagagccg accacaaggc agattcccgg acactgtgct ga
Protein product length: 333
translation "MLTLTRIRTVSYEVRSTFLFISVLEFAVGFLTNAFVFLVNFWDV
VKRQALSNSDCVLLCLSISRLFLHGLLFLSAIQLTHFQKLSEPLNHSYQAIIMLWMIA
NQANLWLAACLSLLYCSKLIRFSHTFLICLASWVSRKISQMLLGIILCSCICTVLCVW
CFFSRPHFTVTTVLFMNNNTRLNWQIKDLNLFYSFLFCYLWSVPPFLLFLVSSGMLTV
SLGRHMRTMKVYTRNSRDPSLEAHIKALKSLVSFFCFFVISSCVAFISVPLLILWRDK
IGVMVCVGIMAACPSGHAAILISGNAKLRRAVMTILLWAQSSLKVRADHKADSRTLC"
Studi di espressione, analisi di sistemi di espressione funzionale, studi di relazione tra attività e
struttura, studi in vitro, hanno rafforzato l’ipotesi che la famiglia TAS2R codifichi per i recettori
del gusto amaro.
La capacità di legare uno più agonisti per ogni recettore sembra essere dipendente non solo da
un dato gene della famiglia TAS2R, ma anche dalla variazione allelica del gene stesso.
Uno stesso recettore è attivato da composti simili. Esempio:
- cellule che esprimono il recettore TAS2R16 rispondono alla salicina e β-glucosidi correlati
- il recettore T2RT10 esibisce attivazione in risposta alla stricnina.
- il recettore TAS2R38 (Kim et al., 2003) è attivato da pheniltiocarbamide e da molti altri
composti contenenti il gruppo –N=C=S, inclusa la propiltiourea.
II TAS2R38 è il più studiato di questi geni, ha come ligando preferenziale la PTC e il PROP.
Tre SNPs sono responsabili di tre sostituzioni aminoacidiche nella proteina nelle posizioni:
• A49P (rs713598)
• A262V (rs1726866)
• V296I (rs10246939)
Il 2° e il 3° SNP sono in perfetto linkage disequilibrium
Queste varianti danno origine ai PAV (taster ) e ai AVI (non taster).
Gli individui PROP-sensibili possiedono uno o due alleli dominanti (PAV/PAV o PAV/AVI),
mentre i non sensibili sono recessivi per questo carattere (AVI/AVI).
Avremo quindi tre genotipi:
- PAV/PAV super-taster con alta sensibilità per l’amaro
- PAV/AVI medium taster con moderata sensibilità per PTC/PROP
- AVI/AVI non taster non percepiscono l’amaro
Nella popolazione bianca-la più studiata- la distribuzione dei tre fenotipi è di circa: 30% Nontaster AVI/AVI, 45% Medium-taster AVI/PAV, 25% supertaster PAV/PAV.
Alti livelli di variazioni alleliche sono state trovate all’interno dei loci TAS2R nelle popolazioni
umane. Questa variabilità correla con l’enorme variabilità nella percezione di composti amari
riscontrata nell’uomo. Le diversità nei geni TAS2R potrebbero essere dovuti alla selezione
naturale, che può aver favorito alleli maggiormente responsivi a tossine naturali amare
prodotte dalle piante.
27
Polimorfismo rs 1726866 o A262V
Abbiamo detto che tre SNPs del gene TAS2R38 determinano tre sostituzioni aminoacidiche
nelle posizioni P49A,A262V e V296I.
Il secondo e il terzo sono in perfetto linkage disequilibrium, quindi gli alleli segregano insieme.
Noi studieremo il secondo e terzo.
