MONITORAGGIO DI CORPI IDRICI

MONITORAGGIO
DI
CORPI
IDRICI
SUPERFICIALI
ECOTOSSICOLOGICI MULTISPECIE SU ACQUE E SEDIMENTI
M.A.Pasini, M. Gazzola , A. Secondi , M. Villa
MEDIANTE
TEST
Riassunto
In questo studio la caratterizzazione dei principali corsi d’acqua superficiali della Provincia di Pavia
è stata condotta mediante saggi tossicologici sull’acqua, sui sedimenti e sulla miscela di entrambi.
I saggi tossicologici impiegati sono : test di tossicità acuta con Daphnia magna e Vibrio fischeri
sull’acqua superficiale, test di fitotossicità con Lactuca sativa, Cucumis sativus e Lepidium sativum
sui sedimenti “in toto” , test di tossicità cronica con Ceriodaphnia dubia su miscela di sedimenti ed
acqua superficiale e test di genotossicità con Vicia faba su sedimenti .
I saggi utilizzati rappresentano un utile ed economico strumento per la caratterizzazione delle acque
e dei sedimenti ,in linea con quanto previsto dal D.L. 152/99.
Le analisi delle caratteristiche chimico fisiche dell’acqua e del sedimento permettono di
identificare e quantificare gli inquinanti più diffusi; tuttavia per predire il destino di un inquinante
nell’ambiente occorre conoscere anche come agisce sull’ecosistema (Baudo e Muntau, 1985).
Indicazioni necessarie ad un’appropriata caratterizzazione della qualità ambientale, non possono
prescindere dallo studio degli effetti diretti, delle interazioni e della biodisponibiltà dei tossici
nell’ambiente acquatico.
Poiché generalmente sono sconosciute sia la miscela delle sostanze tossiche presenti, che la loro
tossicità, la valutazione del rischio per la vita acquatica deve prevedere una serie di test basati su
specie sia animali, che vegetali in modo tale da aumentare la rappresentatività delle informazioni
ottenute. Infatti, se estrapolazioni tra specie appartenenti alla stessa famiglia sono ragionevolmente
sicure, estrapolazioni tra classi ed ordini sono molto approssimative. E’ inoltre dimostrato che non
esiste una specie universalmente sensibile, ma che le risposte agli inquinanti sono quanto mai
variabili tra una specie e l’altra (Wang e Freemark, 1995). Queste valutazioni suggeriscono una
caratterizzazione ecotossicologica basata su saggi di tossicità che impiegano organismi appartenenti
a diversi livelli trofici (Filipic,1995; Nielsen e Ranck, 1994; Dell’Orto et al.,1997). Le specie più
comunemente impiegate allo scopo sono rappresentate da alghe, batteri ,crostacei e pesci.
Tradizionalmente si rilevano solo gli effetti acuti, tuttavia tale valutazione non esclude che possano
verificarsi effetti genotossici oppure sub-cronici e cronici conseguenti ad un’esposizione a lungo
termine.
In molte situazioni infatti, la diluizione o la limitata biodisponibilità degli inquinanti ne fanno fonti
di stress che perdurano nel tempo ma che raramente originano effetti di tipo acuto.
In questo studio sono state monitorate le condizioni dei maggiori fiumi della provincia di Pavia
prima della loro immissione nel fiume Po. Quest’ultimo è stato invece campionato all’ingresso ed
all’uscita dal territorio provinciale. Le stazioni per gli affluenti del Po sono state collocate a
chiusura di bacino.
La caratterizzazione della qualità del corpo idrico è stata condotta mediante saggi tossicologici
sull’acqua superficiale, sui sedimenti e sulla miscela di entrambi.
Attraverso le informazioni ricavate dall’insieme dei comparti che costituiscono l’ambiente indagato
si è cercato di ottenere un quadro il più possibile completo, utile alla quantificazione della qualità
ambientale.
Sulle acque superficiali, campione rappresentativo per una valutazione puntiforme atta a cogliere
prevalentemente effetti immediati, sono stati condotti test di tossicità acuta con Vibrio fischeri e
Daphnia magna.
