Il Controllo Ufficiale della riproduzione animale

Il Controllo Ufficiale della riproduzione animale
Martina Benedetti
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana M. Aleandri
Malattie animali nella sfera riproduttiva
La gestione degli accertamenti diagnostici
Empoli, Mercoledì 11 Novembre 2015
La Normativa
Decreto 19 luglio 2000, n. 403 Approvazione del nuovo regolamento di esecuzione della legge 15
gennaio 1991, n 30 concernente la riproduzione animale
Decreto Legislativo 27 maggio 2005, n.132 attuazione della direttiva 2003/43/CE relativa agli
scambi intracomunitari ed alle importazioni di sperma di animali della specie bovina
Reg. (CE) 26-10-2007 n. 1266/2007
Delibera Regionale Toscana 30 marzo 2015, n. 385 Disposizioni operative per l’attuazione della
normativa unionale e statale in materia di riproduzione animale.
Regolamento di polizia veterinaria DPR 8/2/1954 n°320
OIE: Terrestrial Animal Health Code
Chapter 4.5. General hygiene in semen collection and processing centres
Chapter 4.6. Collection and processing of bovine, small ruminant and porcine semen
Chapter 4.7/4.8.Collection and processing of in vivo(4.7)/in vitro (4.8) derived embryos from
livestock and equids
SPECIE BOVINA
Decreto Legislativo 27
maggio 2005, n. 132
ALLEGATO B CAPO I
Condizioni applicabili all’immissione degli animali nei centri riconosciuti di raccolta dello sperma
Quali esami di laboratorio bisogna svolgere?
punto d)
nei 28 giorni precedenti la 40ena deve essere attestati l’esito negativo alla ricerca degli anticorpi
ad eccezion fatta della BVD/MD per:
-Tubercolosi
-Brucellosi
-Leucosi
-IBR/IPV
-BVD/MD (ricerca del virus ed esame sierologico)
-Bluetongue
SPECIE BOVINA
Decreto Legislativo 27
maggio 2005, n. 132
ALLEGATO B CAPO I
Condizioni applicabili all’immissione degli animali nei centri riconosciuti di raccolta dello sperma
Quali esami di laboratorio bisogna svolgere?
punto e)
durante il periodo di 40ena
-Brucellosi
-IBR/IPV
-BVD/MD (ricerca del virus ed esame sierologico)
-Campylobacter foetus (1 o 3 volte a distanza di tre settimane)
-Trichomonas foetus
-Bluetongue
SPECIE BOVINA
Decreto Legislativo 27
maggio 2005, n. 132
ALLEGATO B CAPO II
Esami di routine da effettuare su tutti i bovini durante lo stazionamento nel centro riconosciuto
1. tutti i bovini almeno una volta anno devono essere sottoposti con esito negativo alle prove:
-Tubercolosi
-Brucellosi
-Leucosi
-IBR/IPV
-BVD/MD (ricerca del virus ed esame sierologico)
-Campylobacter foetus
-Trichomonas foetus
-Bluetongue
Tutte le prove devono essere effettuate presso un laboratorio riconosciuto dallo stato membro
TUBERCOLOSI BOVINA
Gli animali vanno testati prima dell’ingresso e poi sottoposti
almeno una volta anno a profilassi
Diagnosi in vita
-Intradermoreazione (IDT)
-γ-interferon
evidenzia la reazione di ipersensibilità di tipo ritardato
all’iniezione intradermica di Tubercolina
BRUCELLOSI BOVINA
Gli animali vanno testati prima dell’ingresso e poi sottoposti
almeno una volta anno a profilassi
RBPT (rose/bengal plate agglutination test)
-test standardizzato, facile, veloce, economico
–antigene B. abortus strain 99 acido (pH 3.6) e colorato con Rosa Bengala
-pH basso blocca agglutinazione da parte di IgM e favorisce IgG1 riduzione reazioni
aspecifiche
Fissazione del complemento (CFT)
test di elezione e di conferma raccomandato da OIE
sensibile e specifico
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
Patologia causata da Bovine Herpesvirus (BHV-1 è suddiviso in sottotipi genetici)
BHV-1.1
BHV-1.2a
BHV-1.2b
Lo sviluppo della sintomatologia tipica della rinotracheite piuttosto che quella
della vulvovaginite/balanopostite dipende più dalla via di infezione che dal
sottotipo virale
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
Vie di trasmissione
- Trasmissione per contatto diretto e indiretto
-via aerogena (5-6 metri di distanza)
-via venerea (seme: costante eliminazione virale in fase acuta - poi intermittente)
Il seme si contamina con secreti del pene/prepuzio - obbligo di indennità nei centri
di produzione seme
Dopo infezione per via orale BoHV-1:
-replica a livello della mucosa delle prime vie respiratorie e tonsille
-si localizza in forma latente nel ganglio trigemino
Dopo infezione genitale BoHV-1:
-replica a livello della membrana vaginale e prepuziale
-si localizza in forma latente nei gangli sacrali
Il DNA virale resta latente a livello del sistema nervoso probabilmente per tutta la vita
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
A seguito di stress (trasporto, parto, ecc…)
-riattivazione del virus
-passaggio dalla fase di latenza a quella litica
Diffusione intermittente nell’ambiente !
