Dr. Laura Maggi, Università “Sapienza”, [email protected]
Dalla struttura alla funzione, come e perché "illuminiamo" i neuroni?
Cosa sono i neuroni?
Il cervello è costruito da circuiti composti da cellule chiamate neuroni. Queste cellule possiedono
un corpo cellulare che contiene il nucleo, un prolungamento detto assone che trasporta gli stimoli
nervosi verso la periferia e da numerose ramificazioni dette dendriti simili ai rami di un albero che
ricevono gli stimoli dalla periferia (Fig.1). I neuroni si contattano in zone specializzate dette
“sinapsi”, in queste zone i neuroni “parlano” fra di loro, si scambiano informazioni. Gli stimoli sono
cariche elettriche in movimento, piccole correnti in grado di trasmettersi da un neurone all’altro
(Fig. 1, 2). In ogni istante il circuito neuronale viene percorso da miliardi di queste piccole correnti
e da questi intricati segnali emerge la sorprendente capacità del cervello di eseguire funzioni
complesse. In neuroni possiedono, quindi, la capacità di generare, ricevere, condurre ed elaborare i
segnali. E 'stato dimostrato che l'attività elettrica dei neuroni e loro connettività può essere plasmato
da interazioni con il mondo intorno a noi, il nostro ambiente esterno. Infatti, il nostro cervello è
molto plastico ed è in grado di modificare il numero di neuroni, l'organizzazione delle loro reti e la
loro funzione dopo stimolazione specifica.
Fig.1 Schema del neurone e della sinapsi.
Fig.2 Schematizzazione delle piccole correnti elettriche che si muovono tra neuroni.
Come possiamo visualizzare un neurone all’ interno di una struttura cerebrale?
Visualizzazione tramite proteine fluorescenti abbinate a molecole target.
Negli ultimi anni si è identificata una proteina con proprietà molto utili a questo scopo. E’ una
proteina isolata dalla medusa Victoria aequorea e può essere prodotta in qualsiasi cellula di
vertebrati. Inoltre quando viene illuminata con luce azzurra restituisce parte della energia assorbita
sottoforma di luce verde, ovvero diviene fluorescente, da cui il nome, Green Fluorescent Protein
(GFP). Questa caratteristica della proteina è stata largamente sfruttata per “illuminare” molti
processi cellulari fondendo ad esempio il DNA di questa proteina con quello di una proteina
bersaglio. Il risultato della fusione è una proteina che conserva le proprietà della molecola originale
e inoltre diventa visibile in fluorescenza. Localizzare ora la proteina nelle cellule e studiarne ad
esempio la sua modifica in localizzazione diventa possibile utilizzando un microscopio adatto per
visualizzare cellule dell’ ordine di pochi micron e vedere la luce fluorescente.
Visualizzazione dei neuroni con coloranti fluorescenti
E’ possibile introdurre dei coloranti fluorescenti inerti nel neurone per visualizzarne la struttura.
Un metodo per caricare il colorante nel neurone è una tecnica sperimentale che utilizza dei capillari
di vetro molto sottili con una parte terminale appuntita con diametro di circa 1 micron, più piccolo
del corpo cellulare del neurone (Fig. 3). Attraverso speciali manipolatori, che permettono di
muovere la pipetta in modo molto fine e controllato, ci si può avvicinare al neurone e inserire la
punta del capillare nella cellula (la sua membrana è abbastanza fluida da permettere di essere
attraversata mantenedone la struttura) permettendo al colorante fluorescente di fluire all’ interno del
neurone e diffondersi in tutte le sue ramificazioni. Nel tempo si sono sviluppate molte altre tecniche
per permettere di marcare velocemente più neuroni in una struttura, ad esempio si utilizzano sistemi
virali inattivati e ingegnerizzati, (che non sono pertanto dannosi!) in grado di mantenere la capacità
di “infettare” le cellule ma solo con le proteine fluorescenti introdotte nel sistema.