Sui sedimenti, comparto in cui convergono i processi di concentrazione degli inquinanti organici ed
inorganici, si è scelto di condurre saggi di fitotossicità (germinazione ed allungamento radicale con
Lactuca sativa, Cucumis sativus e Lepidium sativum) e di genotossicità (test del micronucleo con
Vicia faba). Nei sedimenti gli inquinanti, associati al particolato o in soluzione nell’acqua
interstiziale, possono raggiungere concentrazioni superiori a quelle della colonna d’acqua
sovrastante; tutto ciò evidenzia la necessità di non trascurare questo comparto (Burton, 1991).
Infine sono stati condotti saggi anche sulla miscela dei due comparti, al fine lavorare in condizioni
che cercano di riprodurre quelle naturali. In quest’ultimo caso, esclusi preventivamente effetti di
tipo acuto, si è proceduto all’esecuzione di un saggio di tipo cronico con Ceriodaphnia dubia.
MATERIALI E METODI
Raccolta campioni
I campioni costituti dalle acque superficiali e dai sedimenti sono stati raccolti nell’arco di circa 30
giorni ed in due campagne, una invernale dal 28.01.98 al 12.03.98 ed una estiva dal 13.07.98 al
21.07.98.
Sono stati conservati a 4°C al buio per tutto il periodo dell’utilizzo.
Per l’esecuzione del test di tossicità acuta con Vibrio fischeri, i campioni di acqua superficiale sono
stati filtrati su filtri di cellulosa del diametro di 0.45 µm.
Saggi biologici
Test di tossicità acuta a 24 h con Daphnia magna
Sono stati utilizzati organismi di età inferiore alle 24 h.
Il test è stato condotto a 20°C su campioni di acqua tal quale con fotoperiodo di 16 ore di luce e 8
ore di buio (IRSA, 1993).
Alla fine della prova è stata valutata la mortalità delle dafnie espressa come percentuale di
organismi immobili.
Test di tossicità acuta a 15’ con Vibrio fischeri
La bioluminescenza emessa da una popolazione monospecifica di batteri Gram-negativi
appartenenti alla specie Vibrio fischeri è stata utilizzata per un saggio a 15 minuti per la
determinazione della percentuale di effetto rispetto al controllo (Sistema Microtox: comparison
test).
La prova è stata effettuata su campioni di acqua di superficie filtrata su membrana di cellulosa da
0.45 µm.
Test di fitotossicità a 72 h con Lactuca sativa, Cucumis sativus e Lepidium sativum.
Il test di fitotossicità ( germinazione ed allungamento radicale) è stato effettuato con tre semi,
lattuga cetriolo e crescione sui sedimenti. I campioni sono stati utilizzati “in toto” al fine di ridurre
al minimo la manipolazione (Baudo, comunicazione personale). Il saggio (IRSA,1983) è stato
condotto per 72 ore al buio ed a 25 °C. Alla fine della prova sono stati registrati il numero dei semi
germinati e la lunghezza radicale; i due valori sono stati combinati in Indice di Germinazione.
Test di tossicità cronica a 7 giorni con Ceriodaphnia dubia
Giovani individui di Ceriodaphnia dubia sono stati esposti per 7 giorni ai campioni costituiti da una
miscela di acqua superficiale e sedimento (1:1) alle condizioni standardizzate del metodo IRSA
(Vigano’ , 1998)
Sono stati considerati tre end point: mortalità a lungo termine, accrescimento (lunghezza corporea
dell’adulto a fine saggio) e fertilità (numero di piccoli prodotto da ciascuna femmina nelle tre
schiuse).
Test di genotossicità a 96 ore con Vicia faba
I semi di Vicia faba, conservati in ambiente fresco e ben areato, sono stati fatti germinare in 500
grammi di sedimento e, per il controllo, in 500 grammi di sabbia. La germinazione è avvenuta al
buio ed a una temperatura di 20°C per un periodo di 96 ore (Pasini, 1994). Per ciascun campione
sono stati utilizzati 4 semi. Per ciascun apice radicale sono state lette 1000 cellule ed i risultati
vengono espressi come numero delle mitosi e dei micronuclei su 1000 cellule.
