progetto di ricerca Katia Grillone e Duarte Mendes Oliveira

Università Magna Graecia di Catanzaro
Progetto I love Research
CONSUMO DI CARNE E TUMORI: ANALISI DI POLIMORFISMI
GENETICI POTENZIALMENTE PREDISPONENTI
ALL’ INSORGENZA DEL CANCRO COLON-RETTALE
NELLA POPOLAZIONE CALABRESE.
CHE IMPATTO HA LA GENETICA SUL RISCHIO
IN CALABRIA?
Tutor:
Katia Grillone
Duarte Mendes Oliveira
Studenti:
Alessandra Valentino
Carmelo Tomas
Elena Vatrano
Francesca Conte
Francesco Chiaravalloti
RIASSUNTO DEL PROGETTO
La letteratura scientifica riporta diversi studi in cui si è individuata
una correlazione diretta tra l’ insorgenza di cancro colon rettale
(CCR) l’ assunzione di carne e il patrimonio genetico di varie
popolazioni. Il nostro progetto si focalizza sulla ricerca di
polimorfismi caratteristici della popolazione Italiana, a partire da
quella Calabrese sfruttando tecniche di sequenziamento di ultima
generazione che permettano di identificare eventuali alterazioni a
carico di geni quali CYP2E1, CYP1B1, NAT2, GSTM1, GSTT1,
ADIPOQ, SULT1A1, ODC1 potenzialmente predisponenti allo
sviluppo di cancro del colon. Seguirà la validazione funzionale
delle alterazioni individuate, qualora non descritte in letteratura, e
uno studio di correlazione tra i polimorfismi identificati, il
consumo di diversi tipi di carne (rossa trattata e/o nostrana, o
bianca) e l’ insorgenza di CCR in Calabria per stabilire se la
popolazione calabrese è più o meno predisposta geneticamente a
sviluppare CCR e di conseguenza per porre le basi per un sistema
di prevenzione basato sullo screening genetico.
INTRODUZIONE
Fig 1. sequenza adenoma-carcinoma. (Immagine adattata da sito
web: http://www.mednemo.it)
Tra i vari fattori di rischio la nutrizione rappresenta
quello più studiato nel caso del tumore del colon.
Benché la ricerca abbia fornito in merito risultati in
parte contrastanti, si può affermare che una dieta
ad alto contenuto di grassi animali e proteine (che
provoca a sua volta il rilascio nell'intestino di
grandi quantità di acidi biliari) è in grado di favorire
la trasformazione maligna di eventuali polipi
preesistenti. Inoltre molteplici studi hanno
dimostrato che particolari polimorfismi, ovvero
variazioni genetiche che presentano una
prevalenza maggiore dell 1% in una popolazione,
favoriscono l' insorgenza del CCR a parità di
abitudini alimentari. (1)
Il cancro del colon-retto (CCR) è il terzo tipo di
tumore maligno per incidenza e mortalità sia per gli
uomini che per le donne nei Paesi Occidentali. E'
dovuto alla proliferazione incontrollata delle cellule
della mucosa colica che, a seguito dell' accumulo di
mutazioni genetiche a danno del DNA, porta alla
formazione di polipi che continuano a proliferare in
senso maligno (Figura 1).
Diversi fattori, quali etnia, stato di salute, nutrizione,
età e costituzione genetica possono predisporre allo
sviluppo del tumore (Fig. 2).
Fig. 2: fattori predisponenti allo sviluppo di tumore.