1
1.c
1 tttctgca ctgggtggca accaggtctt tagattagcc aactagagaa gagaagtaga
61 atagccaatt agagaagtga catcatgttg actctaactc gcatccgcac tgtgtcctat
121 gaagtcagga gtacatttct gttcatttca gtcctggagt ttgcagtggg gtttctgacc
181 aatgccttcg ttttcttggt gaatttttgg gatgtagtga agaggcaggc actgagcaac rs713598 C/G
241 agtgattgtg tgctgctgtg tctcagcatc agccggcttt tcctgcatgg actgctgttc
301 ctgagtgcta tccagcttac ccacttccag aagttgagtg aaccactgaa ccacagctac
361 caagccatca tcatgctatg gatgattgca aaccaagcca acctctggct tgctgcctgc
421 ctcagcctgc tttactgctc caagctcatc cgtttctctc acaccttcct gatctgcttg
481 gcaagctggg tctccaggaa gatctcccag atgctcctgg gtattattct ttgctcctgc
541 atctgcactg tcctctgtgt ttggtgcttt tttagcagac ctcacttcac agtcacaact
601 gtgctattca tgaataacaa tacaaggctc aactggcaga ttaaagatct caatttattt
661 tattcctttc tcttctgcta tctgtggtct gtgcctcctt tcctattgtt tctggtttct
721 tctgggatgc tgactgtctc cctgggaagg cacatgagga caatgaaggt ctataccaga
781 aactctcgtg accccagcct ggaggcccac attaaagccc tcaagtctct tgtctccttt
841 ttctgcttct ttgtgatatc atcctgtgtt gccttcatct ctgtgc ccct actgattctg rs1726866 C/T
901 tggcgcgaca aaataggggt gatggtttgt gttgggataa tggcagcttg tccctctggg
961 catgcagcca acctgatctc aggcaatgcc aagttgagga gagctgtgat gaccattctg rs10246939 A/G
1021 ctctgggctc agagcagcct gaaggtaaga gccgaccaca aggcagattc ccggacactg
1081 tgctgagaat ggacatgaaa tgagctcttc attaatacgc ctgtgagtct tcataaatat
1141 gcc
Fasta sequence (Legend)
TTTTTAGCAG ACCTCACTTC ACAGTCACAA CTGTGCTATT CATGAATAAC AATACAAGGC
TCAACTGGCA GATTAAAGAT CTCAATTTAT TTTATTCCTT TCTCTTCTGC TATCTGTGGT
CTGTGCCTCC TTTCCTATTG TTTCTGGTTT CTTCTGGGAT GCTGACTGTC TCCCTGGGAA
GGCACATGAG GACAATGAAG GTCTATACCA GAAACTCTCG TGACCCCAGC CTGGAGGCCC
ACATTAAAGC CCTCAAGTCT CTTGTCTCCT TTTTCTGCTT CTTTGTGATA TCATCCTGTG
Y
TGCCTTCATC TCTGTGCCCC TACTGATTCT GTGGCGCGAC AAAATAGGGG TGATGGTTTG
TGTTGGGATA ATGGCAGCTT GTCCCTCTGG GCATGCAGCC ATCCTGATCT CAGGCAATGC
CAAGTTGAGG AGAGCTGTGA TGACCATTCT GCTCTGGGCT CAGAGCAGCC TGAAGGTAAG
AGCCGACCAC AAGGCAGATT CCCGGACACT GTGCTGAGAA TGGACATGAA ATGAGCTCTT
CATTAATACG CCTGTGAGTC TTCATAAATA TGCCTCTGAT TCTTCAGGAA TACAACTCTG
Nessuno dei tre polimorfismi è sede di un sito di restrizione; pertanto non si può procedere con
la digestione mediante enzimi di restrizione.
Ci sono due possibilità per identificare la posizione dello SNP:
1. fare una PCR allele-specifica
2. fare il sequenziamento
28
LABORATORIO
STEP 1 : ESTRAZIONE DI DNA DA CELLULE DI MUCOSA BUCCALE
1. Prelievo di cellule con brush
2. Lisi cellulare . Mettere nella provetta :
- 400 µl. di Lysis Solution T
- 20 µl di Proteinasi K.
Inserire il brush nella provetta e agitare un po’. Buttare il brush. Vortexare per 10 sec.
Incubare a 70°C per 40 min.in un Termo-shaker.
Centrifugare 30” a 10.000 xg.
3.Loading and binding
Aggiungere 200 µl di Binding Buffer. Pipettare bene per mescolare.
Inserire una colonnina in una nuova provetta da 2 ml
Trasferire tutta la soluzione lisata all’interno della colonnina
Centrifugare 2 min a 10.000 x g
Buttare il liquido e conservare la colonnina.