Espressione dei risultati
L’immobilizzazione di Daphnia magna a 24 ore, la riduzione della bioluminescenza di Vibrio
fischeri a 15’ e la mortalità di Ceriodaphnia dubia nel test cronico a 7 giorni vengono espressi
come percentuale di effetto rispetto al controllo. In base a quanto definito dalle metodiche di
riferimento ed alla variabilità dei controlli (che si attesta intorno al 20%), valori che si discostano
dal controllo più del 20% sono stati considerati differenti da quest’ultimo.
Per i test di fitotossicità, i due end-point valutati, germinazione ed allungamento radicale, vengono
combinati in un Indice di Germinazione % (IRSA,1983):
IG % = 100 (GsLs)/(GcLc)
Gs=germinazione campione
Gc=germinazione controllo
Ls=lunghezza campione
Lc=lunghezza controllo
Dato che la variabilità dei controlli si attesta intorno al 20%, i dati vengono suddivisi nei seguenti
intervalli cui corrispondono altrettanti colori:
• >120 stimolazione
(colore azzurro)
• 80-120 nessun effetto
(colore verde)
• 40-80 inibizione
(colore giallo)
• <40 marcata inibizione (colore rosso)
Per l’analisi delle differenze rispetto al controllo degli end-point (accrescimento e fertilità) misurati
nel test cronico a 7 giorni con Ceriodaphnia dubia, viene impiegato il test di Wilcoxon per dati non
appaiati per p<0.05.
Per quanto riguarda il test di genotossicità, il numero limitato di osservazioni non ha permesso la
valutazione statistica dei dati.
RISULTATI
I risultati vengono presentati separatamente a seconda della matrice sulla quale sono stati eseguiti i
test.
In tabella 1 compaiono i dati dei saggi di tossicità acuta a 24h con Daphnia magna e a 15’ con
Vibrio fischeri. Sia in inverno, che in estate, non è stata riscontrata tossicità acuta su nessuno dei
due organismi test. Per quanto riguarda i batteri bioluminescenti, si osserva sempre stimolazione
che in soli tre casi (campagna estiva, Staffora, Terdoppio e Ticino) supera il limite convenzionale
del 20% di effetto.
In tabella 2 vengono riassunti gli indici di germinazione ed allungamento radicale relativi alle prove
di fitotossicità a 72 h con lattuga, cetriolo e crescione. Tali indici, inseriti nelle 4 fasce
convenzionalmente introdotte per rappresentare gli effetti, evidenziano parecchi casi di
stimolazione per i tre semi utilizzati (36 % ) ed alcuni casi di inibizione (16,6% ) con un caso solo
di marcata inibizione. In un caso si osserva concordanza nelle risposte dei semi (tossicità in estate
del Sesia). Il Po in inverno risulta tossico a Pieve ed a Spessa per lattuga e cetriolo, mentre stimola
il crescione; in estate stimola la lattuga e non provoca effetti a cetriolo e crescione a Pieve, a Spessa
risulta tossico per cetriolo e crescione. Gli altri corsi d’acqua principalmente stimolano i tre semi.
Il seme più sensibile alla stimolazione risulta essere i crescione; il seme meno sensibile sia alla
stimolazione, sia all inibizione, il cetriolo.
In tabella 3 si riportano gli end-point rilevati con il test di tossicità cronica a 7 giorni con
Ceriodaphnia dubia. Sono stati esclusi effetti di tipo acuto dal momento che gli organismi erano
tutti in vita dopo 24 h di esposizione. La morte degli adulti successiva alle 24 h è da considerare
perciò un effetto subcronico. Tale evento (con un’ incidenza superiore al 20%) occorre nel 46% dei
campioni in inverno e nel 33% in estate. Per il parametro accrescimento, in inverno si osservano
valori significativamente inferiori al controllo nel 46 % dei campioni, un solo campione risulta
essere stimolante rispetto al controllo; in estate tutti i campioni (eccetto il Ticino) risultano
significativamente inferiori al controllo. La fertilità in inverno risulta superiore al controllo nel 46
% dei campioni e in un solo caso significativamente inferiore; in estate tutti i campioni mostrano
una fertilità significativamente inferiore al controllo ( Test di Wilcoxon p<0.05).