(Immagine adattata da sito web:http://www.carcinomaepatico.it)
È stato dimostrato che alterazioni a carico di enzimi
coinvolti nel metabolismo di sostanze precancerogene come gli idrocarburi aromatici
policiclici (PHA) e le ammine eterocicliche (HCA),
presenti nella carne eccessivamente cotta, sono
associate ad un maggior rischio di sviluppare
cancro colon-rettale (1-2). Tra questi enzimi sono
da annoverare quelli di fase I appartenenti della
famiglia del citocromo P450 (CYP), o quelli di fase
II come la glutatione S-trasferasi (GST) e la UDPglucuronosyltrasferasi (UGT) (3-5) (Fig.3). Tra i
3: alterazioni e cancro. (Immagine adattata dall’ articolo: Molecular
polimorfismi studiati si è concluso che alterazioni a Fig.
epidemiology, biomarkers and cancer prevention)
carico di CYP2E1, CYP1B1, GSTM1
e UGT1A7, SULT1A1 (sulfotransferase), ODC1 (ornithine Decarboxylase1) influiscono significativamente
sul rischio di contrarre tumore del colon consumando carne rossa, mentre per geni come la Nacetyltransferase 2 (NAT2) si sono pubblicati risultati contrastanti a seconda delle popolazioni oggetto di
studio (6-11) Più di recente è stato inoltre dimostrato che sussiste una correlazione negativa tra il rischio di
sviluppare CCR e la concentrazione serica di adiponectina, ovvero un ormone proteico secreto dal tessuto
adiposo che modula alcuni processi metabolici come la regolazione del glucosio e il catabolismo degli acidi
grassi (12-13). Polimorfismi come rs2241766 and rs1501299 del gene ADIPOQ (codificante l’
adiponectina) cambiano la concentrazione sierica di tale proteina e correlano con l’ insorgenza di CCR e il
consumo di carne (14-17).
L’interesse per la componente genetica della suscettibilità a malattie complesse sta dunque assumendo
sempre più importanza nella medicina moderna, in quanto si sta mettendo in evidenza il ruolo di alcuni
polimorfismi genetici relativamente comuni, ma che se associati tra loro e combinati con specifiche
componenti ambientali, quali il consumo di carne, possono elevare notevolmente il rischio di sviluppare
patologie diffuse nella società industriale inclusi i tumori.
OBIETTIVO DEL PROGETTO
La letteratura scientifica offre diversi esempi in cui si è individuata una correlazione diretta tra
l’ insorgenza di CCR, l’ assunzione di carne e il patrimonio genetico di popolazioni come quella
Pakistana, Australiana, Afroamericana, Giapponese, Cinese (18-23); il nostro progetto si
focalizza sulla ricerca di polimorfismi caratteristici della popolazione Italiana, a partire da quella
Calabrese.
Il progetto si pone l’ obiettivo di:
 individuare la presenza di eventuali polimorfismi genetici diffusi nella popolazione
calabrese a carico di geni noti per essere in qualche modo correlati all’ insorgenza del
cancro colon-rettale. Le tecnologie di sequenziamento di ultima generazione (NGS), di cui
dispone l’ ateneo, permetteranno di sequenziare in tempi e costi accessibili tutti gli esoni
dei geni target selezionati per lo studio (CYP2E1, NAT2, GSTM1, GSTT1, ADIPOQ,
CYP1B1, SULT1A1, ODC1) in modo da individuare non solo la presenza dei polimorfismi
già noti, ma anche nuove alterazioni non ancora descritte in letteratura. La realizzazione
del progetto, che prevede anche la validazione funzionale delle eventuali nuove mutazioni
identificate, ha lo scopo di individuare i geni più frequentemente alterati nella popolazione
calabrese e più fortemente correlati ad un maggior rischio di insorgenza del tumore del
colon così da porre le basi per l’ introduzione di uno screening di tali geni in soggetti
a rischio di sviluppare CCR (esempio a causa di familiarità,
obesità, sedentarietà, o semplicemente età avanzata),
proponendo delle metodiche di NGS che possano essere
adattate alla pratica clinica. Uno screening di fattori genetici
predisponenti al CCR permetterebbe di adottare misure di
prevenzione quali per esempio la modulazione della dieta.