Centrifugare altri 2’ a 10.000 x g per avere la certezza che tutta la soluzione sia passata
Al termine buttare la provetta e conservare la colonnina
5. 1°Lavaggio
Aggiungere 650 µl di Wash Buffer(soluzione di Buffer concentrato +Etanolo assol.) alla colonnina.
Centrifugare 1 min. a 10.000 x g. Buttare il liquido e tenere la provetta con la colonna
6. 2°Lavaggio
Aggiungere 650 µl di Wash Buffer.
Centrifugare 1 min. a 10.000 x g . Buttare via la provetta e conservare la colonnina.
Mettere la colonnina in una nuova provetta.
Centrifugare 2 min. a 10.000 x g per asciugare completamente la colonna
7. Eluizione
Mettere la colonnina in una nuova provetta da 1,5 ml.
Centrifugare 2’ a 10.000 x g per asciugare completamente la colonnina
Aggiungere 200 µl di Elution Buffer direttamente sulla membrana della colonnina.
(Il Buffer va pre-riscaldato a 70°C prima dell’uso )
Incubare 3 min.a T ambiente.
Centrifugare 1 min. a 6.000 x g
N.B. Se necessario ripetere l’eluizione con altri 100-200 µl di Elution Buffer
STEP 2. PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO
- Sciogliere l’Agarosio ( in quantità stabilita dalla %) nella beuta con la soluzione tampone TAE.
- Far bollire la soluzione nel microonde agitando di tanto in tanto fino a quando questa non
diventa trasparente.
- Quando la soluzione è tiepida, ma non ancora gelificata, aggiungere l’intercalante del DNA,
GelRed, 3 µL.
- Preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di nastro adesivo e inserire il pettine.
- Versare la soluzione di Agarosio nella vaschetta per elettroforesi e lasciare polimerizzare
(solidificare).
- Togliere il pettine quando il gel sarà solidificato.
- Versare il tampone TAE nella camera di corsa
STEP 3. CHECK DNA con gel di Agarosio allo 0.8%
La presenza di DNA viene valutata con un check prelevando 10 µl di DNA.
- Prelevare 2 µL colorante e disporlo su carta formando una goccia
- Mescolare con la pipetta il DNA e il colorante
- Si trasferisce il prelievo in un pozzetto del gel, facendo attenzione a non bucare il fondo del
pozzetto e a non far uscire il campione fuori dal pozzetto.
- Chiudere e attaccare gli elettrodi all’alimentatore. Far correre per 10- 20’.
- Osservare al transilluminatore
29
STEP 4. 1°PCR
Lavorare in
ghiaccio !
MIX per 25 µL di PCR:
Buffer
2.5 µL
dnTP
0.5 µL
Foward
0.5 µL
Reverse
0.5 µL
MgCl2
0.75. µL
TAQ
0.12 µL
H2O
18.13 µL
DNA
2 ul (25 ng totali)
Ciclo PCR
94°C x 5’
(94°C 30”, 60°C 30”,
72°C 30”) x 35
72°C 8 ‘
94°C 5’
Durata: 2h.30’ circa
STEP 5. CHECK PCR con gel di Agarosio al 2%
10 µL di PCR e 2 µL di colorante.
In un pozzetto si mettono 2µL. di marker di 100 pb.
Al termine della corsa,/ circa 20 min) si prende il gel e lo si osserva al transilluminatore
STEP 6. I frammenti di PCR verranno sequenziati presso un Laboratorio di Genetica.
STEP 7. Valutazioni sui risultati.
Bitter Taste Sensitivity
Gli studenti non devono mangiare, fumare e bere solo acqua da almeno un’ora prima del test.
Campioni di soluzioni da assaggiare in ordine:
•
•
•
•
•
Nescafe Instant coffee 1 e 2
acqua
Acqua Tonica Schweppes
acqua
Succo di pompelmo
1. Nescafè: 1,8 g.di Nescafè contengono 0,057 g. di caffeina. Prepariamo due soluzioni di
Nescafè:
a.