In tabella 4 sono riportati i risultati del test di genotossicità con Vicia faba riscontrati sui sedimenti
di alcuni corsi d’acqua campionati nella campagna estiva. Questo test, per problemi operativi, è
limitato ad un numero ridotto di campioni. Dal confronto tra il n°di mitosi presenti nel controllo e
nei campioni si possono escludere fenomeni di citotossicità. Nel conteggio dei micronuclei è stata
registrata un’altissima variabilità dei dati, peraltro tipica di questo tipo di test. L’alta presenza di
micronuclei in alcuni apici radicali cresciuti a contatto con i campioni, è chiaramente dovuta ad
effetti genotossici, sebbene questi non possano essere debitamente evidenziati mediante analisi
statistica a causa del basso numero di repliche e della variabilità elevata. I sedimenti che hanno
generato il maggior numero di micronuclei sono quelli raccolti nell’Agogna, nel Naviglio e
nell’Olona Meridionale.
Tab.1-Risultati del test di tossicità acuta sulle acque superficiali.
Daphnia magna
24 h (% immobilizzazione)
STAZIONI
INVERNO
ESTATE
Fiume Po Pieve
Fiume Sesia
Torrente Agogna
Torente Erbognone
Torrente Staffora
Torrente Terdoppio
Torrente Coppa
Torrente Scuropasso
Fiume Ticino
Canale Naviglio
Torrente Versa
Fiume Olona Meridionale
Fiume Po Spessa
Azzurro: stimolazione > 20%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
0
0
10
0
0
Vibrio fischeri
15’ (% di effetto)
INVERNO
ESTATE
-9.4
-18.6
-16.6
14.7
-0.4
-6.6
5
-7
-10.5
-15.8
-14.6
-1.8
-11.3
-14.3
-6.9
-7.6
-43.4
-55
-12.7
-64
-6.2
-11.5
-15.4
-12.9
Tab. 2-Risultati del test di fitotossicità su sedimenti.
Lactuca sativa
Cucumis sativus
Lepidium sativum
72 h (IG%)
72 h (IG%)
72 h (IG%)
STAZIONI
INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE
Fiume Po Pieve
Fiume Sesia
Torrente Agogna
Torente Erbognone
Torrente Staffora
Torrente Terdoppio
Torrente Coppa
Torrente Scuropasso
Fiume Ticino
Canale Naviglio
Torrente Versa
Fiume Olona Merid.
Fiume Po Spessa
Azzurro
Verde
Giallo
Rosso
= >120
= 80-120
= 40-80
= <40
76.3
108.8
161.4
158
109.5
124.2
201.4
132.4
119.3
154.9
133.8
73.4
135.3
57.8
99.6
93.8
145.0
97.6
75.8
56.5
85.4
98.8
206.2
84.7
76.6
118.4
83.1
84.3
124.4
83.8
108.2
124.0
83.1
65.7
74.1
76.6
99.6
72.7
101.1
89.1
124.0
182.7
102.3
120.6
104.8
106.0
151.6
34.1
139.1
125.0
101.9
133.9
143.7
83.6
104.3
171.4
63.3
95.8
94.3
146.2
93.6
77.8
118.6
120.2
94.0
130.9
105.4
65.5
143.0
136.5
145.3
65.4
stimolazione
nessun effetto
inibizione
marcata inibizione
Tab.3- Risultati del test di tossicità cronica su miscela di acqua superficiale e sedimento.
