Microbiologia - Cellula Batterica

Microbiologia - Cellula Batterica
cellula batterica
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raggruppamenti
morfologici
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cromosoma
batterico
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ribosomi
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PROF MILICI
March 14, 2012
• microorganismi procarioti (un nucleo non cirdondato da una membrana nucleare, hanno un
unico cromosoma circolare nel citoplasma), mancano tutti i sistemi vescicolari tipici delle
eucariotiche. abbiamo però i ribosomi, sede di sintesi proteica. il citoplasma è racchiuso dalla
membrana citoplasmatica e da una parete batterica.
• dimensione da 2-50 micron, possono essere osservati con il microscopio ottico
• il metabolismo batterico +è molto rapido, tranne che per qualche particolare specie. il tempo di
generazione standard dei batteri è di 15-20 minuti.( fa eccezione il bacitto della TBC che ha un
tempo di generazione di circa 48 ore, quindi significa che ha bisogno di molto tempo per crescere,
servono 60gg per isolarlo.)
• tempo di generazione: tempo che intercorre tra una divisione cellulare e la successiva.
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• morfologia:
• i batteri possono avere forma: sferica (cocchi) a virgola (vibrioni) allungata (bacilli, che sono
tutti gli enterobatteri, il bacillo della tbc) a spirale (spirilli, spirochete). coccobacilli: ne sferico ne
allungato.
• i cocchi sono di forma sferica, e possono essere singoli o uniti (diplococchi, tetradi, streptococchi
(lineari) stafilococchi)
• i diplococchi possono raggrupparsi grazie alla loro parte terminale leggermente arrotondata che
facilita l'associazione (es. pneumococco)
• i cocchi si dividono ma le cellule rimangono unite, formando lunghe catene streptococchi
• se i cocchi si dividono secondo piani irregolari, rimanendo ammassati a grappolo abbiamo gli
stafilococchi
• i raggruppamento dei bacilli sono anche essi vari: a v, a palizzata etc...
• possono formare gli streptobacilli se si dividono per piani paralleli, rimanendo uniti.
• gli spirilli hanno una struttura rigida, con poche spire, le spirochete sono sflessibili con molte
spire (agente della sifilide treponema pallidum o spirochete pallidum)
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• oltre al cromosoma, in alcuni batteri, abbiamo dei fattori genetici extracromosomici: plasmidi.
questi presentano dei geni che codificano per la produzione di tossine e per la resistenza ad
antibiotici.
• una caratteristica fondamentale dei plasmidi è quella di replicarsi indipendetemente dal
cromosoma batterico e di trasferirsi da una cellula all'altra tramite fenomeni di coniugazione
(soprattutto nei gram negativi, che sono dotati dei pili sessuali: che sono pili cavi, strutture
accessorie, mediante i quali si trasferiscono geni da un batterio donatore ad uno ricevente)
• un batterio che normalmente non è resistente ad un farmaco può acquisisre resistenza tramite
trasferimento di geni da altri batteri tramite i pili sessuali.
• i fattori genetici extracromosomici quindi hanno la caratteristica di replicazione autonoma e
possono essere trasferiti per coniugazione.
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• tra i ribosomi batterici e quelli della cellula eucariotica c'è differenza per dimensione. quelli della
cellula superiore hanno coefficente di sedimentazione 80, quelli del batterio hanno coefficiente di
sedimentazione di 70. questo "peso" diverso è un vantaggio, perchè alcuni antibiotici possono agire
selettivamente sul ribosoma batterico risparmiando i ribosomi eucariotici, ostacolandone la
funzione.
• mentre i ribosomi delle cellule superiori aderiscono al RER, quelli citoplasmatici sono situati
liberi nel citoplasma in vicinanza della membrana batterica.
• possono essere suddivisi in una sub 30s e una 50s.
• la sub 30s è costitua da un rna (16s) e 21 proteine chiamate l1 l2 l3 etc...
• la sub 50 è formata due rna (5s e 23s) e 34 proteine chiamate s1 s2 s3 etc...
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membrana
citoplasmatica
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meccanismi di
trasporto
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altre funzioni di
membrana
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• circonda il citoplasma e analogamente a quella delle cellule superiori è costituita da un doppio
strato fosfolipidico. i lipidi idrofobi sono rappresentati da acidi grassi. mentre le teste idrofile si
trovano all'interno e all'esterno del batterio, le code si trovano al centro della membrana. la
differenza tra la cellula eucariotica e procaritica è l'assenza di steroli. (non gli interessa il
trasporto delle sostanze).
• vi sono delle proteine trans membrana, responsabili del trasporto di sostanze nutrienti verso
l'interno anche contro gradiente di concentrazioene.
• la membrana citoplasmatica ha funzione di regolazione di scambi metabolici tra interno e esterno
della cellula trasportando sostanze con diversi meccanismi:
• diffusione passiva, diffusione facilitata, trasporto attivo, traslocazione di gruppo.
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• DIFFUSIONE PASSIVA: trasporto dall'esterno a maggior concentrazione, verso l'interno,secondo
gradiente di concentrazione. questo procedimento non richiede dispendio energetico. l'ossigeno
viene trasferito con tale meccanismo.
• DIFFUSIONE FACILITATA: molto simile al primo trasporto, ma in questo caso la sostanza da
trasposrtare si lega ad un carrieri proteico. il glicerolo penetra con tale meccanismo
• TRASPORTO ATTIVO: fa penetrare sostanze contro gradiente di concentrazione. le sostanze che
penetrano grazie al trap attivo sono amminoacidi, ioni inorganici, acidi organici etc...
• TRASLOCAZIONE DI GRUPPO: simile al trasporto attivo, solo che le sostanze trasportate subiscono
una trasformazione chimica durante il trasporto. ad esempio: glucosio, mannosio,
n-acetilglucosammina prima di essere trasportate vengono fosforilate.
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• nella membrana vi sono anche delle proteine che assolvono alla funzione mitocondriale. la
fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri nelle cellule eucariotiche. nei batteri, i mitocondri
sono assenti e proteine di membrana assolvono a questa deficienza.
• un'altra caratteristica è che la membrana presenta una invaginazione detta MESOSOMA, che si
trova al centro della cellula batterica. questo è importante perchè pare abbia un ruolo
fondamentale nella ripartizione del materiale genetico dopo la divisione cellulare.
• la membrana batterica è sede di proteine molto importanti: permeasi (trasporto di sostanze
nutritive all'interno e di enzimi all'esterno); proteine biosintetiche (sintesi di lipidi di membrana,
peptidoglicani, acidi tecoici, lipopolisaccaridi); proteine respiratorie (sintesi di ATP durante il
trasporto di elettroni).
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2
parete cellulare
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parete cellulare
(gram positivi)
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• una caratteristica peculiare della cellula batterica è la presenza della parete batterica che
conferisce caratteristiche particolari al batterio:
• la parete batterica innanzi tutto conferisce la morfologia al batterio; protegge la cellula dalla
lisosmotica: all'interno della cellula batterica vi è una pressione osmotica molto piu alta di quella
delle cellule eucariotiche, quindi vi sarebbe un richiamo d'acqua dall'esterno all'interno che
farebbe scoppiare la cellula. la parete batterica ha anche delle caratteristiche di colorazione: a
seconda della colorazione possiamo capire che tipo di parete ha il batterio,se positivo o negativo
alla colorazione gram: di conseguenza possiamo sapere a quali sostanze è più debole.
• questa parete è costituita fondamentalmente dal peptidoglicano, che a sua volta è rappresentato
dall'alternarsi di due amminozuccheri che sono: la N-Acetilglucosammina e l'acido
N-Acetilmuramico.
• questi due amminozuccheri sono legati tra loro da un legame beta 1,4 glucosidico (tra due
dimeri di n-acetilglucosammina e acido muramicoil legame è beta 1.6 glucosidico).
• sul legame beta 1,4 glucosidico agisce un enzima che è il LISOZIMA, che si trova nella saliva, nelle
lacrime, nell'albume dell'uovo; quando agisce il lisozima si ha uno scompaginamento del
proteoglicano
• dall'acido muramico si diparte una catena tetrapeptidica rappresentata (in ordine) dalla
l-alanina, acido diglutammico, l-lisina (in alternativa acido mesodiamminopimedico) e in
fine la d-alanina.
• i due amminozuccheri si alternano in maniera costante formando lunghi filamenti costituiti da
20-30 amminozuccheri, e questi filamenti sono tenuti insieme da legami detti legami crociati, che
si stabiliscono tra il 3° amminoacido di una catena e il 4° dell'altra (tra l-lisina e d-alanina).
• gli amminoacidi sono destrogiri (gli amminoacidi umanin sono levogiri); notiamo la presenza di
amminoacidi che non rientrano tra i 20 umani, in particolare l'acido mesodiamminopimedico.
• i vari elementi del peptidoglicano verranno formati in sede citoplasmatica. vengono quindi
trasportati all'esterno della membrana citoplasmatica tramite un vettore chiamato
undecaprenolo (o bactoprenolo), un lipide a lunga catena. questo carrier lipidico permette di
superare la parete idrofobica.
• quando tutti i componenti della parete si troveranno fuori dalla membrana verranno assemblate
dalle transpeptidasi (legami tra il 3 e il 4 amminoacido della catena tetrapeptidica) e dalle
transglicosilasi (legame tra acido muramico e l-alanina).
• quando gli elementi sono stati assemblati, il residuo della vecchia parete è un segnale chimico per
la cellula, per il quale vengono sintetizzati enzimi detti autolisine, che hanno il compito di
disgregare la vecchia parete cellulare per permettere alla cellula di dividersi. le autolisine
comprendono due tipi di enzimi: le amidasi (scindono il legame tra l'acido muramico e la
l-alanina) e le glicosilasi (scindono il legame tra monomeri o dimeri di acido muramico e
n-acetilglucosammina).
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• la parete dei gram positivi è costituita da due filamenti di proteoglicani (molto sottile rispetto
quella dei gram negativi).
• mentre nei gram negativi, il legame tra 3 e 4 amminoacido della catena tetrapeptidica sono
diretti, nei gram positivi possono essere sia diretti che mediati da un ponte di pentaglicina (5
molecole di glicina).
• nei gram positivi oltre al peptidoglicano abbiamo gli acidi teicoici. gli acidi teicoici sono dal punto
di vista chimico dei polimeri di glicerolfosfato (triolo esterificato con acido fosforico) e
ribitolfosfato (pentolo). possiamo anche avere acidi lipoteicoici, e sono attaccati alla membrana
plasmatica fungendo da ponte tra membrana e parete.
• gli acidi teicoici stimolano una funzione immunitaria dell'organismo ospite; grazie alle loro
cariche si oppongono all'ingresso di sostanze nocive favorendone quello delle sostanze nutritive,
in oltre sono importanti per la stabilità della membrana. si oppongono anche all'azione delle
autolisine.oltre al peptidoglicano abbiamo gli acidi teicoici. gli acidi teicoici sono dal punto di vista
chimico dei polimiri di glicerolfosfato (triolo esterificato con acido fosforico) e ribitolfosfato
(pentolo). possiamo anche avere acidi lipoteicoici, che sono attaccati alla membrana plasmatica
fungendo da ponte tra membrana e parete.
• gli acidi teicoici stimolano la funzione immunitaria dell'organismo ospite; grazie alle loro cariche
elettriche si oppongono all'ingresso di sostanze nocive favorendone quello delle sostanze nutritive,
in oltre sono importanti per la stabilità della membrana. si oppongono anche all'azione delle
autolisine.
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3
parete cellulare
(gram negativi)
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endotossine ed
esotossine
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• nei gram negativi, invece degli acidi teicoici abbiamo una membrana esterna, uguale a tutte le
membrane biologiche dal punto di vista chimico: costituita cioè da un doppio strato fosfolipidico.
• fra la seconda membrana ed il peptidoglicano c'è sempre uno spazio detto spazio periplasmico.
• la differenza tra membrana superficiale e profonda dei gram negativi è che nella membrana
esterna c'è la presenza di proteine dette PORINE, che sono dei canali acquosi, carichi
negativamente. esse sono responsabili di trasporto di alcune proteine.