1,8 g. di Nescafè in 100 ml di soluzione ( Sol. ∼ 0,003 M) (N1)
b. 3,6 g di Nescafè in 100 ml. di soluzione (Sol. ∼ 0,006 M) (N2)
La soluzione riportata in letteratura è 0,05 M => 9,75 g/L (PM 195) => 307 g./L. TROPPO
CONCENTRATA!!!)
2. Succo di Pompelmo: La soluzione di Naringina deve essere almeno 1,8x10-4 M
(0,0008 M). Il succo di pompelmo commerciale contiene 0,5 g/L di Naringina. La soluzione
sarà 0,0008 M (PM 580,541), quindi più amara del necessario.
3. Acqua Tonica Schweppes/Seven up : La soluzione di Chinina deve essere almeno di
1,8 x10-4 per apprezzare l’amaro. La bibita contiene 0,25-0,5% di Chinina.
Procedura:
1. tenere in bocca la soluzione per 5 sec.
2. valutare l’intensità percepita
3. sciacquare la bocca con l’acqua 3-4 volte.
4. ripetere con ogni soluzione gli steps 1-2-3
30
Labeleled Magnitude Scale
Sul foglio del punteggio si da un voto all’intensità percepita segnando un trattino con una
matita nella Labeled Magnitude Scale (LMS) ai valori di:
no sensation, barely detectable, weak, moderate, strong, verry strong, strongest
imaginable, posizionate rispettivamente a: 0,2,7,20,40,61,114 mm.
Questa scala minimizza l’effetto soglia e fornisce una misura continua, desiderabile quando
si fa un’analisi quantitativa.
100
- Strongest imaginable
Y = Perceived intensity (mm)
X = Concentrazione
80 -
60 -- Very strong
40 - Strong -
20 - Moderate
- Weak
- Barely detectable
0
Nel fenotipo A262V :
all’allele C (wt) è associato A (Alanina) ; all’allele T (variante) è associata V (Valina)
CC e CT
TASTER
= percepiscono l’amaro.
TT
NON TASTER = non percepiscono l’amaro
31
Se consideriamo insieme i due SNPs A262V(C/T)
avremo gli aplotipi:
AV/AV, AV/AI
AI/AI
e I296V(AG) in linkage disequilibrium
TASTER
NON TASTER
TABELLA FENOTIPO/GENOTIPO
FENOTIPO
MASCHI (N.
)
FEMMINE (N. )
TOTALE (N )
NON TASTER
MEDIUM TASTER
TASTER
TAS2R38
CC
CT
TT
32
BIBLIOGRAFIA
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5. Bernd Bufe, Paul A.S. Breslin, Christina Kuhn, Danielle R. Reed, Christopher D. Tharp, Jay P.
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human height
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Bitter-taste Receptor Gene TAS2R38, and Adiposity in a Genetically Isolated Population in
Southern Italy
7. J. Tepper,a Elizabeth A. White,a Yvonne Koelliker, Carmela Lanzara,Pio d’Adamo, and Paolo
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Taste Perception and Food Selection Beverly
8. Stephen Wooding.Anecdotal, Historical and Critical Commentaries on Genetics.
Phenylthiocarbamide: A 75-Year Adventure in Genetics and Natural Selection.Genetics,2009
33
Guida per lo studente
1. Background di Conoscenze su alcuni argomenti di
Genetica
Le malattie ereditarie monogeniche sono determinate da mutazioni in singoli geni che si
trasmettono nelle famiglie secondo leggi ben definite scoperte dall’abate G. Mendel nella
seconda metà dell’Ottocento. Per questo motivo le malattie monogeniche monofattoriali
vengono anche chiamate“mendeliane”. In particolare bisogna ricordare che:
I geni possono avere alleli diversi (varianti alternative di uno stesso gene) ossia
essere polimorfici;
Gli organismi diploidi hanno due copie di ogni gene, cioè due alleli. Se i due alleli sono
uguali, l’individuo è omozigote (ad es, ha genotipo AA oppure aa). Se i due alleli sono diversi,
l’individuo è eterozigote (ad es, il genotipo è Aa)
La I legge di Mendel o legge dell’uniformità della prima generazione ibrida, afferma che
l’incrocio tra individui della generazione parentale ciascuno omozigote per due alleli diversi di
uno stesso gene (ad es, AA x aa) e che quindi differisce dall’altro genitore per una
caratteristica (ad es, pelo nero o marrone), dà una progenie costituita da individui tutti identici
tra loro (tutti eterozigoti; ad es, Aa);
Durante la meiosi i due alleli di un gene segregano e si distribuiscono ciascuno in un gamete
apolide (II legge di Mendel, legge della segregazione).