Ceriodaphnia dubia
7 giorni
STAZIONI
MORTALITA’
ACCRESCIMENTO
FERTILITA’
%
(mm)
(n° piccoli)
(mediana)
(mediana)
INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE INVERNO ESTATE
Controllo
0
0
0.98
0.95
13
24
Fiume Po Pieve
20
0
1.80 (+)
0.72 (-)
37 (+)
6 (-)
Fiume Sesia
10
80
0.86 (-)
0.71(-)
17
3(-)
Torrente Agogna
20
0
0.91
0.91(-)
31(+)
19(-)
Torrente Erbognone
20
0
0.89
0.84(-)
27(+)
11(-)
Torrente Staffora
50
20
0.78 (-)
0.81(-)
5
17(-)
Torrente Terdoppio
10
10
0.98
0.90(-)
31(+)
18(-)
Torrente Coppa
30
20
0.80 (-)
0.86(-)
11
6(-)
Torrente Scuropasso
40
secca
0.88 (-)
secca
11
Secca
Fiume Ticino
10
10
0.92
0.95
27(+)
18(-)
Canale Naviglio
50
50
0.85
0.76(-)
20(+)
7(-)
Torrente Versa
30
30
0.88 (-)
0.82(-)
11
8(-)
Fiume Olona Merid.
40
60
0.80 (-)
0.75(-)
4 (-)
6(-)
Fiume Po Spessa
20
10
0.82
0.85(-)
13
10(-)
(+) parametri superiori al controllo; Test di Wilcoxon p<0.05
(-) parametri inferiori al controllo; Test di Wilcoxon p<0.05
Mortalità: Verde <20% nessun effetto
Giallo 20-60% tossicità
Rosso 60-100% marcata tossicità
Accrescimento e fertilità: Azzurro = >120 stimolazione
Verde = 80-120 nessun effetto
Giallo
= 40-80 inibizione
Rosso
= <40
marcata inibizione
Tab. 4:Risultati del test di genotossicità (test del micronucleo)
ESTATE
Vicia faba
(96 h)
STAZIONI
MITOSI (n°./1000 cell)
MICRONUCLEI (n°./1000 cell)
repliche
Media
repliche
media
Controllo
100
98
90
96
96.0
1
0
2
1
1,0
Torrente Agogna
95
85
90
81
87.8
11
0
0
1
3.0
Torrente Staffora
95
87
91
105
94.5
4
1
2
0
1.8
Torrente Scuropasso
81
85
90
85
85.3
3
1
1
1
1.5
Fiume Ticino
92
89
96
89
91.5
0
0
0
1
0.3
Canale Naviglio
52
108
110
98
92.0
0
2
7
6
3.8
Fiume Olona Merid.
87
85
92
88.0
13
1
6
6.7
DISCUSSIONE
Dall’analisi dei dati si possono fare alcune considerazioni:
Si conferma quanto già noto relativamente alle acque superficiali che, se non in casi particolari e
con scarichi tossici in atto, non provocano tossicità acuta. Nel caso delle acque qui saggiate infatti,
si assiste unicamente a fenomeni di biostimolazione a carico dei batteri bioluminescenti. Questo
fenomeno si rileva sui corsi d’acqua Staffora, Terdoppio e Ticino dove, in estate, per problemi di
irrigazione, si assiste ad un massiccio prelievo di acqua ed alla conseguente concentrazione di
nutrienti apportati dagli scarichi civili più o meno depurati.
Un riscontro più diversificato ed interessante si ha dall’analisi tossicologica dei sedimenti,
concentratori naturali delle sostanze organiche ed inorganiche disciolte nell’acqua.
Gli Indici di Germinazione ottenuti dai tre semi impiegati mostrano un quadro differenziato di
risposte tossicologiche. Si osserva in alcuni casi biostimolazione, in altri tossicità, in altri nessuna
differenza rispetto al controllo con risposte variabili a seconda dei semi e del campione in esame.
Il crescione risulta il seme più frequentemente stimolato, il cetriolo è il seme in genere meno
sensibile tuttavia rileva più casi di tossicità in inverno che in estate. La lattuga ed il crescione sono
più frequentemente stimolati in inverno.
Anche in questo caso la biostimolazione si può ascrivere ad eccesso di nutrienti presenti nei
sedimenti, e pertanto viene considerata un indicatore di perturbazione del sistema.