Fig.3 Esempio di pipetta di vetro contenente un colorante fluorescente entrata nel neurone
Fig. 4 Esempi di neuroni marcati con il coloranti fluorescenti
Alcuni coloranti posso essere inoltre dei sensori di modifiche ioniche che avvengono nel neurone in
risposta agli stimoli. Ad esempio esistono coloranti fluorescenti sensibili a variazione dello ione
calcio intracellulare che viene tipicamente modificato in risposta alla stimolazione nervosa. Oltre a
dare l’ immagine della struttura del neurone, possono, quindi, anche rilevare la sua attività elettrica
rilevata come modifiche del livello di fluorescenza.
Microscopi per visualizzare i neuroni marcati
Una microscopia adatta a questi scopi è la microscopia a due fotoni (Fig. 5), una tecnica
potentissima che permette di visualizzare la fluorescenza prodotta da cellule poste all’interno di un
organo in vivo. In particolare, negli ultimi 20 anni questa tecnica ha totalmente rivoluzionato la
comprensione del cervello, di come si sviluppa e di come avvengono i processi fisiologici e
patologici. Il suo utilizzo ha permesso di definire funzione e forma delle cellule nervose che
possono essere studiate mediante molecole fluorescenti.
E’ possibile studiare quando e quali neuroni entrano in comunicazione fra loro, anche per periodi di
tempo abbastanza lunghi legati ad esempio alla durata di alcuni mesi delle proprietà di fluorescenza
delle proteine.
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Fig.5 Esempio di microscopio a due fotoni
Come capiamo la funzione del neuroni?
Ci sono alcune tenciche che permettono di studiare l’attività elettrica, il passaggio di informazione tra i
neuroni e le loro modifiche cellulari attività-dipendenti. Una di queste è il “patch clamp” che, utilizzando
una sottilissimo capillare di vetro contenente un elettrodo appoggiato sul neruone o inserito al suo interno,
permette di registrare attravrso un amplificatore di segnale l’attività elettrica neuronale.
Un modo per capire la funzione del neurone all’ interno del circuito e della struttura in cui opera, è quello di
alterare la sua attività e studiare le conseguenze di questa manipolazione. Alterare l’attività di speciifci
neuroni o gruppi di neuroni in vivo non è certo un operazione banale, ma negli ultimi anni lo sviluppo di
nuove tecniche ha permesso di alterare, accendendo o spegnendo, l’attività di specifici neuroni target e
chiarirne cosi la funzione.
Una delle tecniche piu’ recenti e innovativa è chiamata “optogenetica”, che coniuga metodi ottici e
genetici. Il primo passo è quello di manipolare geneticamente i neuroni di interesse facendo loro esprimere
sulla membrana neuronale una particolare proteina che non è presente naturalmente nell’ oraganismo.
Tali proteine appartengono alla famiglia della opsine, tra queste la cui piu’ utilizzata è la
“Channelrhodopsin-1 (ChR1)” che deriva da un alga unicellulare, e hanno la particolare capacità di
rispondere a uno stimolo luminoso cambiando conformazione, aprendosi come un poro-canale e lasciando
passare all’ interno del neurone degli ioni carichi (Fig.6). Le proteine possono essere selettive per ioni
negativi, in genere inibitori sull’attività neruonale, o positivi, in genere eccitatori sull’ attività neuronale.
Facendo, quindi, esprimere proteine con caratteristiche specifiche e selezionando i diversi stimoli luminosi
a cui rispondono, è possibile semplicemente illuminado il tessuto con una fibra ottica ottenere l’ inibizione
del neurone target o la sua attivazione (Fig. 6).Questa tecnica sta fornendo indicazioni preziose sulla
funzione dei neuroni nei circuiti cerebrali che sottendo specifiche funzioni .
Luce blu
Luce gialla
lato
esterno
proteina
membrna
neurone
proteina
lato
cellualre
ione carico positivamente
ATTIVAZIONE
Fig.6 Modello di attivazione delle opsine
ione carico negativamente
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