• la membrana esterna dei gram negativi delimita lo spazio periplasmico che, verso l'interno, è
delimitato dalla parete cellulare; si oppone all'azione della fagocitosi e all'azione del complemento;
si oppone all'ingresso di sostanze nocive per il batterio, come proteine leucocitarie, antibiotici, sali
biliari, enzimi digestivi dell'ospite. permette il transito di sostanze nutrienti e ostacola l'ingresso di
sostanze tossiche.
• le porine sono classificabili in: porine non selettive e porine selettive.
• le porine non selettive fanno passare qualsiasi sostanza le cui dimensioni siano compatibili con il
loro diametro.
• le porine selettive sono in comunicazione con pompe a trasporto attivo presenti nella membrana
citoplasmatica INTERNA (non quella esterna), e quindi lasceranno passare solo i substrati
compatibili con le quelle pompe.
• nella membrana esterna dei gram negativi vi sono dei complessi importantissimi: come il
lipopolisaccaride LPS.
• LPS è distinguibile in due frazioni:
• Lipide A ha una funzione di tipo endotossico (corrisponde alle endotossine dei gram negativi), è
una porzione polisaccaridica, responsabile delle caratteristiche antigeniche dei gram negativi,
(antigene O): è quindi il responsabile della risposta immunitaria. Il lipide A è formato da acido
palmidico, milistico e stearico.
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• Cosa sono le endotossine? sostanze di natura lipopolisaccaridica prodotta dal batterio, che non viene
riversata fuori dalla cellula, ma ne rimangono all'interno, quindi vengono liberate al momento della lisi della
cellula. sono termoresistenti, agiscono a grandi dosi, e si differenziano dalle esotossine.
• Invece, le esotossine sono sostanze di natura proteica (quindi termolabili), prodotte dal batterio e riversate
all'esterno del batterio stesso. le esotossine agiscono anche a piccole dosi.
• le esotossine hanno meccanismo d'azione specifico (ogni tossina ha un meccanismo specifico); le endotossine
hanno tutte lo stesso meccanismo d'azione: sono dei pirogeni, cioè inducono febbre perchè agiscono sul centro
della termoregolazione, danno disturbi intestinali, provocano diminuzione di leucociti e piastrine, necrosi dei
tessuti, vasodilatazione e vasopermeabilizzazione con emorraggie puntiformi (petecchie), ipotensione, shock
emorraggico e morte.
• un'altra differenza importante tra le eso e le endo tossine è che le esotossine essendo termolabili, possono
essere trattate con il calore o con il formolo, per trasformarle in anatossine (o tossoide).
• per definizione l'anatossina è quella tossina che ha perso il potere tossico, ma ha comunque il potere
antigenico. quindi le anatossine possono essere utilizzate a scopo profilattico (per fare vaccini).
• le endotossine non possono essere trasformate in sostanze profilattiche, perchè sono sostanze di natura
lipidica e non possono essere trattate con il calore.
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4
strutture
accessorie: capsula
e glicocalice
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• alcuni batteri posseggono certe caratteristiche che altri non posseggono. queste strutture sono
dette accessorie, e sono rappresentate da capsula flagelli spore
• CAPSULA: struttura all'esterno della parete batterica il cui spessore molto spesso supera quello
della cellula batterica; non si colora (quando pensiamo di avere a che fare con batteri capsulati
ricorriamo ad una colorazione negativa con inchiostro di china. avremo quindi il batterio ed il
campo sostante colorato di nero, e la capsula apparira come alone incolore).
• il GLICOCALICE presente nei batteri è costituito da uno strato di fibrille molto lasse che oltre a
consentire l'adesione dei batteri alle mucose dell'ospite forma una specie di biofilm, che ingloba i
batteri e li difende dall'aggressione da parte di sostanze antibatteriche che si trovano
nell'ambiente circostante.
• il glicocalice può evolvere in alcuni batteri verso la formazione di una vera e propria capsula, ma
solitamente queste due strutture non coesistono.
• sia capsula che glicocalice facilitano quindi l'adesione e la successiva colonizzazione dei tessuti
dell'ospite; in particolare la capsula è responsabile dei processi morbosi causati dai batteri, perchè
si oppone alla fagocitosi (che fanno parte della componente aspecifica della difesa del nostro
organismo).
• per fare un esempio di germe capsulato che verra studiato nella parte speciale lo (Staphilococcus
Pneumoniae) PNEUMOCOCCO può provocare la polmonite grazie alla presenza di questa struttura,
considerato fattore di virulenza, perchè a parità di batterio patogeno, un batterio capsulato è più
virulento.
• virulenza: a parità di potere patogeno, virulenza è la capacità di indurre un grado maggiore di patogenicità
• oltre al pneumococco altri batteri che possiedono la capsula sono la Klepsiella Pneumoniae, Bacillo
del Carbonchio, Meningococco.
• dal punto di vista chimico la capsula è di natura polisaccaridica, ad eccezione del bacillo
del carbonchio che presenta una capsula di natura peptdicica, cioè costituita da polimeri di
acido diglutammico.
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strutture
accessorie: flagelli
pili e spore
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• FLAGELLI, adibiti a locomozione, hanno forma cilindrica, diametro di 20nm e una lunghezza di
circa 15-20 micron. a seconda della disposizione che hanno nei batteri possiamo distinguere
batteri monotrichi (vibrione del colera) batteri lofotrichi (ciuffo di flagelli localizzati ad un polo
della cellula), batteri peritrichi (con tutta la superficie cellulare se hanno tutta la superficie
cellulare ricoperta di flagelli) e batteri atrichi.
• i flagelli sono costituiti da un composto proteico: la FLAGELLINA. studi al M.E: hanno consentito di
evidenziare la struttura del flagello la quale è costituita da molecole di flagellina che aggregandosi
variamente formano lunghe catene elicoidali dal cui intreccio si origina il cosiddetto filamento
nella parte basale. il filamento si lega alla parete batterica tramite un sistema di dischi
sovbrapposti che costituiscono il corpo basale. mentre prende il nome di uncino il breve segmento
che collega il filamento al corpo basale.
• la sintesi dei flagelli è molto complessa in quanto prevede l'intervento di circa 20-30 geni: uno
codifica per la flagellina, gli altri codificano per l'uncino e il corpo basale.
• il movimento dei flagelli è dovuto alla chemiotassi (movimento orientato e indotto da un
composto chimico che provoca la rotazione di questa struttura molto rigida).
• nei batteri gram positivi, che non hanno flagelli, o in alcune spirochete il movimento è dovuto:
nei gram-positivi ai moti browniani, cioè all'urto delle molecole del fluido in cui sono immersi i
batteri; mentre nei secondi il movimento è dovuto ad un sottile filamento localizzato ad un polo
della cellula.
• alcuni batteri non patogeni per l'uomo si muovo per strisciamento, cioè per contrazione di sottili
filamenti, originanti da piccole sfere poste sulla parete batterica.
• I flagelli possono essere eliminati da un batterio, perchè sono di natura proteica, e con il calore possono
essere degradate. verranno studiati dei batteri flagellati che verranno privati dei flagelli, e l'allontanamento
di queste strutture verrà utilizzato nella diagnostica virologica.
• I PILI o FIMBRIE sono organi di adesione (l'adesività è il primo passo per esprimere il potere
patogeno: un batterio prima di penetrare nell'organismo ospite deve prima ADERIRE). queste
fimbrie sono più rigide e piccole, ma comunque di natura proteica, composte da PILINA.
• distinguiamo pili sessuali (responsabili del trasferimento di geni (o virus) da un batterio all'altro
mediante fenomeni di coniugazione) e pili comuni (o fimbrie), atti a permettere l'adesività ai
tessuti dell'ospite.
• Le SPORE hanno funzioni molto importantiperche sono molto resistenti anche alle grandi
temperature, e possono germinare. le spore rappresentano forme di resistenza del batterio in
condizioni ambientali sfavorevoli (alterazioni di pressione, temperatura, ph). la spora può avere
diverse forme (sferica o allungata), può deformare il corpo batterico perche spesso si trova
all'interno al centro del batterio, e dato che può avere dimensioni superiori al batterio stesso può
indurne la deformazione. resistono per molti anni (si sono trovate spore batteriche in mummie
egiziane, che sono state in grado di germinare).
• date le particolari caratteristiche morfologiche, la spora è una particolarità esclusiva dei batteri
gram-positivi
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6
spora,
sporulazione e
germinazione
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• la spora è composta dall'esterno all'interno come segue:
• esosporio: uno strato lipoproteico molto sottile che non sempre è presente
• tunica: costituita da un doppio strato proteicoin cui sono abbondanti i gruppi disolfuro S-S
• corteccia: costituita da un doppiostrato di peptidoglicano con un numero di legami crociato
sicuramente inferiore a quello presente nella parete dei gram positivi. questo strato di
peptidoglicano ci indica che la spora può essere soltato presente nei gram-positivi (perche lo
strato di peptidoglicano dei gram negativi è molto sottile)
• nucleo:circondato ed immerso nel citoplasma; presenta l'acido dipicolinico, presente sotto forma
di sale (dipicolinato di calcio), di cui la cellula si arricchisce durante il processo di sporulazione
(infatti non è mai presente nella cellula vegetativa). questo sale conferisce alla spora resistenza
all'essiccamento.
• il processo che porta alla formazione di una spora da un batterio è detto sporulazione.
• il processo che porta alla formazione di un batterio da una spora è detta germinazione.
• funzione della spora - Esempio pratico: il bacillo del tetano vive nell'intestino dei grossi animali,
nell'ambiente esterno non può vivere perchè è anaerobio obligato. quando viene espulso con lo
sterco viene posto sotto forma di spora. nel caso in cui la spora entri in ferite nelle quali si
verificherà assenza di ossigeno (assenza di sangue) la spora può germinare e formare il batterio
che induce la patogenesi.
• come si forma la spora?
• inizia con la divisione dei cromosoma batterico: uno dei due cromosomi si circonda dei vari strati
della spora.
• la spora è molto resistente all'essiccamento, ai disinfettanti fisici e chimici, ai raggi UV. quindi
per eliminare spore da materiale patologico dobbiamo ricorrere a temperature di 121°C e pressione
di 760mmHg, che si può indurre in autoclave, dove si verifica un aumento di calore umido.
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7
colorazione di
Gram
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• è un test semplice ed efficace per distinguere tra le due principali classi batteriche ed iniziare una
terapia.
• per osservare i batteri dobbiamo utilizzare il microscopio ottico. per fare diagnosi di malattie
infettive, dopo il prelievo di materiale biologico è l'osservazione del materiale.
• l'esame può essere condotto in diversi modi:
• a fresco - consiste nel prelevare una piccola parte di materiale, metterla su un vetrino porta
ogetto, coprirla con un vetrino copri ogetto, e osservarla con il microscopio ottico. questo esame
da scarse informazioni: da informazioni solo sulla morfologia, sul raggruppamento morfologico,
sulla mobilità (perchè lavoriamo su batteri in vivo).
• le informazioni maggiori si hanno colorando il preparato.
• diciamo subito che i coloranti che adoperiamo in batteriologia devono essere necessariamente
coloranti BASICI perchè la cellula batterica è ricca in acidi nucleici, quindi basofila: alcuni coloranti
basici sono il blu di metilene, il cristalvioletto (violetto di genziana), la fucsina basica
fenicata (con acido fenico).
• Le colorazioni possono essere semplici o differenziali
• le colorazioni semplici comportano l'utilizzo di un solo colorante in un solo tempo.
utilizziamo il blu di metilene da solo, o il nero di china (vedi sopra) ma pur ottenendo delle scarse
informazioni.
• colorando non possiamo risalire al tipo di mobilità perchè affinchè possa iniziare la colorazione il
materiale deve essere prima fissato. una delle tappe della fissazione è l'uccisione dei batteri. quindi
non si muovono più (capitan ovvio).
• PROCEDURA PER LA COLORAZIONE SEMPLICE : una volta che preleviamo il materiale
patologico da esaminare lo stendiamo su vetrino portaoggetto, lo facciamo asciugare a
temperatura ambiente e lo fissiamo (3 volte alla fiamma):
• il fissaggio serve a fare aderire il materiale patologico al vetrino, che altrimenti, durante la
colorazione potrebbe essere asportato. il fissaggio rende i batteri piu permeabili alla colorazione, e
in oltre la fissazione, li uccide: l'uccisione dei batteri riduce la possibilità di infezione dell'operatore.