 Effettuare uno studio di correlazione tra l’
insorgenza di CCR, la predisposizione
genetica e l’ assunzione di carne rossa
(trattata e nostrana) o bianca con l’ obiettivo
di valutare l’ impatto della genetica sul rischio
confrontando 2 gruppi di individui (sani o
affetti da CCR) che a parità di alimentazione
sviluppano o meno tumore. Sarà rilevante
acquisire questa informazioni soprattutto a
seguito della decisione dell’ OMS di inserire la
carne rossa tra i composti cancerogeni
limitando però lo studio alla sola carne rossa
e alla sola carne prodotta in USA. Uno dei
nostri obbiettivi è quelli di capire se un
maggior consumo di carne nostrana, quale
quella calabrese, possa ridurre il rischio di
sviluppare CCR rispetto a quello predetto dall’
OMS a seguito dell’ analisi condotta sulla
carna trattata prodotta in USA che non tiene
in considerazione vari fattori quali l’ ambiente
degli allevamenti, la modalità di produzione
della carne e la genetica delle popolazioni.
ARTICOLAZIONE DEL PROGRAMMA DI RICERCA
Il progetto prevede di utilizzare tecniche di
sequenziamento di ultima generazione per
identificare eventuali polimorfismi genetici a
carico di geni quali CYP2E1, NAT2, GSTM1,
GSTT1, ADIPOQ, CYP1B1, SULT1A1, ODC1
potenzialmente predisponenti allo sviluppo di
carcinoma colon-rettale.
Le alterazioni individuate, qualora non descritte
in letteratura, saranno validate funzionalmente
mediante l’ utilizzo di modelli di studio in vivo.
Sarà quindi effettuato uno studio di
correlazione tra la predisposizione genetica, il
consumo di diversi tipi di carne e l’ insorgenza
del tumore colon-rettale.
Lo studio si focalizzerà sulla popolazione
calabrese, dove è alto il consumo di carne,
soprattutto nostrana.
Utilizzo di tecniche di sequenziamento di
ultima generazione per il rilevamento di
polimorfismi genetici potenzialmente
predisponenti all’ insorgenza di cancro
colon-rettale nella popolazione Calabrese
Arruolamento dei pazienti da
includere nello studio
Estrazione DNA da sangue
periferico
Sequenziamento di geni
target
Validazione funzionale dei
polimorfismi identificati
Studio di correlazione
Arruolamento dei pazienti da
includere nello studio
È previsto l’ arruolamento di 1000
soggetti suddivisi in 2 gruppi:
500 Pazienti affetti da tumore colon-rettale
500 Individui Normali (non affetti da patologie tumorali)
I 2 gruppi saranno normalizzati per età, sesso, BMI, stile di vita, status di fumatore.
Per ciascuno dei 2 gruppi sarà operata una ulteriore suddivisione a seconda delle abitudini
alimentari di ciascun individuo:
Prevalentemente carne
rossa nostrana (100
soggetti per gruppo)
Scarso consumo Medio-Alto
consumo di
di carne
carne
(<25gr/gg)
(200 soggetti per (50-100gr/gg)
(300 soggetti
gruppo)
per gruppo)
Prevalentemente carne
rossa trattata (100
soggetti per gruppo)
Prevalentemente carne
bianca (100 soggetti
per gruppo)
Estrazione del DNA e
Sequenziamento dei geni Target
È prevista:
 l’ estrazione del DNA dal sangue periferico degli
individui oggetto di studio e il successivo controllo
di qualità dell’ integrità e la quantizzazione degli
acidi nucleici estratti (Fig. 4.1-2)
 La preparazione delle librerie dei geni
sequenziare seguita dal controllo di qualità.
(Fig. 4.3-4)
da
 La preparazione dei campioni e il loro caricamento
sul chip da sequenziare e il successivo
sequenziamento.(Fig. 4.5-6)
 L’ analisi bioinformatica dei risultati ottenuti.
(Fig. 4.7)
Validazione funzionale dei polimorfismi
rilevati e studio di correlazione
 Sarà effettuato uno studio di
correlazione tra lo sviluppo di
tumore e il consumo di carne
rossa (trattata e nostrana) o
bianca e il background genetico
degli individui oggetto di studio.