Un individuo omozigote produce un solo tipo di gamete (A oppure a) relativamente a un dato
locus (la posizione occupata da un gene in un cromosoma).
Un individuo eterozigote produce due tipi di gameti (A e a) in ugual quantità, cioè in
rapporto 50% ciascuno. Una buona rappresentazione grafica della segregazione si ottiene
costruendo il “quadrato di Punnett”.
Alleli appartenenti a geni diversi localizzati su cromosomi diversi segregano in modo
indipendente (III legge di Mendel, legge della segregazione indipendente).
Allele dominante: allele che si manifesta allo stato eterozigote;
Allele recessivo: allele mascherato dall’allele dominante, che si manifesta solo allo stato
omozigote;
Allele codominante: due alleli entrambi espressi allo stato eterozigote, che agiscono sul
fenotipo in modi indipendenti e distinguibili. Un esempio classico si ha nel caso degli alleli IA e
IB del gruppo sanguigno ABO.
L’1% circa dei neonati è affetto da una malattia genetica monogenica. La mutazione
genica è presente fin dal concepimento, quindi anche alla nascita, anche se non sempre si
manifesta fenotipicamente alla nascita. Alcune di queste malattie comportano conseguenze già
apprezzabili nel neonato. Altre malattie monogeniche si manifestano, invece, durante le età
successive della vita. La corea di Huntington, ad esempio, è una malattia genetica a
insorgenza tardiva che si manifesta solo in età adulta.
Si definisce malattia autosomica quella in cui l’allele malato è presente nelle coppie di
cromosomi non coinvolti nella determinazione del sesso, gli autosomi;
si parla invece di malattia legata all’X quella in cui l’allele si trova nel cromosoma
sessuale X. In questo caso la trasmissione segue modalità particolari in quanto la maggior
parte dei geni rappresentati sul cromosoma X non sono rappresentati sul cromosoma Y. Il
cromosoma Y, infatti, è molto più piccolo e contiene quasi esclusivamente i geni per la
determinazione del sesso. Per schematizzare:
malattie autosomiche: se l’allele normale è dominante, la malattia si rende
manifesta solo nella condizione omozigote recessiva, ossia negli individui in cui entrambi gli
alleli del gene sono alterati (malattia autosomica recessiva); se invece è l’allele alterato a
prevalere su quello sano, la malattia si rende sempre evidente, anche nella condizione
eterozigote, ossia è sufficiente che uno solo dei due alleli sia alterato per avere la malattia
(malattia autosomica dominante)
malattie legate all’X: se l’allele è recessivo,come nella maggior parte dei casi, i
maschi ricevono l’X difettoso dalla madre, ma non possono bilanciarlo con un allele sano nell’Y
in quanto questo cromosoma non contiene l’allele corrispondente; le femmine invece
manifestano la malattia solo nelle condizione omozigote. Di conseguenza, la frequenza delle
malattie recessive legate al cromosoma X è maggiore nei maschi che nelle femmine. Nel
caso di malattie dominanti le femmine manifestano la malattia anche nella condizione
eterozigote
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2. GLOSSARIO
Allele. è una delle possibili forme o varianti in cui si puo' presentare un gene, con
conseguenze sulle caratteristiche espresse. Per ogni gene (ad un determinato locus sul
cromosoma) esistono due alleli, ereditati dal padre e della madre. Quando i due alleli sono
uguali, l'individuo è definito omozigote per quel specifico tratto; se gli alleli sono diversi,
l'individuo è definito eterozigote.
Annealing (appaiamento) formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla
complementarietà delle basi.
Elettroforesi tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente, mediante la
migrazione in un campo elettrico.