• a questo punto coloriamo con un solo colorante;
• laviamo con acqua;
• osserviamo al M.O. : SOLTANTO vedremo morfologia e raggruppamento
• le colorazioni che i microbiologi devono utilizzare in laboratorio sono quelle dette
differenziali, che comportano utilizzo di piu coloranti in piu tempi.
• un metodo di colorazione differenziale, messo a punto da un medico danese, Gram, che nel 1884
lavorava presso l'obitorio di Berlino, e utilizzo per primo questo metodo che serviva a differenziare
i batteri dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti.
• questo metodo viene oggi adoperato nei laboratori e ci consente di dividere i batteri in gram
positivi e negativi.
• i diversi comportamenti dei batteri in questa metodica di colorazione sono dovuti in gran parte
alla diversa composizione chimica e strutturale della parete cellulare.
• come procediamo? esempio pratico di COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM:
• paziente con ascesso, prelievo materiale patologico (materiale purulento, PUS), lo sistemiamo sul
vetrino, lo facciamo asciugare a temperatura ambiente o sotto una lampadina elettrica, lo fissiamo
3 volte alla fiamma di un becco Bunsen, procediamo alla colorazione.
• nella colorazione procediamo prima con il violetto di genziana, che colora la cellula in violetto.
• successivamente utilizziamo un mordente il reattivo di Lugol (contiene iodio e ioduro di
potassio). il mordete reagisce con il colorante formando un complesso difficilmente dissociabile
dalla successiva azione decolorante dell'alcool etilico.
• cosa succede?
• dopo l'utilizzo del Lugol, va utilizzato l'alcool, per pulire il composto, e si evidenziano le differnze
tra gram positivi e gram negativi.
• nei gram positivi, l'alcool ha difficoltà a penetrare nella parete batterica, e quindi la cellula
conserverà il violetto di genziana, che non può essere pulito
• nei gram negativi la paretenatterica ha piu strati, ma anche pori più grandi. l'alcool riesce a
entrare attraverso questi pori, e la sua natura a solubilizzare la componente lipidica della parete.
questa solubilizzazione comporta la detersione del colorante. a questo punto la cellula risulta
incolore.
• per evidenziare queste cellule incolori si utilizza un colorante di contrasto: la safranina. la
safranina colora tutti i gram negativi, riuscendo a permeare alla parete batterica dei gram negativi
e rimanendovi.
• i gram positivi sarano colorati in violetto per il violetto di genziana, i gram negativi saranno
colorati in rosso per la safranina
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colorazione di
Ziehl-Neelsen
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• è un metodo particolare per i micobatteri come il bacillo di Koch per la tubercolosi o il batterio
della lebbra, che a differenza del primo non è coltivabile in laboratorio, perchè non è stato ancora
trovato un terreno di coltura che soddisfi la sua richiesta nutrizionale.
• il batterio della lebbra viene meno ai postulati di Koch. questi dicono che bisogna isolare i
microrganismi da tutti i casi di malattia. e dopo essere coltivati in laboratorio in vitro, per essere inoculati in
animali da esperimento per creare lo stesso quadro clinico dell'uomo.
• Per alcuni batteri, i postulati di Koch possono essere disattesi, in quanto nell'uomo possono
provocare una certa sintomatologia mentre negli animali non inducono alcun tipo di risposta.
• Questo metodo di colorazione è peculiare per i micobatteri, in quanto questi sono batteri
acido-alcool resistenti.
• l'acido alcool resistenza è conferita da un enorme contenuto lipidico che si trova sulla
parete cellulare dei micobatteri; tra questi lipidi abbiamo delle cere (cera D, che si comporta da
immunoadiuvante, cioè coadiuva la risposta immunitaria); inoltre abbiamo i cosiddetti micosidi, ai
quali appartiene anche il cosiddetto fattore cordale (che fa parte degli acidi micolici della parete)
responsabile del raggruppamente a cordone che i micobatteri assumono in unterreno liquido.
• PROCEDURA:
• soggetto affetto da TBC,
• arriva richiesta di isolamento di bacillo tubercolare per una sospetta tubercolosi polmonare.
quindi bisgna ispezionare l'espettorato.
• viene messo il materiale sul vetrino, viene fatto asciugare, viene fissato per 3 volte alla fiamma e procedo
alla colorazione.
• il primo colorante da usare è la fucsina basica fenicata. questa è rossa.
• l'acido fenico viene posto sul vetrino insieme al colorante. l'acido fenico funge da
mordente. (in un solo passaggio si mette mordente e colorante)
• questa colorazione deve avvenire a caldo, fino allo sviluppo dei primi vapori, perchè a causa
del contenuto lipidico la fucsina non entra.
• a questo punto trattiamo la soluzione con acido solforico al 10% o acido cloridrico al 4%
(insomma acidi inorganici forti).
• questo trattamento induce la pulitura da dalla fucsina di altri batteri con la parete non
acido-alcool resistente.
• nonstante questo trattamento il micobatterio rimarra colorato in rosso per la fucsina,
perchè sia l'acido che l'alcol, dato lo spessore e la composizione della parete non riescono ad
entrare nel batterio.
• tutti i batteri che non sono acido alcool resistenti, venendoi privati della fucsina basica
fenicata, e rimanendo incolore, vengono quindi colorati con blu di metilene.
• se abbiamo micobatteri li troveremo colorati di rosso su sfondo blu; se non abbiamo mico batteri
troviamo solo sfondo blu.
• la tipologiadella parete dei micobatteri induce oltre l'acido alcool resistenza, anche una crescita molto lenta,
perchè i nutrienti hanno difficolta ad entrare. infatti per dare una risposta di diagnosi per il bacillo
tubercolare si devono aspettare almeno 60gg, perchè la crescita potrebbe essere molto lenta, e un risultato
negativo, potrebbe diventare positivo.
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9
colorazione di
Albert
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• peculriare per i corinebatteri (bacillo difterico)
• la difterite era un tempo causa di morte per i bambini che morivano di collasso cardiocircolatorio,
non per il batterio in se, che non è un bacillo invasivo (si ferma nella cavità orofaringea).
l'esotossina del bacillo invade tutti i parenchimi: rene surrene fegato e cuore, che si sfianca e cessa
di pompare.
• la vaccinazione antidifterica è obbligatoria, è costituita da anatossina (o tossoide). cioè esotossina trattata
con calore che perde potere patologico ma mantiene il potere immunogenico.
• esempio pratico: sospetta difterite; tampone faringeo, si colora il materiale con il metodo di
albert.
• il bacillo difterico è caratterizzato dall'avere nel citoplasma dei granuli chiamati granuli
metacromatici. la metacromasia è una caratteristica che possiedono alcuni batteri i quali hanno la
capacità di colorarsi in maniera diversa dal colorante adoperato. in questo tipo di colorazione
utilizziamo una miscela di blu di toluidina e verde di metile.
• utilizziamo il reattivo di lugol come mordente in concentrazione doppia rispetto alla
colorazione di gram
• per il fenomeno della metacromasia i granuli citoplasmatici si coloreranno in violetto (virano
il blu al violetto per la metacromasia); mentre il corpo batterico si colorerà in verde pallido
(sempre per la metacromasia).
• oggi la difterite, grazie al vaccino obbligatorio, qui non esiste. eviteremo di parlarne, e ci dedicheremo ad
argomenti più attuali.
• queste nozioni servono perchè molto spesso in passato il medico per salvare il bambino doveva ricorrere ad
una tracheotomia, perchè a livello della trachea si formavano delle pseudomembrane dette CRUPT difterico,
che impedivano la respirazione.
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esame colturale
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• per fare diagnosi di malattie batteriche seguiamo sempre delle tappe: prelievo, esame
microscopico (informazioni su morfologia, raggruppamento morfologico, caratteristiche tintoriali
NON VITALITA); la seconda tappa è rappresentata dall'esame colturale.
• dopo l'arrivo di materiale clinico dobbiamo approntare dei terreni di coltura per permettere al
batterio causa della patologia di moltiplicarsi per studiarlo.
• dobbiamo predisporre dei terreni validi per la crescita, altrimenti il batteri non crescerà mai.
• i batteri hanno bisogno di fattori ambientali e di sostanze nutritive per crescere. in relazione alla
fonte di carbonio e di energia necessari per costruire le loro macromolecole i batteri possono
essere divisi in fotoautotrofo e fotoeterotrofi.
• i fotoautotrofi utilizzano la luce solare come fonte di energia, e come fonte di carbonio l'anidride
carbonica
• i fotoeterotrofi utilizzano come fonte di energia la luce solare, e come fonte di carbiono dei
composti organici
• chemioautotrofi: utilizzano come sorgente di energia dei composti inorganici, fonte di carboinio
l'anidride carbonica
• chemioeterotrofi: utilizzano i composti organici come fonti sia di energia sia di carbonio
• i batteri che hanno alte capacità biosintetiche, ma basse esigenze nutrizionali si accontentano di
un terreno definito minimo. deve contenere acqua, azoto, fosforo e i vari metalli.
• nei terreni di coltura dobbiamo sempre inserire delle fonti di carbonio (che generalmente è
rappresentata dal glucosio, che funge anche da energia) una fonte di azoto (rappresentata dai sali
di ammonio); una fonte di fosforo (per la biosintesi degli acidi nucleici) e dei metalli (rame ferro
manganese magnesio) che servono ad attivare i sistemi enzimatici batterici: se non funzionano gli
enzimi i batteri non possono biosintetizzare nulla.
• i batteri piu esigenti che partendo da questo terreno minimo non sono in grado di biosintetizzare
le loro molecole hanno bisogno di terreni complessi, che contengono dei fattori di crescita o
metaboliti essenziali;
• i metaboliti essenziali sono delle sostanze che il batterio non è in grado di sintetizzare, e
deve ricevere dall'esterno (vitamine, amminoacidi).
• un'altra differenza nell'ambito dei terreni di coltura è una differenza dal punto di vista fisico:
terreni liquidi e terreni solidi.
• un esempio di terreno liquido è il brodo di carne. (anticamente si otteneva bollendo la carne,
filtrandola, aggiustando il ph e aggiungendo il peptone , che è un derivato delle proteine. ora
esistono i liofilizzati).
• il principio del terreno liquido è che l'indice della coltura batterica è data dalla torbidità che
assume il liquido che all'inizio era limpido; non possiamo però sapere se si tratta di una sola specie
batterica o più specie.
• per avere più informazioni bisogna trasferire questi batteri in un terreno solido.
• il terreno solido utilizzato in laboratorio è l'agar nutriente: passa in funzione della temperatura
dallo stato solido a quello liquido. sopra i 45° è fluido, non si può utilizzare come substrato per i
batteri. sotto i 45° si può utilizzare per colture.
• l'agar di per ser non ha funzioni nutritive, è un polisaccaride solforato, diventa nutriente quando
si aggiunge il brodo.
• l'agar nutriente si ottiene aggiungengo al brodo il 2% di agar (un polisaccaride). l'agar imprigiona
il brodo nutriente costituendo un substrato sia nutriente che solido.
• nell'agar nutriente abbiamo la formazione di colonie.
• dalle colonie, a seconda della loro colorazione e della loro morfologia possiamo risalire alle varie
specie batteriche.
• a seconda delle esigenze batteriche utilizziamo dei terreni complessi.
• un esempio di terreno complesso è l'agar sangue.si ottiene aggiungendo all'agar nutriente il
2-5% di sangue di montone o di coniglio.
• questo si utilizza per la maggior parte dei batteri esistenti (monococchi, streptococchi,
stafilococchi).
• se aumentiamo la temperatura dell'agar sangue, per poi riportarla sotto i 45°, otteniamo il
cosiddetto sangue cotto, o agar cioccolato (per la caratteristica colorazione); in questa maniera
avviene la lisi di globuli rossi per avere più emoglobina disponibile.
• terreno chimicamente definito: terreno di cui conosciamo l'esatta composizione chimica delle sostanze, e
viene adoperato per studiare il metabolismo dei batteri
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terreno di
trasporto
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terreno di
arricchimento
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terreno selettivo
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terreno
differenziale
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• se vogliamo trasportare in laboratorio materiale clinico, per il mantenimento di germi vivi
dobbiamo utilizzare un terreno di trasporto, per mantenere le reciproche concentrazioni di batteri
presenti, ne mantengo soprattutto la vitalità, non permettendo la loro moltiplicazione.