 Saranno quindi selezionati per la
validazione funzionale eventuali
polimorfismi non ancora descritti
in letteratura e strettamente
correlati allo sviluppo di CCR.
Gli studi in vivo saranno condotti su dei modelli murini APC [-/-] , in quanto costituiscono un
modello ottimale per valutare l’ interazione geni-ambiente nell’ insorgenza di un CCR il cui
evento mutazionale iniziante riproduce ciò che effettivamente si verifica nelle cellule
staminali della mucosa colica nell’ uomo. Una volta generati i topi APC [-/-] esprimenti la
mutazione da validare, essi saranno sottoposti a diverse diete, o trattati con composti
carcinogeni specifici del CCR come le N-nitrosammine e le ammine eterocicliche. Sarà
quindi valutata la formazione di masse tumorali o l’ alterazioni a carico delle cripte del
colon a seconda dell’ espressione o del knockout dei polimorfismi oggetto di studio.
MATERIALI E METODI
 ARRUOLAMENTO DEI SOGGETTI DELLO STUDIO
I soggetti dello studio saranno
selezionati tra individui di diverse città
della Calabria, che firmino il proprio
consenso alla donazione di un
campione di sangue venoso periferico
a scopo di ricerca. Saranno arruolati
500 individui sani, possibilmente
selezionati tra i donatori di sangue, e
500 pazienti affetti da carcinoma
colon-rettale.
Ciascun individuo dovrà compilare un questionario che permetta di ricavare
informazioni circa le abitudini alimentari, il BMI, lo stile di vita e lo status di fumatore
così da poter normalizzare i 2 gruppi da sottoporre allo screening genetico.
 ESTRAZIONE DEL DNA E CONTROLLO DI QUALITA’
A ciascun individuo oggetto di studio sarà richiesto di
effettuare un prelievo di 2 ml di sangue venoso da cui
estrarre il DNA da sequenziare. Il sangue sarà estratto dai
linfociti mediante un kit Invitrogen che prevede l’ utilizzo di
coloninne in grado di isolare selettivamente il DNA.
Sarà utilizzato lo strumento Agilent
Tape Sation per quantizzare in modo
molto preciso il DNA e fornire
indicazioni
circa
il
livello
di
degradazione del materiale genetico
estratto.
 SEQUENZIAMENTO MEDIANTE TECNOLOGIE DI NUOVA GENERAZIONE
La piattaforma di sequenziamento di ultima
generazione Ion Torrent che sarà utilizzata per la
realizzazione del progetto offre la possibilità di
disegnare il proprio pannello di studio in modo che
vengano sintetizzati dei primer che amplifichino
l’ intera porzione codificante dei geni target
selezionati: CYP2E1, NAT2, GSTM1, GSTT1,
ADIPOQ, CYP1B1, SULT1A1, ODC1.
Le librerie genetiche saranno generate utilizzando il kit Ion
Ampliseq a partire da 10 ng di DNA genomico. Il protocollo
prevede di amplificare le regioni dei geni target con un sistema di
PCR multiple; la parziale digestione dei primer; il legame a dei
barcode univoci delle regioni amplificate e infine il legame a degli
adattatori che consentiranno di ancorare i frammenti del DNA da
sequenziare ad un supporto solido (chip).
Il sequenziamento verrà realizzato
mediante il sistema ion Torrent
PGM, di cui dispone l’ ateneo
Università Magna Graecia di
Catanzaro.
 MODELLI ANIMALI ADOTTATI PER LA VALIDAZIONE FUNZIONALE
Per la validazione funzionale dei polimorfismi identificati saranno
generati dei topi knock-in, ovvero saranno isolate le cellule staminali
embrionali murine e vi sarà inserito il DNA contenente il gene di
interesse precedentemente modificato in modo da presentare l’
alterazione nucleotidica specifica identificata nei pazienti.