Considerando i tre end point di tossicità cronica, con Ceriodaphnia dubia, valutata sulla miscela di
acqua e sedimento, si osserva che l’ambiente idrico appare globalmente più stressato in estate
quando sia l’accrescimento che la fertilità sono caratterizzate da valori significativamente inferiori
al controllo. In inverno invece, le stazioni in cui l’ambiente è verosimilmente meno compromesso
mostrano una buona capacità di ripresa ed i due parametri considerati assumono valori superiori o
simili al controllo. La stimolazione che si registra in certi campioni è ascrivibile presumibilmente
alla combinazione di una bassa biodisponibilità dei tossici ed aumentata disponibilità di cibo.
Questo risulta, in accordo con Viganò (Viganò, 2000), nelle situazioni in cui l’apporto di carbonio
organico è generalmente di origine naturale.
Il numero di stazioni in cui la mortalità a lungo termine (successiva alle 24h) supera il 20% è più
alto in inverno che in estate. Tuttavia in questa stagione, tale mortalità è mediamente assai più
elevata. E’ interessante notare come i campioni per i quali è stata evidenziata mortalità invernale
sono anche quelli in cui i parametri fertilità e accrescimento rimangono inferiori al controllo.
Una lettura trasversale dell’intera caratterizzazione tossicologica porta ad evidenziare alcuni casi in
cui sarebbe consigliabile l’estensione delle indagini all’intero corso d’acqua e l’impiego mirato di
analisi chimico fisiche.
L’ambiente maggiormente compromesso è quello dell’Olona M. dove, sia in estate che in inverno,
si osservano effetti cronici (mortalità a lungo termine, riduzione significativa dell’accrescimento e
della fertilità) e biostimolazione per tutti i semi impiegati nel test di germinazione ed allungamento
radicale. Il test di genotossicità mostra inoltre un alto numero di micronuclei.
Il Sesia invece, risulta molto compromesso in estate mostrando fitotossicità per tutti i semi,
mortalità a lungo termine e riduzione dell’accrescimento e della fertilità, fenomeni che si attenuano
nella stagione invernale.
Accanto a fenomeni di fitotossicità e di tossicità cronica, è apparsa preponderante la
biostimolazione. Questo fenomeno, che internazionalmente è noto come Ormesi, recentemente ha
destato parecchio interesse ed il dibattito è tutt’ora aperto. E’ noto infatti come attività deboli di uno
stressore possano determinare un incremento del livello metabolico (Calabrese, 1994). Questo
fenomeno, di per sé innocuo, è considerato da alcuni autori (Cairns e Niederlehner, 1995) un
segnale di incipiente tossicità.
In questo lavoro la biostimolazione non è stata valutata in maniera univoca, ma le risposte degli
organismi sono state interpretate e discusse sulla base del confronto con le esperienze reperite in
bibliografia.
CONCLUSIONE
Il D.L. 152/99 individua una batteria di test di tossicità acuta e cronica con diversi organismi, da
applicare a campioni acquosi e/o sedimenti per la classificazione dello stato di qualità dei corpi
idrici. Questa valutazione tossicologica, pur precedente all’uscita del D.L., è in linea con quanto
previsto dallo stesso.
L’indagine è stata condotta volutamente a maglie molto larghe: 11 stazioni a chiusura dei più
importanti bacini della Provincia di Pavia e 2 stazioni sul Po, in ingresso ed in uscita dalla provincia
stessa.
Il fine di questo studio non è tanto cogliere l’impatto delle sorgenti puntiformi di inquinamento
(singoli scarichi), quanto contribuire, con gli strumenti messi a disposizione dall’ecotossicolgia, al
quality assessment dei corsi d’acqua superficiali di un’area a scala provinciale.
I risultati raccolti vanno a sostegno dell’approccio impiegato, che è stato dettato dalla volontà di
unire l’utilizzo di organismi diversi con la praticità ed il basso costo di allestimento delle prove,
nell’ottica di un loro impiego rutinario per il controllo sistematico dei corsi d’acqua.
Infine l’impiego delle diverse matrici ha permesso di individuare che i sedimenti rappresentano il
comparto più significativo per una valutazione della qualità ambientale.
BIBLIOGRAFIA
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