• il trasporto è caratterizzato dall'assenza di fattori di crescita, di soluzioni saline tampone.
altrimenti le colonie si moltiplicherebbero, e non possiamo più utilizzare le specie che ci
interessano
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• il terreno di arricchimento è liquido, e ha lo scopo, partendo da un materiale polimicrobico, di
isolare solo una specie.
• ESEMPIO: tifo addominale - dobbiamo ricorrere deal terreno di arricchimento, per far aumentare
la popolazione solo dei batteri patogeni, e che lasci inalterata la popolazione di latri batteri
intestinali.
• il terreno di arricchimento in questo caso è rappresentato dal brodo nutriente al selenito di
sodio.
• in questo terreno manteniamo costanti le concentrazioni degli altri germi presenti (che fanno
parte della popolazione microbica intestinale) e privilegiando la crescita logaitmica dei batteri
patogeni che vogliamo isolare.
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• è un terreno solido, che ci consente di isolare alcune specie patogene svantaggiando la
crescita di batteri concomitanti o contaminanti.
• se io voglio isolare da un campione di feci una salmonella tiphi, devo ricorrere ad un terreno di
arricchimento (che è liquido) e ad un terreno selettivo (che è solido).
• sia terreno di arricchimento che terreno selettivo hanno funzione selettiva in quanto favoriscono solo una
specie determinata.
• il tereno selettivo per salmonella e shighella (detto terreno SS) è costituito da sali biliari
(eliminano i batteri gram positivi), lattosio (che viene fermentato SOLO da batteri non patogeni
come proteus o e.coli), un indicatore del pH (il rossofenolo) e dei sali di piombo: questi sono
importanti perchè la salmonella tiphi ha la capacità di formare il solfuro di idrogeno. questo sale
interagisce con i sali di ferro o piombo, precipitando in solfuro di piombo o di ferro, e
conferendo alle colture di samonella un colore nerastro. in questo modo potremmo identificare
le colonie incolore di shighella e le colonie nere di salmonella.
• in questi tipi di terreni non abbiamo altri batteri oltre quelli per cui si creano situazioni idonee
per la crescita (per questo è detto terreno selettivo).
• il terreno di Saboureaud è un tipo di terreno selettico che consente la crescita dei miceti
lievitiformi o filamentosi escludendo i batterio perchè contiene un alta concentrazione di
glucosio e un pH molto acido intorno a 4,5 - 6. (il ph ottimale per i batteri è 7.2 - 8, un ph così
basso favorisce l'uccisione dei batteri).
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• è un terreno che consente in laboratorio di discriminare tra i batteri lattosio-fermentanti e non
fermentanti (funge anche da terreno selettivo)
• il terreno differenziale più utilizzato in microbiologia è il terreno Mac Conkey.
• uso questo terreno se parto da un materiale polimicrobico e devo capire se i batteri che ho isolato
fermentano il lattosio (quindi non patogeno) o non lo fermentano (patogeni).
• in questo terreno lo zucchero chiave è il lattosio, bisogna anche usare un indicatore di ph ( il
rossoneutro, che tingerà le colonie in presenza di bassi pH), dei sali biliari (che inibiscono la
moltiplicazione di gram-positivi).
• se il batterio fermenta il lattosio si ha produzione di acido, perciò le colonie si coloreranno di
rosso.
• se il batterio non fermenta il lattosio le colonie saranno incolore.
• questo può fungere anche da terreno selettivo perchè la presenza di sali biliari elimina i gram
positivi.
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terreno per gli
anaerobi
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• sono detti anaerobi i batteri che cerescono in assenza assoluta di ossigeno.
• in questi terreni vanno inserite delle sostanze riducenti come la cistenia, l'emina, tioglicollato che
allontanano l'ossigeno.
• Metodo microbiologico.
• Il terreno tioglicollato fluido è stato allestito da Brewer per la coltura rapida di anaerobi e aerobi.
• Il peptone di caseina è stato aggiunto da Vera nel 1944.
• Il terreno sostiene un buon livello di crescita per numerosi organismi, inclusi gli anaerobi stretti,
• senza incubazione in atmosfera anaerobica. Il tioglicollato di sodio, oltre a ridurre il potenziale di
ossidoriduzione, è in grado di neutralizzare l’attività antibatterica dei composti del mercurio.
• Queste caratteristiche rendono l’FTM particolarmente utile per stabilire la presenza di contaminanti nei
materiali biologici e di altro tipo. Questa formula, grazie alla sua capacità di stimolare la crescita, è stata
adottata dalla farmacopea statunitense (USP), dall'AOAC e dalla farmacopea europea (EP) per i test di
sterilità e come terreno di arricchimento.
• Il terreno tioglicollato fluido è ampiamente usato in microbiologia clinica anche come arricchimento, in
particolare per i campioni prelevati da siti corporei normalmente sterili.
• BD Fluid Thioglycollate Medium, avendo un basso potenziale di ossidoriduzione, non è il terreno di scelta per
gli aerobi stretti, ad es. non fermentanti, Micrococcus e organismi simili.
• Per questi organismi, utilizzare Tryptic Soy Broth o brodo di infuso cuore-cervello.
• BD Fluid Thioglycollate Medium contiene glucosio, peptone ed estratto di lievito, che forniscono i fattori
necessari per la crescita batterica. Tioglicollato di sodio e L-cistina sono
• agenti riducenti che impediscono l’accumulo di perossidi, che risultano letali per alcuni microrganismi. La
resazurina è un indicatore di ossidoriduzione che vira al rosa se viene
• ossidata, mentre appare incolore se viene ridotta. Il piccolo quantitativo di agar contribuisce a tenere basso
il potenziale di ossidoriduzione, stabilizzando il terreno rispetto alle correnti di
• convezione, per mantenere l’anaerobiosi negli strati più profondi del terreno. Spesso il terreno tioglicollato
fluido appare lievemente opaco per il suo contenuto di agar. Durante l'allestimento, questo terreno pronto
all'uso viene sottoposto a un getto di azoto, che scolora l'indicatore resazurina. Il terreno, tuttavia, può essere
utilizzato finché non viene ossidato per circa il 30% (strato superiore), come indicato dalla colorazione rosa
della resazurina in prossimità della superficie. Se l’ossidazione ha superato tale livello, il brodo può essere
riscaldato una volta a vapore o in acqua bollente, raffreddato e utilizzato.
• La farmacopea statunitense permette la presenza di acqua nel glucosio (destrosio) e quindi include 5,5
grammi nella formula.
• Poiché la presenza di umidità è nociva per il terreno disidratato, viene aggiunto un quantitativo equivalente
di glucosio in forma anidra.
• quando dobbiamo processare un materiale anaerobio è opportuno operare sotto cappe con flusso
laminare, dove l'ossigeno viene sostituito con un gas inerte, che è l'azoto.
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condizioni
ambientali
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• se incubiamo il materiale biologico in condizioni non idonee non avremo mai formazioni di
colonie.
• i fattori ambientali essenziali sono: la temperatura, l'ossigeno, il pH, l'umidità, la pressione
osmotica.
• TEMPERATURA: tutti i batteri hanno un range tdi temperatura all'interno del quale c'è un
optimum al quale crescono. questo optimum è molto vicino al limite superiore di tolleranza (limite
di tolleranza: se aumentiamo la temperatura oltre il limite di tolleranza gli enzimi vengono
degradati, e i batteri non crescono).
• in funzione del comportamento dei batteri in funzione della temperatura li distinguiamo in
psicrofisi, mesofili e termofili
• gli psicrofili crescono a temperatura da 0 a 20 gradi centigradi. anche a -7 gradi. si trovano
nei oceani, nelle zone polari e nei cibi refrigerati o congelati. sono detti psicrofili perchè sono
amanti del freddo. questi non sono patogeni per l'uomo, ma possono contaminare gli alimenti
• i mesofili crescono dai 20 ai 40 con un optimum di 37°C. questi sono patogeni per l'uomo
• i termofili crescono ad alte temperatura 50 - 90 gradi. anche a 250°C. si trovano in acque
termali, in sorgenti di vapore. la loro termostabilità diende dalla sequenza e composizione in
amminoacidi dei loro enzimi. la sequenza degli amminoacidi è responsabile della comparsa di
legami forti, o legami a H, o altri legami deboli, che stabilizzano la struttura delle proteine.
• i termofili non possono crescere a temperatura ambiente; e i mesofili non a temperature basse.
MA siccome la maggior parte dei batteri che contamino gli alimenti, un abbassamento delle
temperatura evita una contaminazione dei cibi.
• le basse temperature generalmente non uccidono i batteri, ma bloccano la loro crescita. tornando
però in condizoni favorevoli riprendono la loro crescita.
• ESEMPIO: meingococco: molto sensibile anche alle basse temperature, anche quelle di frigorifero:
non le sopporta perchè va in lisi. il materiale va processato subito, non può essere conservato,
altrimenti il batterio può perdere la sua vitalità e non può essere studiato. ci sono dei mesofili che
in presenza di temperature intorno i 50°C muoiono.
• OSSIGENO ATEMOSFERICO: nei processi di respirazione, gli accettori finali di idrogenioni sono
molecole di ossigeno. alcuni batteri fanno a meno dell'ossigeno per la produzione di energia: fanno
uso della fermentazione. in questo modo usano invece dell'ossigeno un composto organico o
inorganico come recettore finale di idrogenioni.
• gli aerobi obligati sono il micobacterioum tuberculosis, che cresce solo in presenza di ossigeno.
• gli anaerobi obbligati non tollerano l'ossigeno perchè mancano dell'enzima catalasi. questo
serve a scindere il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno. quindi l'acqua ossigenata che si
accumula in processi metabolici si accumula, e la sua tossicità li uccide.
• gli aerobi e anaerobi facoltativi possono crescere in persenza o assenza di ossigeno. però
crescono sicuramente meglio in presenza di ossigeno ricorrendo quindi alla respirazione.
• in fine i microaerofili crescono a basse tensioni di ossigeno e gradiscono un elevata
concentrazione di anidride carbonica (fino al 10%).
• ESEMPIO: gonococco e meningococco, e l'agente eziologico della brucellosi Brucella Maelithensis.
• per favorire la crescita degli anaerobi, questi devono essere incubati in particolari strutture dette
giare o GAS PAK. in questi vi è del palladio, un generatore di idrogeno (che elimierà l'ossigeno
interagendo con esso e formando acqua). delle cartine imbevute di blu di metilene, che sono un
indicatore di anaerobiosi: inizialmente sono azzurre, quando non vi sarà più ossigeno le cartine
diventeranno bianche, e allora potremo incubare le piastre.
• pH: tutti i batteri hanno un optimum di pH. per la maggior parte dei patogeni è intorno la
neutralità: 6.8 - 7.2 ; il vibrione del colera ha un optimum di 8-10; i lieviti e le miceti hanno un pH
piu basso.
• nei terreni di coltura bisogna tenere il pH costante, perchè durante le attività metaboliche vi è un
aumento di pH. quindi abbiamo bisogno di sostanze tampone: fosfato monobasico di potassio e
fosfato bibasico di potassio, che mantengono il valore di pH il più possibile costante
• UMIDITA': l'acqua del terreno non deve trovarsi legata, ma deve essere libera in maniera che
possa essere usata dal batterio nei processi metabolici.
• ESEMPIO: agar 2% costituisce substrato solido ma contiene acqua libera; agar 15% costituisce
substratosolido ma trattiene tutta l'acqua
• PRESSIONE OSMOTICA: ha un valore importantissimo perchè l'acqua tende a passare da un
mezzo ipertonico a uno ipotonico. se non vi fosse la parete tutta l'acqua dei terreni di coltura
passerebbe dentro al batterio causando lisi. però vi sono batteri, come i lieviti, che sopportano alte
concentrazioni di zucchero, ma non sopportano alte concentrazioni di sali. al contrario gli alofili
sopportano alte contentrazioni di sali. se vogliamo coltivare batteri come i micoplasmi, che non
hanno parete, dobbiamo utilizzare delle soluzioni per evitare la lisi data dall'osmosi
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14
PROF MILICI
March 28, 2012
Microbiologia - Miceti
generalità
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cellula fungina
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parete fungina
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• struttura eucariotica, è quindi una cellula superiore. presenta un nucleo e sistemi vescicolari
presenti in una normale cellula superiore. hanno anzi una peculiarità rispetto ad una cellula
superiore.