Si introdurranno le cellule staminali così
modificate nell'embrione di topo, che verrà
impiantato in una femmina. Tre settimane più
tardi nasceranno i topolini chimerici, che
saranno incrociati per ottenere un modello
murino esprimente le varianti oggetto di studio.
Costrutto veicolante il DNA
mutato di interesse
I topi saranno quindi sottoposti a diverse diete o
trattati con componenti specifici della carne rossabianca o trattata, come per esempio con Nnitrosammine o le ammine eterocicliche. Lo studio
sarà effettuato su modelli murini APC [-/-]. 2 mesi
dopo i trattamenti sarà valutata l’ eventuale
insorgenza di tumore o l’ alterazione della mucosa
colica a seguito dei diversi stress ambientali in
modo diverso a seconda della genetica dei modelli
murini ingegnerizzati.
 ANALISI STATISTICA
Sarà utilizzato il software EpiData 3.1 per inserire i
dati raccolti, e il software SPSS 18.0 per effettuare l’
analisi. La differenze nella frequenza di distribuzione
delle caratteristiche demografiche generali, il
genotipo e gli alleli tra gli pazienti oggetto di studio
rispetto ai controlli, così come il test di equilibrio di
Hardy-Weinberg, saranno calcolare mediante il test
del X2.
Per definire il rapporto causa-effetto tra l’
assunzione di carne rossa trattata o non trattata e
carne bianca e l’ insorgenza di CCR a seconda
del genotipo degli individui oggetto di studio sarà
calcolato l’ ODDS RATIO. Mentre sarà applicato
un modello di regressione logistica multivariata
per ottenere diversi OR per tenere in
considerazione le variabili dello studio quali BMI,
stile di vita, status di fumatore.
OUTPUT DEL PROGRAMMA
L’ incrementato consumo di carne,
tipico dei paesi occidentali, è stato
significativamente associato all’
aumentato rischio di cancro colonrettale.
L’
identificazione
di
polimorfismi in geni chiave può
aumentare notevolmente questo
rischio. Ci aspettiamo di individuare
polimorfismi
caratteristici
della
popolazione
calabrese
per
determinare se in questa regione, i
fattori genetici possono interagire
con le cause ambientali (quali per esempio allevamento degli animali in zone più o meno
controllate e con diete degli animali più o meno controllate, prevalente consumo di carne
nostrana piuttosto che trattata o di esportazione.) aumentando il rischio di CCR. A seguito
dello studio di correlazione, ci aspettiamo di validare funzionalmente nuovi polimorfismi in
modelli murini che meglio rappresentano la complessità di un sistema biologico e riproducono
caratteristiche simili a quelle riscontrate nell’ uomo. L’ identificazione di nuove alterazioni
validate, e la conferma di quelle già descritte in letteratura come associate al CCR in altre
etnie, può porre le basi per futuri screening utili per la prevenzione, ma anche per la diagnosi
e il follow up della popolazione. Qualora il nostro progetto fornisse risultati chiari circa l’
impatto della genetica sul rischio, si potrebbe pensare di estendere lo studio, per la prima
volta, al resto dell’ Italia.
BIBLIOGRAFIA
[1] Larsson S et al.: Meat consumption and risk of colorectal cancer: a meta-analysis of prospective studies. Int J Cancer
2006;119(11):2657–64. [PubMed: 16991129]
[2] Sandhu et al.: Systematic review of the prospective cohort studies on meat consumption and colorectal cancer risk: a metaanalytical approach. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001;10:439–46. [PubMed: 11352852]
[3] Cross A, Sinha R. Meat-related mutagens/carcinogens in the etiology of colorectal cancer. Environ Mol Mutagen 2004;44:44–5.