Enzima proteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di una via metabolica
in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quanto riconosce il substrato su cui agire.
Enzimi di restrizione chiamati anche endonucleasi di restrizione o “forbici” molecolari : sono
enzimi che tagliano il DNA a doppia elica (e non quello a singolo filamento!) in corrispondenza
di specifiche sequenze nucleotidiche, dette siti di restrizione
Fenotipo insieme delle caratteristiche visibili di un organismo, che risultano dall’interazione
tra genotipo e ambiente.
Frammenti di restrizione frammenti provenienti da una molecola di DNA più lunga per
digestione con enzimi di restrizione
Gene unità ereditaria funzionale corrispondente generalmente al segmento di DNA che codifica
una proteina.
Genoma patrimonio genetico di una cellula o di un organismo.
Genotipo costituzione genetica di un organismo
Linkage Equilibrium indica una combinazione casuale di alleli a loci associati
Linkage disequilibrium indica una combinazione non casuale di alleli a loci associati
Isoforma Un tempo si riteneva che ogni gene codificasse per un unico prodotto polipeptidico o
molecola di RNA, mentre oggi si sa che la maggioranza di geni umani specifica 2 o più forme
alternative di proteine
Locus ( plurale loci) posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel liguaggio
comune il termine viene spesso usato come sinonimo di gene
Marcatore genetico qualsiasi differenza fenotipica, controllata geneticamente, utilizzata
nell’analisi genetica
Oligonucleotide corta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento, costituita da poche
decine di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti di ibridazione molecolare e
nella PCR
PCR (polymerase chain reaction) tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in
breve tempo segmenti specifici di DNA
Polimorfismo esistenza di forme diverse di: alleli (polimorfismo allelico), proteine
(polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA). ciascuno dei quali con una frequenza di
almeno 1%.
Polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)
Restriction Fragment Length Polymorphism (lunghezza variabile dei frammenti di restrizione).
Polimorfismo del DNA, che si evidenzia trattando cromosomi omologhi con enzimi di
restrizione. Determinato da una differenza di una base tra due DNA omologhi, differenza che
causa la presenza o assenza di un sito di restrizione per uno specifico enzima di restrizione, e
quindi frammenti di diversa lunghezza dopo trattamento con quell’enzima.
Primer corta catena polinucleotidica, a DNA o RNA, alla quale vengono aggiunti nuovi
nucleotidi nel corso della sintesi di DNA. Noto anche con il termine di innesco. Nella PCR si
utilizza una coppia di primer
Promotore regione del DNA a cui si lega la RNA-polimerasi per avviare la trascrizione del
gene(cioè la sintesi dell'RNA-messaggero). Funziona come un "interruttore molecolare" che
"accende" o "spegne" il gene. regioni di controllo sequenze del DNA che attivano e regolano
l'espressione di un gene. La loro presenza è pertanto necessaria per la corretta e efficace
espressione del gene.
RNA-messaggero (mRNA) copia a singolo filamento della sequenza nucleotidica di un gene,
che trasporta ai ribosomi l'informazione per la sintesi (traduzione) della proteina
corrispondente
Splicing del RNA processo in cui le sequenze introniche sono eliminate dai trascritti primari di
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RNA nel nucleo durante la trascrizione, per dar luogo alla produzione di molecole di
mRNAmaturo.
Splicing alternativo assemblaggio differenziale di esoni durante la maturazione dell’RNA.
Si stima che più del 60% dei geni umani produca 2 o più proteine mediante questo
meccanismo. Molti esoni specificano domini proteici strutturali distinti che possono essere
combinati in modo diverso nelle cellule dei diversi tessuti nei quali il gene è espresso..si
ottengono così isoforme tessuto-specifiche
Sequenze palindromiche sequenza nucleotidica che è identica al suo filamento
complementare quando entrambi vengono letti nella stessa direzione chimica (es 5'-->3').
Esempio GATC
Siti di restrizione sequenza di basi ben determinata riconosciuta e tagliata dagli enzimi di
restrizione in modo da lasciare corte sequenze a singola elica, dette estremità coesive
poiché le loro basi sono complementari.
3. PRE-TEST
4. POST-TEST
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