• i miceti sono molto diffusi nell'ambiente esterno possono essere unicellulari o pluricellulari.
• sono immobili, si riproducono per mezzo di spore, che hanno un significato diverso dalla spora
batterica: la spora batterica ha un significato di resistenza, le spore fungine hanno significato di
tipo sessuale, infatti possono essere agamiche o sessuali.
• i saprofiti sono delle specie fungine ambientali; altre specie possono essere patogene sia per
l'uomo che per gli animali e i vegetali.
• la micologia medica è la branca della microbiologia che si occupa dei miceti patogeni
• i miceti causano i cosiddetti avvelenamenti che sono dovuti a ingesione di miceti macroscopici,
micotossicosi dovute all'ingestione di sostanze tossiche elaborate da alcune specie fungine
(Aspergillus flavus), forme allergiche, che sono secondarie ad una precedente esposizione ad
antigeni fungini (aspergillosi polmonare allergica), e le micosi che sono dovute alla penetrazione,
colonizzazione e invasione dei tessuti viventi.
• le micosi (malattie da funghi) si dividono in micosi superficiali, micosi cutanee, micosi del
sottocutaneo, micosi sistemiche.
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• Nucleo circondato da una membrana molto porosa.
• il numero di cromosom è difficile da determinare, ed è studiato solo nella candida albicans e
nell'aspergillus fumigadus (un lievito e una muffa) e sono 8.
• questi 8 cromosomi sono stati determinati tramite elettroforesi in campo pulsato. anche con
queste metodiche molto raffinate la loro determinazione risulta difficile per la produzione di
bande diverse da parte di cromosomi omologhi.
• il RE presenta delle vescicole che sono addossate alla membrana nucleare;
• l'apparato del golgi presenta delle lamelle che sono in prossimità di invaginazioni della
membrana citoplasmatica
• anche i mitocondri sono diversi da quelli delle cellule superiori, in quanto possono avere forma
allungata o sferica, presentano DNA, e i vacuoli citoplasmatici posseggono pigmenti e materiale
nutritivo, soprattutto glicogeno.
• ma la struttura peculiare della cellula fungina è la parete, che differisce da quella batterica.
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• il componente fondamentale è la chitina, un polimero della n-acetilglucosammina, con legami
beta 1,4-glucosidici.
• può essere unita a quote variabili di glucani (polimeri di glucosio) mannani (polimeri di
d-mannosio), lipidi e proteine.
• le protenie, grazie a residui di cisteina, e formazione di legami S-S contribuiscono alla solidità di
questa parete.
• in alcuni miceti (zigomiceti) avremo anche il chitosano. che è un polipeptide, polimero della
d-glucosammina.
• durante la fase di accrescimento la parete subisce varaizioni qualitative e quantitative dei
composti: si può considerare una struttura dinamica.
• queste cambia di forma e dimensione, e quindi occorre l'intervento di parecchi enzimi che sono
sia idrolitici che biosintentici: abbiamo infatti delle glucanasi, e glucano sintetasi, e chitinasi e
chitino sintetasi.
• la funzione della parete, analogamente a quella batterica, conferisce la morfologia alle cellule,
inoltre, grazie alla presenza dei mannani, aderisce alle mucose e ai tessuti dell'ospite (è quindi
responsabile de''adesività).
• ha delle caratteristiche antigeniche sempre grazie ai mannani, e inoltre modula la risposta
immunitaria si a umorale che cellulo-mediata.
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1
membrana fungina
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struttura
facoltatova
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• la membrana fungina si differenzia da quella degli eucarioti superiori per la mancanza di
coleresterolo;
• in sostituzione abbiamo l'ergosterolo: struttura tristratificata che regola gli cambi metabolici tra
citoplasma e ambiente extracellulare.
• in oltre contiene enzimi importanti per la biosintesi della parete fungina.
• membrana, che è molto spessa, dall'esterno verso l'interno troviamo:
• strato fibrillare
• mannoproteine
• i glucani
• uno strato di glucanochitina
• uno strato di mannoproteine di composizione diversa da quello precedente.
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• l'unica struttura facoltativa dei miceti è la capsula
• la capsula quali miceti la posseggono?
• in alcuni miceti, oltre alla parete sempre presente nei funghi, abbiamo una struttura accessoria di
natura polisaccaridica i cui componenti fondamentali sono i galattomannani e un altro
polisaccaride detto glucuronoxilomannano.
• l'unica specie fungina che possiede la capsula è il Cryptococcus neoformans. la capsula si colora
con colorazione negativa con nero di china.
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2
Corpo cellulare
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• il corpo di qualsiasi micete, unicellulare o pluricellulare prende il nome di tallo.
• del tallo funginoesistono diverse varietà morfologiche utili per l'identificazione della specie.
• i miceti hanno unamorfologia molto varia. il corpo tallofungino è costituito da elementi tubulari
chiamati IFE. le ife hanno diametro sempre uguale o superiore ad un micron.
• questo serve a distinguerli dalle microife di alcuni batteri il cui diametro è sempre minore di un
micron.
• le ife possono avere una cavità unica, e vengono dette IFE CENOCITICHE. Alcune IFE ossono
possederepiù cavità, dette setti, e vengono chiamate IFE SETTATE. anche nelle ife settate, il libero
scorrimento di sostanze, quali il citoplasma o acidi nucleici, da una cellula all'altra avviene grazie
ad un poro che si trova nella parte centrale di ogni setto.
• le ife settate possono essere mononucleate o plurinucleate.
• le ife crescono in senso apicale, e man mano che crescono si intrecciano tra loro e costituiscono il
cosiddetto micelio. il micelio è un insieme di ife intrecciate tra loro.
• in ogni colonia fungina, sia in ambiene naturale che in coltura distinguiamo due tipi di micelio:
• micelio aereo: a contatto con l'aria e deputato alla riproduzione della specie fungina perhcè
contiene spore sia gamiche che sessuali
• micelio vegetativo immerso: a contatto con il substrato, ha una funzione trofica, cioè serve ad
assumere le sostanze nutrive.
• i miceti che presentano IFE VERE ed un MICELIO VERO vengono detti miceti filamentosi, o muffe:
ad esempio l'asperggilus, il penicillus, i dermatofiti (responsabili di malattie cutanee).
• le muffe del pane, dei formaggi appartengono a questo gruppo perchè sono caratterizzate da un
micelio vero e ife vere.
• un secondo gruppo di miceti è rappresentato dai lieviti, o miceti lievitiformi, che presentano
corpo unicellulare. ogni cellula ha forma ovale o rotondeggiante.
• le cellule dei lieviti sono chiamate blastospore o blastoconidi perchè si riproducono per
gemmazione.
• quando le blastospore gemmano, formano delle lunghe catene che prendono il nome di
pseudoife, che si differenziano dalle ife vere, perchè ogni cellula che costituisce la pseudoifa, ha
una sua autonomia e non comunica con la cellula contigua.
• le pseudoife presentano dei restringimenti tra una blastospora e l'altra.
• questa scarsa connessione tra le pseudoife è causa della rottura di queste, dando luogo alle
singole blastospore che le costituivano.
• molto spesso l'operatore al M.O. ha difficoltà nella distinzione delle ife vere dalle pseudoife.
• però possono essere distinte grazie al fatto che solo le pseudoife presentano restringimenti tra le
blastospore; che nelle pseudoife nei punti di giunzione si formano dei grappoli di blastospore; e
mentre le ife vere hanno delle cellule terminali che sono più grandi delle precedenti, nelle
pseudoife le cellule terminali sono uguali o più piccole rispetto le altre.
• le pseudoife non si formano mai nelle muffe. i lieviti non sviluppano mai un micelio aereo perchè
sviluppano pseudoife, che si sfaldano in blastospore, non riuscendo a crescere.
• esempio di miceti lievitiformi: Candida (pur essendo un lievito, soltanto nella Candida albicans
possiamo avere le ife vere. vive nel nostro organismo, si trova nel cavo orofaringeo, nelle mucose
vaginali e gastrointestinali.esso è detto opportunista perchè diventa patogeno quando si è
sottoposti a terapia cortisteroidea, nei portatori di protesi dentarie, lunga somministrazione di
antibiotici, gli emodializzati, i portatori di cateteri); Malassetia furfur (micete che da quelle lesioni
che sono localizzate al livello di decolleté e si vedono soprattutto in estate. PTIRIASIS VERSICOLOR
.vive da commensale nella cute. analogamente alla candida, questo micete da commensale si
presenta come blastospore a grappolo d'uva. quando si presenta patogenico avremo la
contemporaena presenza di blastospore e pseudoife. la compresenza di questi due fattori è
sufficiente per diagnosticare la virulenza di questo micete. è indotto virulento da diversi fattori
come la gravidanza, l'eccessiva sudorazione, non è contagiosa).
• esempio: in seguito a vaginite si fa tampone vaginale e dopo osservazione si vedono blastospore.
ci si deve preoccupare? no, perchè essendo un commensale, le spore devono si trovano
normalmente in basse quantità. bisogna notare se ci si presentano pseudoife o ife vere, indice di
virulenza per la candida. quindi bisogna coltivare il materiale e vedere se la carica di candida è
elevata. altrimenti, se vi sono poche colonie è normale: la candida è un commensale del nostro
organismo. la candida diventa virulenta perchè vi sono dei fattori che permettono il passaggio
dalla fase di commensalismo alla fase di parassitismo.
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3
miceti dimorfi
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metabolismo dei
miceti
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• costituiscono un altro gruppo di miceti, che sono caratterizzati da una duplice morfologia:
lievitiforme e filamentosa o in relazione alle condizioni ambientali, o meglio in rapporto all'azione
patogena che essi svolgono.
• un esempio di micete dimorfo ci è Histoplasma capsulatum. Non ha una capsula, ma perchè il primo
ricercatore che l'ha isolato, per artefati di colorazione che simulavano una capsula, lo ha cihamato
così.
• questo fungo, nell'ambiente esterno, da saprofita, si presenta come una muffa, ed è caratterizzato
da ife settate, da micronidi (gli elementi infettanti), e macroconidi (dette anche aleurie) che
hanno una forma rotondeggiante, una parete molto spessa, e delle protrusioni radiali.
• in vivo, quando il micete da malattia (malattie molto gravi, letali) si presenta sotto forma di
lievito.
• un'altro esempio di dimorfismo è dato dal Coccidioides Immitis questo micete, in ambiente esterno
si presenta sotto forma di ife settate, e artroconidi (o artrospore) che sono gli elementi infettanti.
• in vivo, si presenta sottoforma di lievito, e più precisamente da delle sferule di forma
rotondeggiante, che sono dei lieviti.
• N.B. la candida, ma massetia sono dei lieviti, ma molto spesso li definiamo ERRONEAMENTE dimorfi
perchè da commensali diventano patogenici. il dimorfismo per questi due microorganismi riguarda
solamente la natura patogenica.
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• i miceti sono eterotrofi, e per costruire le loro macromolecole devono degradare sostanze
organiche.
• sono aerobi o anaerobi facoltativi, non esistono in natura miceti anaerobi obbligati, per cui
possono sia respirare che fermentare.
• come fonte di carbonio usano i composti organici, possono assimilare o fermentare molti
composti. queste prove di assimilazione e fermentazione vengono utilizzate per identificare le
specie funghine in laboratorio.
• la Co2 viene solo fissata, e non utilizzata come fonte di carbonio.
• come fonte di azoto usano nitrati o ammoniaca
• come fonte di fosforo utilizzano fosfati, e per lo zolfo utilizzano solfati.
• gli studi sul metabolismo dei miceti non sono ancora completi, ma sappiamo che le sostanze
liposolubili penetrano nella cellula fungina per diffusione passiva. le sostanze idrosolubili
penetrano attraverso pori che si trovano sulla membrana e sono trasportati da carrier proteici,
mentre gli amminoacidi e gli zuccheri penetrano per trasporto attivo, per cui c'è dispendio di
energia da parte della cellula.