[PubMed: 15199546]
[4] Chen et al. A prospective study of N-acetyltransferase genotype, red meat intake, and risk of colorectal cancer. Cancer Res
1998;58:3307–11. [PubMed: 9699660]
[5] Le Marchand et al Red meat intake, CYP2E1 genetic polymorphisms, and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev 2002;11:1019–24. [PubMed:12376502]
[6]Chen et al. A prospective study of N-acetyltransferase genotype, red meat intake, and risk of colorectal cancer. Cancer Res
1998;58:3307–11. [PubMed: 9699660]
[7] Murtaugh M et al. Meat consumption patterns and preparation, genetic variants of metabolic enzymes, and their association
with rectal cancer in men and women. J Nutr 2004;134:776–84. [PubMed: 15051825]
[8]Murtaugh M et al. The CYP1A1 genotype may alter the association of meat consumption patterns and preparation with the risk
of colorectal cancer in men and women. J Nutr 2005;135:179–86. [PubMed: 15671210]
[9] Lilla C et al. SULT1A1 genotype and susceptibility to colorectal cancer. Int J Cancer 2006;120:201–6. [PubMed: 17013894]
[10] Butler L et al. Joint effects between UGT1A7 genotype and dietary carcinogen exposure on risk of colon cancer. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:1626–32. [PubMed: 16030093]
[11] Michelle Cotterchio1,2 et al. Red meat intake, doneness, polymorphisms in genes that encode carcinogenmetabolizing enzymes and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008 November ; 17(11): 3098–
3107. [PubMed: 18990750
[12] Izadi V et al. Serum adiponectin level and different kinds of cancer: a review of recent evidence. ISRN Oncol
2012;2012:982769. [PubMed: 23213569]
[13] Joshi RK et al. Association between obesity-related adipokines and colorectal cancer: a case-control study and metaanalysis. World J Gastroenterol 2014;20:7941–7949. [PubMed: 24976730]
[14] Li P et al. An updated meta-analysis of the association between ADIPOQ rs2241766 polymorphism and colorectal cancer.
Tumour Biol 2014; 35:2491–2496. [PubMed: 24293390]
[15] Li P et al. Correlation of serum adiponectin and adiponectin gene polymorphism with metabolic syndrome in Chinese
adolescents. Eur J Clin Nutr. 2014; 69(1):62-7. [PubMed: 25074391]
[16] Pineda-Tenor D et al. Association of adiponectin (ADIPOQ) rs2241766 polymorphism and dyslipidemia in HIV/HCVcoinfected patients. Eur J Clin Invest 2014;44:453–462. [PubMed: 24528335]
[18] Guo X et al. Association Between Adiponectin Polymorphisms and the Risk of Colorectal Cancer. Genet Test Mol Biomarkers
2015;19(1):9-13. [PubMed: 25489716]
[19] Wang H et al.; Interaction between Red Meat Intake and NAT2 Genotype in Increasing the Risk of Colorectal Cancer in
Japanese and African Americans. PLoS One. 2015 Dec 18;10(12):e0144955. PMID: 26683305 [PubMed - in process].
[20] Ramzi NH et al.; Role of genetic & environment risk factors in the aetiology of colorectal cancer in Malaysia. Indian J Med
Res. 2014 Jun;139(6):873-82. PMID: 25109722 [PubMed - indexed for MEDLINE].
[21] Andersen V et al.; No association between HMOX1 and risk of colorectal cancer and no interaction with diet and lifestyle
factors in a prospective Danish case-cohort study. Int J Mol Sci. 2015 Jan 7;16(1):1375-84. PMID: 25574604 [PubMed - indexed for
MEDLINE].
[22] Christina M Nagle et al.; Cancers in Australia in 2010 attributable to the consumption of red and processed meat.
Aust N Z J Public Health. 2015 Oct; 39(5): 429–433. Published online 2015 Oct 6. PMCID: PMC4606774.
[23] Masood N et al.; Epidemiological factors related to GSTM1 and GSTT1 genes deletion in colon and rectum
cancers: A case-control study. Cancer Biomark. 2015;15(5):583-9. PMID: 26406947 [PubMed - in process].