• il trasporto degli amminoacidi è complesso, ed è finemente regolato dagli ioni ammonio degli
amminoacidi stessi. in particolare controllano gli enzimi metabolici, e molto spesso reprimono i
sistemi di controllo.
• per quanto riguarda i miceti dimorfi si è visto che l'eterotrofia è maggiore nella fase di
parassitismo; e durante il trasporto di amminoacidi si evidenzia ancora di più il loro cambiamento
morfologico (da muffa a lievito o vicecersa).
• i miceti si riproducono per mezzo di spore, sono corpuscoli che originano dal tallo, e sono in
grado di riprodurre la specie fungina purchè siano presenti adeguate situazioni nutrizionali ed
ambientali.
• i due tipi di riproduzione, sessuale ed agamica, si alternano in ogni specie fungina con ritmo e
frequenza diversi a seconda della specie.
• avviene nei funghi imperfetti (perchè usano spore dette spore imperfette).
• le spore agamiche, o imperfette, non differiscono morfologicamente dalle altre cellule del corpo
fungino.
• a seconda che siano prodotte da ife specializzate del corpo fungino, chiamate conidiofori, o
da ife vegetative comuni del corpo fungino: prendono il nome rispettivamente di conidi e
tallospore.
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4
riproduzione
agamica mediante
conidi
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• i conidi si formano per gemmazione dal conidioforo, il conidio si forma sempre all'apice del
conidioforo.
• il conidio può essere singolo, o può essere raggruppato lassamente o compattamente. quando
sono compatti prendono il nome di effluorescenze, mentre quando sono lassi prendono il nome
di capitoli.
• molto spesso possono essere raggruppati a formare delle catenelle, il cui elemento più giovane è
a contatto con il conidioforo, dato che si forma sempre per gemmazione.
• in altre specie il primo deriva per gemmazione dal conidioforo, e i successiviche si formano,
nascono sempre dai precedenti, per cui il più giovane è quello distale.
• in altre specie fungine i conidi si formano con madiltà diversa: si differenziano dentro cellule di
grosse dimensioni;
• nel primo caso si differenziano in cellule chiamte fialidi (perchè hanno forma di fiala), il fialide
può essere singolo o raggruppato insieme ad altri formando figure molto eleganti, complesse ad
esempio il genere penicillium; mentre se i fialidi si raggruppano in maniera compatta hanno
conformazione tipica il genere aspergillum.
• quando queste fialospore giungono a maturazione si riversano all'esterno, perchè si liberano
dalla porzione apicale del fialide. l'aspergillus è un micete opportunista: da delle patologie quando
le difese immuitarie sono compromesse (aspergillosi polmonare invasiva, aspergillosi polmonare
allergica, aspergilloma). prima questi miceti erano considerari dei semplici contaminanti, ma oggi
hanno assunto un ruolo fondamentale in alcune patologie come le micosi delle unghia.
• gli zigomiceti sono specie fungine che danno affezioni rinocerebrali molto spesso mortali le
zigomicosi, causate dagli zigomiceti, difficili da diagnosticare.negli zigomiceti le spore, o conidi, si
fidderenziano all'interno di una grossa cellula di forma rotondeggiante di nome sporangio, e le
spore che vi crescono vengono dette sporangiospore.
• lo sporangio si trova all'estremità di lunghe ife cenocitiche non settate [quando vedo ife cenocitiche
con formazione rotondeggiante capiscono che si tratta di spore di zigomiceti, e sono molto pericolose]
• quando le sporangiospore diventano mature si riversano all'esterno grazie alla lisi della parete
dello sporangio.
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5
riproduzione
agamica mediante
tallospore
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• a seconda della modalità di formazione le tallospore sono divise in:
• blastospore, derivano per gemmazione da un altra blastospora (si parla quindi di lieviti), o
eccezionalmente da una pseudoifa, o ancora meno frequentemente da una cellula terminale di un
ifa vera.la gemmazione delle blastospore avviene la migrazione del nucleo dalla cellula madre alla
cellula figlia, ingrossamento della gemma, fino al raggiungimento di dimensioni analoghe a quelle
della cellula madre, e in fine distacco della gemma per rottura della giunzione.
• artrospore sono spore di forma rettangolare definite da alcuni autori "spore a barella", derivanti
da frammentazione di ife settate, o per dissoluzione di cellule intercalari prive di citoplasma.
questa seconda modalità è tipica del Coccidioides Imitis. Le endospore rappresentano il mezzo di
riproduzione del C.Immitis. Questo presenta infatti riproduzione mediante endospore e
artospore.
• endospore: questo micete si forma sotto forma di lievito, e darà delle cellule di piccole
dimensioni chiamate sferule immature, all'interno delle quali le endospore si formano per un
processo di divisione nucleare, addensamento del citoplasma, neosintesi della parete e
trasformazione in cellule di maggiori dimensioni chiamate sferule mature. anche in questo caso,
quando le endospore sono mature si liberano per lisi della membrana, andando a contaminare altri
tessuti.
• aleurie sono spore agamiche, facilmente confondibili con i conidi, ma adifferenza dei conidi che
si formano dai conidiofori per gemmazione, le aleurie si formano per rigondfiamento o
trasformazione di cellule terminali del corpo fungino; di conseguenza non vengono eliminati
facilmente, ma si staccano soltanto in seguito alla rottura dell'ifa portante. dal punto di vista
diagnostico sono molto importanti le auleurie unicellulari, tipiche dell'Histoplasma capsulatum,
e aleurie pluricellulari, tipiche dei dermatofiti
• clamidospore hanno la funzione delle spore batteriche, si formano quando le condizioni
ambientali diventano sfavorevoli alla sopravvivenza del micete: mancanza di sostanze nutritive,
alterazione di ph, temperatura ecc. hanno forma rotondeggiante, parete molto spessa e si formano
in posizione apicale o intercalare di ife o pseudoife. quindi possiamo reperirle sia nei miceti
filamentosi che lievitiformi. queste strutture hanno anche esse un valore diagnostico, perchè
quando le troviamo in un lievito pensiamo subito alla Candida albicans o dubliensis, se le troviamo in
miceti filamentosi pensiamo ai dermatofiti dal punto di vista metabolico le clamidospore sono
molto lente, venivano definite spore dormienti. come facciamo a indurre la produzione di
clamidospore in vistro? coltiviamo il micete in un terreno povero all'amido di riso o farina di mais,
e grazie ad un vetrino coprioggetto, creiamo una parziale anaerobiosi. nel giro di 7-8 giorni
possiamo trovare all'esame microscopico la presenza di clamidiospore. se troviamo queste
strutture possiamo pensare sia alla candida albicans che dubliensis. come faccio a capire quale
candida è a produrre queste spore? possiamo capirlo attraverso saggi biochimici di fermentazione.
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6
riproduzione
sessuata
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• questo tipo di riproduzione ci aiuta nella tassonomia. infatti quelli che non hanno riproduzione
sessuale sono detti imperfetti.
• la spora sessuale deriva da fusione di due gameti, o da organuli del tallo fungino, che producono i
gameti e che vengono detti gametangi.
• sia i gameti che i gametangi possono essere uguali per forma e dimensione e li chiamo quindi
omogameti o omogametangi. possono essere diversi per forma e dimensione e verranno quindi
chiamati eterogameti po eterogametangi.
• in ogni caso la spora si forma in 3 fasi:
• plasmogamia: fusione di gameti o gametangi di segno opposto. in genere il gamete maschile
viene indicato con il segno + e quello femminile con il segno -.
• cariogamia: dalla spasmogamia origina lo zigote, l'unica cellula dipoide del micete, perchè tutti i
miceti hanno un corpo aploide.
• meiosi riduttiva: avviene solo dopo la formazione dello zigote.
• abbiamo 3 forme di spore sessuali che caratterizzano 3 classi: zigospore (degli zigomiceti, che
usano anche riproduzione agamica, quindi sono miceti perfetti); le ascospore, che appartengono
agli ascomiceti, e le basidiospore caratteristiche dei basidiomiceti.
• le zigospore si formano dall'unione del gametangio maschil,detto anteridio, e del gametangio
femminile, detto ascogonio. successivamente si ha cariogamia e meiosi riduttiva. per cui avremo
una spora scura e bernoccoluta. dopo si formerà uno sporangio, perchè negli zigomiceti abbiamo
sia la riproduzione agamica che sessuata.
• le ascospore, caratteristiche degli ascomiceti (tutti i dermatofiti e alcune specie di aspergillus.
quindi anche questi possono usufruire di riproduzione sia sessuata agamica che sessuata). il
gametangio maschile si chiama anteridio, e ascogonio quello femminile. nella plasmogamia si ha
l'unione dei due gametangi, lisi della parete divisoria e trasferimento dei nuclei dall'anteridio
all'ascogonio. dall'ascogonio fecondato si formano delle ife ascogene settate binucleate. questa è
la fase di dicarion. la cariogamia, con la successiva meiosi riduttiva avvengono nella penultima
cellula delle ife ascogene settate, la quale si trasformetà in un asco contenente 4 ascospore mature.
se avverrà una mitosi il loro numero sarà portato a 8.
• le basidospore sono spore che si formano per l'unione o plasmogamia di due miceli
mononucleati che fungono da gameti. quando due miceli mononucleati vengono a contatto tra di
essi avviene uno scambio di nuclei, per cui si formerà un micelio secondario binucleato (fase di
bicarion). la cariogamia e la successiva mitosi riduttiva avverranno nell'ultima cellula del micelio
secondario binucleato. in essa, che aumenterà molto di volume, appariranno protuberanze
all'interno delle quali migrano i nuclei che provengono dalla meiosi riduttiva. alla fine avremo un
basidio contenente 4 basidiospore mature. se ci sarà nua mitosi avremo un basidio con 8
basidiospore. il Criptococcus neoformans è un basidiomicete, l'unico dei basidio miceti patologici per
l'uomo.
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7
PROF MILICI
March 30, 2012
Microbiologia - Virus
caratteristiche
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• sono molto semplici, e sono parassiti intracellulari obbligati. non hanno metabolismo autonomo e
devono utilizzare necessariamente i meccanismi biosintetici della cellula ospite.
• le loro dimensioni sono intono al nm. per cui non sono osservabili al microscopio ottico, per cui
dobbiamo ricorrere al microscopio eletttronico.
• i virus possiedono un solo tipo di acido nucleico: dna o rna. mai entrambi.
• dna o rna funzionano come depositari dell'informazione genetica, per cui il virus può replicarsi
nella cellula, può trasferire il suo genoma da una cellula all'altra e può replicare le sue
macromolecole, sempre servendosi degli apparati della cellula ospite.
• una prima distinzione dei virus si può fare caratterizzando:
• virus nudi che hanno l'acido nuclei dna o rna circondato da un involucro proteico che prende il
nome di capside. il capside ha quuindi il compito di proteggre l'acido nucleico. il calside è
costituito da subunità proteiche chiamate capsomeri; acido nucleico + capside = nucleocapside;
• possiamo caratterizzare anche i virus che oltre al nucleocapside posseggono un involucro
pericapsidico detto anche envelope. l'envelope è costituito da un doppio strato fosfolipidico di
derivazione della membrana della cellula ospite. il virus maturo fuoriesce dalla membrana della
cellula infetta, e questo envelope conterra proteine di derivazione cellulare e glicoproteine virali.
• queste funzionano da antirecettori: questi sono deputati all'ancoraggio della particella virale alla
membrana della cellula ospite.
• nei virus nudi, senza envelope, la funzione antirecettoriale viene affidata alle proteine del
capside.
• i virus possono essere a dna o rna che codifica per proteine funzionali e strutturali. le proteine
strutturali faranno parte della struttura dei virus, mentre quelle funzionali servono per la loro
duplicazione.
• la scarsa capacità codificante dei virus soprattutto a rna impone che il capside sia formato da
pochi tipi di proteine, addirittura, nei virus piu piccoli, il capside sarà costituito da un soo tipo di
proteine.
• le singole catene polipeptidiche del capside si possono legare secondo legami non covalenti in
modo tale da costituire due simmetrie: cubica o icosaedrica e una simmetria di tipo elicoidale.
• nella simmetria di tipo icosaedrico le singole catene proteiche, dette capsomeri, si
distribuiscono tra di loro a costituire un guscio quasi sferico all'interno del quale si troverà
l'acido nucleico. nella simmetria di tipo icosaedrico i capsomeri si ritroveranno sulla superficie di
un icosaedro (un poliedro regolare costituita da 20 faccie e 12 vertici). i capsomeri dei vertici
hanno un'aspetto pentagonale e quindi vengono detti pentoni; mentre i capsomeri che si trovano
sulla superficie dell'icosaedro hanno un profilo di tipo esagonale e sono chiamati esoni.
• nella simmetria di tipo elicoidale le singole unità proteiche chiamate protomeri si dispongono
secondo un asse elicoidale che circonda l'acido nucleico che i trova all'interno assumendo una
struttura di tipo bastoncellare. in questa simmetria, invece, i singoli protomeri ragiscono tra loro e
con l'acido nucleico contenuto all'interno, formando strutture rigide, come accade per esempio nel
virus del mosaico del tabacco, oppure strutture con rigidità minore (virus animali, soprattutto nel
virus influenzale, che è elicoidale).
• i virus a dna hanno simmetria prevalentemente di tipo icosaedrico, mentre i virus a rna possono
avere sia una simmetria icosaedrica che elicoidale
• fanno eccezione i pox virus, ai quali appartiene il virus del vaiolo, che hanno una simmetria molto
complessa, non ben definita (da alcuni definita a mattone).
• i virus possono essere a dna o rna e in entrambi i casi gli acidi nucleici sono depositari
dell'informazione genetica, che codificano per proteine strutturali e funzionali alla replicazione.
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1
virus RNA
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virus DNA
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classificazione
secondo acido
nucleico
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• possono avere rna bicatenario, anche se normalmente sono monocatenari.
• l'rna può essere mono- o pluri-segmentato.
• può essere a polarità positiva o negativa
• lineare o circolare
• i virus a rna rappresentano l'unico esempio in cui l'rna funziona da depositario dell'informazione
genetica.
• i virus a rna a polarità positiva possiedono all'estremità 5' delle sequenze nucleotidiche uguali
agli rna messaggeri cellulari, per cui l'rna a polarità positiva funge direttamente da messaggero, e
subito tradotto in proteine a livello ribosomiale.
• i virus a rna a polarità negativa non possono fungere da messaggeri, e quindi devono codificare
per una rna polimerasi rna dipendente adatto a trascrivere la molecola di rna in messaggeri.in
questi tipi di virus questo enzima non è frutto dell'attività trascrizionale del nucleo della cellula
ospite, per cui il virus lo porta con se insieme al genoma nel momento in cui viene liberato nella
cellula.
• la rna polimerasi rna dipendente dei virus a rna a polarità POSITIVA viene sintetizzata nel ciclo
replicativo, e farà parte delle proteine funzionali.
• questa rna polimerasi rna dipendente non è un enzima fedele, in quanto puo compiere degli
errori. e ciò è responsabile dell'alta frequenza di mutazione e variabilità che caratterizza il virus a
rna.
• i virus a rna a polarità positiva si caratterizzano per il fatto che il genoma si disgrega dalle
proteine in maniera tale che possa essere tradotto a livello ribosomiale (in quanto funge da
messaggero). ciò NON accade per i virus a rna a polarità negativa, in cui l'rna rimane associato alle
proteine del capside durate tutto il ciclo replicativo.
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• vengono classificati sempre in base alle caratteristiche dell'acido nucleico.
• a parte i parvovirus (piccoli virus) che hanno dna mono catenario; e a parte gli epadnavirus (virus
epatite b) che hanno un genoma parzialmente bicatenario;
• i virus a dna hanno un genoma aploide bicateniaro, che può essere linare o circolare.
• è lineare negli adenovirus, herpesvirus, parvovirus e poxvirus (virus vaiolo)
• è circolare negli papillomavirus, e nei poliomavirus e anche negli epadnavirus (questi oltre
ad averlo parzialmente bicatenario è circolare)
• la complessità genetica dei virus in generale dipende dalla grandezza del dna: più grande è il
genoma più complessi sono.
• i virus con un piccolo genoma, come i parvovirus hanno una complessità genetica paragonabile a
quella devi virus a rna. i virus di grandi dimensioni possono codificare anche per cento proteine.
• a differenza dei virus a rna che si replicano in sede citoplasmatica, ad eccezione del virus
influenzale (che pur essendo a rna ha una fase nucleare), i virus a dna usano polimerasi che
trascriptasi della cellula ospite. quindi sia la trascrizione che la replicazione dei virus a dna
avverrà in sede nucleare. fanno eccezione i poxvirus (che pur essendo a dna si replicano nel
citoplasma).
• i virus a dna sono caratterizzati da una minore variabilità genetica, in quanto la dna polimerasi
della cellula ospite è un enzima fedele, e se vi sono errori la polimerasi correttore di bozze li
corregge.
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• virus a dna monocatenario
• virus a dna bicatenario
• virus a rna o dna con attività retrotrascrizionale
• virus a rna mono segmentato
• virus a rna plurisegmentato
• virus a rna monocatenario a polarità positiva
• virus a rna monocatenario a polarità negativa
• viroidi e prioni
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2
replicazione virale
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prima fase:
ASSORBIMENTO
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• affinchè un virus si possa moltiplicare in una cellula ospite per dare luogo a nuove particelle virali
è necessario che la cellula sia sensibile e permissiva
• una cellula sensibile deve contenere i recettori attraverso cui il virus può legarsi grazie ai suoi
antirecettori.
• una cellula permissiva deve contenere tutti i meccansimi biosintetici adatti all'espressione del
genoma virale, e alla sua replicazione.
• soltanto in questo caso il ciclo virale è definito produttivo: cioè si formeranno paticelle virali
mature che fuoiriusciranno dalla cellula infetta.
• può accadere che la cellula sia sensibile ma non permissiva, in questo caso il ciclo viene definito
abortivo; si può verificare quando il virus presenta dei difetti nella sua replicazione op quando la
cellula non permette al genoma virale la sua completa espressione. alcuni virus, come il parvovirus
p19 si replicano esclusivamente in cellule che si trovano in fase s, cioè quando tutti i meccanismi
cellulari adatti alla sintesi di dna siano presenti ed efficienti.
• nel caso in cui il ciclo è restrittivo o abortivo si possono verificare tanti eventi:
• persistenza del virus dento la cellula: in questo caso il virus va in latenza, il genoma virale si
integra con la cellula ospite, si può replicare ad ogni ciclo cellulare; o può rimanere nel citoplasma
sotto forma di episoma. in questi casi la cellula può andare int rasformazione, evento durante il
quale alcune proteine precoci del virus possono interferire con proteine che regolano la
proliferazione cellulare, e si ha quindi una trasformazione della cellula (cancerogenesi).
• nel caso in cui la cellula è sensibile e permissiva si avrà un ciclo replicativo completo. le varie
fasi del ciclo sono:
• prima fase: assorbimento
• seconda fase: penetrazione
• terza fase: scapsidamento
• quarta fase: espressione e replicazione del genoma
• quinta fase: maturazione
• sesta fase: liberazione
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• presuppone una compatibilità tra recettori cellulari e antirecettori virali.
• i recettori cellulari sono rappresentati proteine (virus hiv usa il recettore cd4; alcuni echovirus
usano il recettore cd55);
• i recettori possono anche essere di natura glicidica. e dato che la maggior parte dei virus usano
recettori glicidici, questi virus hanno un ampio spettro d'ospite (per spettro d'ospite si intende il
numero di specie animali che risultano sensibili all'infezione da parte di un determinato virus. Es.:
virus poliomelite ha uno spettro d'ospite ristretto, perchè infetta uomo e scimmie; il virus della
rabbia ha uno spettro d'ospite molto ampio perhcè infetta molte specie animali).
• alcuni virus, oltre ai recettori della cellula ospite utilizzano per l'assorbimento una molecola
secondaria, detta co-recettore. per i virus con envelope gli antirecettori virali appaiono come
proiezioni che si dipartono dalla superficie della particella virale; per i virus nudi, un esempio che
possiamo fare è il poliovirus, gli antirecettori si ritrovano in rientranze che solcano la superficie
del virus. l'interazione recettore-antirecettore si traduce in un legame di tipo sterico; e affinchè la
particella virale venga ancorata stabilmente alal membrana della cellula ospite occore un ambiente
ricco di ioni, che serve a neutralizzare le cariche elettriche presenti sulle superfici complementari
in maniera tale da ridurre la repulsione elettrostatica. questo processo non richiede dispendio di
energia ed è indipendente dalla temperatura.
• per alcuni virus l'assorbimento rappresenta una fase irreversibile, perchè se all'assorbimento
non segue la penetrazione il virus perde la capacità infettante. ad esempio, nel poliovirus,
durante l'assorbimento può venire persa una proteina del capside, per cui l'acido nuleico risulta
sensibile all'azione delle proteasi e delle ribonucleasi cellulari.
• per altri virus, se all'assorbimento non consegue la penetrazione la particella virale conserva la
capacità infettante: un esempio ci è dato dagli orthomixovirus (a cui appartiene il virus
dell'influenza) sulla cui superficie vi è una glicoproteina con funzione enzimatica detta
neuroamilidasi, la quale scinde il legame tra virus e cellula ospite. in questo caso il virus che si
stacca dalla cellula può andare a infettare altre cellule.
• oltre alla modalità solita di assorbimento vi è un metodo mediato da anticorpi: la particella virale
che deve penetrare nella cellula verrà circondata da anticorpi specifici e catturata da recettori
cellulari per immunoglobiline: questa infezione prende il nome di infezione anticorpo-mediata,
caratteristica del virus HIV e del virus dell'influenza A.
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3
seconda fase:
PENETRAZIONE
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terza fase:
SCAPSIDAMENTO
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quarta fase:
ESPRESSIONE
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• la fase di penetrazione avviene in maniera diversa a seconda che si tratti di virus nudi o con
envelope.
• nei virus con envelope la penetrazione avviene per fusione della particella virale con la
membrana citoplasmatica. questa fusione avviene grazie alla presenza di proteine fusogene che
si trovano sulla particella virale.
• ricordiamo la gp41 del virus dell'HIV e la proteina ha2 del virus dell'influenza a. questa
proteina viene attivata dal pH acido degli endosomi, infatti il virus dell'influenza A penetra per endocitosi. e
la successiva fusione della membrana avviene con la membrana dell'endosoma.
• i virus nudi penetrano per endocitosi.
• nei poliovirus abbiamo un fenomeno insolito, nel senso che una proteina del capside dei
poliovirus durante la fase di penetrazione provoca la formazione di un poro sulla membrana della
cellula ospite, per cui l'rna verrà introdotto direttamente nel citoplasma: non avremo l'ingresso
della particella in toto, ma solo la traslocazione dell'acido nucleico a livello citoplasmatico.
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• uan volta che il virus è penetrato nella cellula ospite deve liberare l'acido nucleico dai
componenti proteici e dal capside.
• per alcuni virus lo scapsidamento avviene automaticamente, in altri avviene ad opera di enzimi
proteasi cellulari, per altri ancora avviene ad opra di enzimi lisosomiali che vengono scaricati
nel vacuoli fagocitari.
• una volta che il genoma si è liberato dai suoi costituenti che lo circonda può rimanere nel
citoplasma o raggiungere il nucleo.
• tutti i virus a rna , ad eccezione del virus influenzale, si replicano nel citoplasma, e tutti i virus a
dna, ad eccezione del poxovirus, si replicano nel nucleo
• i virus a dna, e il virus influenzale oltre a attraversare la membrana citoplasmatica devono
attraversare anche la membrana nucleare.
• a livelo di questa troviamo il complesso del poro nucleare, costituito da 50 nucleoporine che
hanno il compito di trasferire le molecole all'interno o all'esterno del nucleo.
• studi recenti hanno dimostrato che attraverso il complesso del poro possono passare
particelle che hanno dimensione intorno a 36nm.
• per cui si è visto che i parvovirus, che hanno dimensioni di 8-25 nm e gli epadnavirus,
soprattuto il virus dell'epatite b, che hanno dimensioni intorno i 35nm possono attraversare la
membrana del poro senza bisogno di essere disassemblati, cioè privati dei costituenti esterni.
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• il genoma virale deve provvedere a ricostruire tutti i componenti per dare luogo a un nuova
progenie virale, per fare cio deve utilizzare tutti meccanismi biosintetici della cellula ospite.
• la fase che piu dipende dalla cellula ospite è la sintesi proteica
• i virus devono presentare ai ribosomi gli rna messaggeri in maniera tale essere letti e tradotti a
livello poliribosomiale.
• la cellula però pone dei limiti: essa forma i suoi rna messaggeri a livello del nucleo e su
stampo del dna. i virus che possono raggiungere il nucleo e sono a dna possono raggiungere
il nucleo e far sintetizzare messaggeri.
• i virus a rna hanno rna che funge esso stesso da messaggero, oppure devono sintetizzare una
polimerasi rna dipendente che svolga questo compito.
• esistono diverse strategie per fare cio a seconda che si tratti virus a dna o rna.
• i virus a rna rappresentano gli unici esempi in cui l'rna funziona da depositario dell'informazione
genetica, e quindi, dato che la cellula non forma rna su stampo di rna, alcuni virus a rna devono
possedere una polimerasi in grado di operare la trascrizione.
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4
replicazione dei
virus a RNA
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• nei virus a rna noteremo 5 strategie di replicazione diverse:
• nei virus a polarità positiva non hanno bisogno di essere trascritti, ma funzionano subito da
messaggeri. nei poliovirus e nei flavivirus (rna a polarità +) il prodotto della trascrizione della
successiva traduzione è una poliproteina che viene scissa da enzimi virali in proteine strutturali
e proteine funzionali. le proteine strutturali sono quelle che faranno parte della struttura del
virus, mentre tra le proteine funzionali abbiamo la rna polimerasi rna dipendente la quale
trascrive l'rna genomico formando rna messaggero. quesro rna genomico funge da stampo per la
sintesi di una rna a polarità negativa, la quale funzionerà da stampo per la sintesi di una rna a
polaritò positivo che farà parte della progenie virale.
• nei togavirus (rna +) vi sarà prima la traduzione dell'estremità 5' che codificano per le proteine
funzionali. dopo la replicazione del genoma si formeranno le proteine strutturali che faranno parte
dell'estremità 3'. questi virus rna+ chiaramente possiedono già una rna polimerasi rna dipendente
che viene sintetizzata tra le proteine funzionali all'inizio del ciclo replicativo, e non hanno bisogno
di veicolarla con loro gia pronta.
• nei virus a polarità negativa , non avendo rna+ non possono avere messaggeri, quindi hanno
bisogno della rna polimerasi rna dipendente veicolata dal virus stesso. il prodotto della
traduzione è rappresentato da proteine funzionali e strutturali. tra le proteine funzionali si
formerà la rna polimerasi rna dipendente la quale trascrive l'rna- in rna+ che viene detto
filamento antigenomico. questa molecola, pur essendo a polarità positiva non funge da
messaggero, ma fungerà da stampo all'rna negativo che apparterrà alla progenie virale.
• i virus a polarità negativa con rna plurisegmentato (orthomixovirus - virus influenza) hanno
la particolarità di avere un genoma costituito da 7-8 segmenti. ogni segmento verrà trascritto
separatamenteo. in oltre, all'estremità 5' hanno sequenze nucleotidiche non virali, ma che
hanno sottratto agli rna messaggeri cellulari, per tale motivo, pur essendo a rna hanno una
fase nucleare.
• vi sono virus rna detti ambisenso con polarità sia positiva che negativa. in questo casi il
virus si comporta come avesse solo rna negativo: forma una molecola antigenomica che fungerà
da stampo per il genoma delle nuove particelle virali.
• i virus a rna bicatenari sono gli orbivirus, i rotavirus e i reovirus. questi sono caratterizzati dal
fatto di un rna bicatenario circondato da un doppio involucro esterno. il virus nel citoplasma
perde l'involucro piu esterno: cio provoca la permeabilizzazione dello strato piu interno con
attivazione della rna polimerasi rna dipendente che ha il compito di operare la trascrizione
dell'acido nuclei virale. i prodotti della trascrizione sono rna messaggeri che vengono tradotti in
proteine strutturali, e possono anche fungere da stampo per la sintesi del genoma, che all'inizio
sarà monocatenario, e successivamente, quando sarà assemblaro per la costituzione di nuove
particelle virali, assumerà struttura bicatenaria.
• i retrovirus sono dei virus caratterizzati da due molecole di rna a polarità positiva identiche.
gli rna verranno trascritti in rna messaggeri, che fungeranno da stampo per molecole di
DNA. questo fenomeno insolito prende il nome di retrotrascrizione, operato dalla DNA
polimerasi RNA dipendente (o trascrittasi inversa). la nuova molecola di dna raggiunge il
nucleo, e ad opera di un enzima detto integrasi verrà integrata al genoma cellulare. così può
dare luogo ad una infezione latente o può dare inizio ad un processo di trascrizione che
porterà ad un ciclo produttivo, oppure possono essere espresse alcune proteine virali.
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5
replicazione dei
virus a DNA
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quinta fase:
MATURAZIONE
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• i virus a dna sono tutti a dna bicatenario, quasi sempre lineare, con eccezione del parvovirus,
che ha un dna moncatenario lineare, gli epadnavirus, con dna parzialmente bicatenario, e la
famiglia papomviridae e papillomaviridae hanno un dna circolare.
• i virus a dna normalmente si replicano in cellule che sono infase attiva di replicazione, molto
spesso esistono virus che producono proteine che stimolano la cellula a entrare in fase di
replicazione. come sempre abbiamo detto i virus a dna si replicano in sede nucleare ad opera di
enzimi cellulari: dna polimearsi dna dipendente.
• fa eccezione il poxvirus, (ai quali appartiene il virus del vaiolo) che si replica nel citoplasma.
• in seguito alla traduzione del genoma negli adenovirus e herpesvirus si formeranno 3 gruppi
di composti: proteine precocissime, precoci e tardive
• le proteine precocissime e precoci hanno funzione enzimatica e regolatoria
• le proteine tardive hanno esclusivamente funzione strutturale
• nella famiglia papomaviridae e papillomaviridae si formeranno due classi di proteine:
precoci e tardive
• i poxvirus compiono il loro ciclo replicativo nel citoplasma ad opera di enzimi cellulari. dopo la
trascrizione che avviene ad oipera di enzimi cellulari, si formeranno mrna che verranno tradotti in
proteine precoci,e fra queste proteine precoci abbiamo degli enzimi che hanno la funzione di
replicare l'acido nucleico. avremo dna e rna polimerasi e fattori di crescita necessari alla sintesi del
dna.
• una volta sintetizzato il dna, questo verrà in parte assemblato per la costituzione delle nuove
particelle virali, in parte trascritto in rna messaggeri che codificheranno per proteine strutturali.
• i parvovirus sono virus a dna monocatenari, e nell'ambito di questi virus dobbiamo distinguere
quelli che possono replicarsi autonomamente da quelli che hanno bisogno di virus hepler (come gli
adenovirus).
• nel caso di virus autonomi, come ad esempio il parvovirus b19, in un primo tempo il virus che
ha una sola catena di dna raggiunge il nucleo, in maniera tale che si possa formare la catena
complementare ad opera di enzimi nucleari. questa si formerà grazie alla presenza all'estremità del
genoma di catene nucleotidiche ripetute invertite che replicandosi a forcina formano una specie di
innesco necessario alla polimerasi cellulare per la sintesi della catena. a questo punto si formerà una
doppia catena di dna, che successivamente verrà scissa da una proteasi virale in due catene
polinucleotidiche complementari.
• gli epadnavirus, a cui appartiene il virus dell'epatite b, hanno dna parzialmente bicatenario con
una interruzine nella catena apolarità positiva. il virus raggiunge il nucleo dove ad opera di enzimi
cellulari verrà trasformato in una molecola completamenta bicatenaria. questa molecola completamente
bicatenaria verrà traascritta in rna chiamati genomici e subgenomici. gli rna subgenomici funzionano
esclusivamente da messaggeri. mentre quelli genomici fungono da stampo per la sintesi della
molecola negativa di DNA. analogamente ai retrovirus abbiamo un processo di
retrotrascrizione, ad opera di una trascrittasi inversa.
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• la fase di assemblaggio avviene spontaneamente: le varie subunità virali si dispongono
diversamente nello spazio in modo da costituire la struttura virale.
• l'assemblaggio per i virus nudi può avvenire nel citoplasma (poliovirus) o nel nucleo
(adenovirus). durante la fase di assemblaggio possono avvenire nel virus modificazionni
biochimiche che lo portano a maturare, rendendolo pronto per uscire dalla cellula ospite.
• la fase di assemblaggio può avere errori, perchè possono formarsi capsidi vuoi o incompleti.
• per i virus nudi, l'uscita del virus dalla cellula ospite avviene per esocitosi, tramite variazione
della permeabilità cellulare e blocco delle sintesi macromolecolari della cellula.
• per i virus con envelope la fuoriuscita avviene per gemmazione attraverso due modalità:
attraverso la membrana citoplasmatica previo inserimento di proteine e glicoproteine virali
sulla membrana della cellula che gemmerà, o attraverso la membrana nucleare.
• per gli herpesvirus il processo di gemmazione avviene nella membrana nucleare, quindi l'involucro
deriva dalla membrana nucleare. il virus si ritrova in vescicole secretorie che trasportano i virus attraverso il
citosol cellulare e lo riversano all'esterno mediante fusione delle loro membrane con la membrana della
cellula ospite.
• generalmente per i virus fuoriescono per lisi cellulare e si ha la morte della cellula, ma ci sono
alcuni virus, come il virus della rabbia e il virus della rosolia (virus teratogeno: provoca
malformazioni al feto), che nonstante vengano liberati in continuazione dalla cellula ospite non ne
compromettono la vitalità.
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effetto citopatico
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• se non disponiamo di un microscopio elettronico non vediamo virus, ma attraverso un
microscopio ottico possiamo vedere le cellule, e dagli effetti che comporta un virus capire se le
cellule sono infette.
• la presenza di un virus altera le caratteristiche morfologiche, alterazioni antigeniche, blocco della
sintesi di componenti macromolecolari, e alterazioni del controllo del ciclo celulare.
• la presenza di un virus in un tappeto cellulare, al suo moltiplicarsi, determinerà l'effetto
citopatico, che induce: arrotondamento delle cellule che perdono la normale morfologia; le
cellule si distaccano dalla superficie del vetro, si raggrinzano.
• possono formarsi anche dei sincizi: cellule polinucleate. la formazione di sincizi avviene a causa
della fusione di membrane cellulari dovute alle proteine fusogene che usano i batteri per
penetrare nella cellula.
• per avere tappeti cellulari monostratificati tra le cellule che adoperiamo in laboratorio hanno
molta importanza le cellule ila, che sono cellule tumorali che provengono da una donna che aveva
un carcinoma uterino. queste cellule ancora si mantengono in tutti i laboratori del mondo. queste
vengono adoperate per coltivare materiali clinici da cui vogliamo isolare virus.
• anche il trattamento con tripsina di reni di scimmia ci permette di avere tappeti cellulari
monostratificati
• possono formarsi inclusioni nucleari o citoplasmatiche, e possono formarsi in vivo. sono stati
di grande aiuto nelle sezioni istologiche per la diagnosi di infezione virale
• sono molto importanti le inclusioni date dal virus della rabbia, che si formano nelle cellule
nervose (corpi del negri), nelle cellule epiteliali (corpi del guarneri); le inclusioni da herpesvirus
possono verificarsi nelle cellule epiteliali
• i poliribosimo cellulari sono occupati a tradurre proteine virali, e viene meno la sintesi di
macromolecole, in alcuni casi anche di dna e proteine (come negli herpesvirus). in altri casi si
impedisce il trasferimento del rna messaggero dal nucleo al citoplasma
• il virus inserirà proteine o glicorpoteine virus-modificate, modificando la componente antigenica
della cellula.
• la cellula, che per difendersi esporra complessi mhc1, verrà inibita dal virus in questa espressione
per evitare la apoptosi.
• molti virus che hanno rilevanza patologica negli umani impediscono l'apoptosi: un processo che il
sistema immunitario mette in moto per proteggersi dai virus.
• un altro meccanismo è quello di interferire conla proliferazione cellulare: la cellula va incontro a
immortalizzazione o trasformazione (cancerogenesi)
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