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
• Che tipo di campione inviare
• Quali sono le prove disponibili
• Quali tipi di tecniche
Diagnosi indiretta ricerca degli anticorpi:
-tecnica ELISA proteina B
-tecnica ELISA proteina E (DIVA test)
-test di sieroneutralizzazione (SN)
Diagnosi diretta ricerca virus:
Isolamento del virus da tampone/organi
-coltura cellulare
-PCR α-herpesvirus
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
Tecnica ELISA sta sostituendo progressivamente la SN
Centro di referenza OIE (Reims Germany)
Disponibilità dei sieri europei
di riferimento
Europei EU1, EU2, EU3 per
standardizzazione metodi
Paesi che hanno eradicato l’infezione o applicano piani di
eradicazione obbligatori ai sensi della direttiva 64/432
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
ELISA o SN?
ELISA gB
molto sensibile e specifica
SN
sensibile e specifica
RINOTRACHEITE INFETTIVA BOVINA
tecnica ELISA reattività non specifiche
-diversità tra lotti dei kit
-campioni esaminati subito dopo prelievo “fenomeno freschezza”
-animali prelevati entro 4 settimane dalla somministrazione vaccini
-cattiva qualità del campione (es.. Emolisi)
2 casi presso centro di raccolta seme
1.secretariat
2.manciego
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
•malattia virale provocata da un pestivirus (BVDV)
•suscettibili bovini di ogni età
•BVDV correlato con i virus della peste suina e border desease
degli ovini
•dopo la fase acuta generalmente non si sviluppa latenza
•feti che nascono dopo infezione in-utero possono sviluppare
infezioni persistenti (malattia delle mucose) di solito 1-2% della
popolazione bovina
•forma acuta più frequente nei giovani con febbre, diarrea, sintomi
respiratori
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
Trasmissione del virus
Seme
embryo transfer
Via classica
contatto diretto tra
animale
ricettivo
animale
infetto
Infezione
transitoria
acuta
Infezione
persistente
(infettato prima
della nascita)
Bassa escrezione
virale pochi giorni
Intensa escrezione
virale
tutta la vita
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
Embrione/feto
•0-30 giorni
aborto
•25-140 giorni fenomeno dell’ immunotolleranza
•90-150 giorni malformazioni
L’animale immunotollerante sviluppa un’infezione persistente
il virus si moltiplica nel feto e in maniera massiccia per tutta la vita
non potendo sviluppare una reazione immunitaria
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
diagnosi sierologica
ricerca degli anticorpi
diagnosi virologica
ricerca del virus
isolamento
SN
ELISA
ELISA
PCR
anticorpi strutturali
Anticorpi strutturali
Anticorpi non strutturali
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
La diagnosi sierologica
SN
per anticorpi vs proteine strutturali
ELISA
per anticorpi strutturali
per anticorpi non strutturali NS2-3
Proteine strutturali:
Proteine non strutturali NS2-3:
-glicoproteine di membrana
-ceppo specifiche
-variabili da ceppo a ceppo
-Prodotte quando il virus si moltiplica
-Stabili per il genere pestivirus
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
La diagnosi virologica consiste nella ricerca del virus:
-isolamento
-ELISA
-PCR
Matrici utili: sangue e sangue + anticoagulante
Da siero: isolamento, PCR, ELISA (proteine strutturali)
Dai leucociti: isolamento, PCR, ELISA (proteine strutturali)
Nel siero il genoma virale è meno presente
DIARREA VIRALE BOVINA (BVD)
•Nel siero il genoma virale è meno presente non pregiudica
la diagnosi del PI
•la matrice leucocitaria è la più efficace
•consigliabile il prelievo di sangue con anticoagulante
i tori del centro raccolta seme che risultano positivi alla ricerca
degli anticorpi devono essere negativi per la ricerca del virus!
BLUE TONGUE
•Patologia virale non contagiosa, trasmessa da vettore interessa ruminanti
selvatici e domestici come ovini, caprini, bovini,
bufali, caprioli, e vari altri artiodattili.
•Il virus appartiene alla famiglia reoviridae genere orbivirus
•La trasmissione prevede la presenza contemporanea di triade virus-vettore-ospite
•I bovini presentano una fase viremica molto lunga
(fino a 60 giorni post infezione) costituendo un “serbatoio” in grado di
garantire al virus, almeno nelle zone temperate, il superamento dei periodi di
freddo invernale (cosiddetto “overwintering”)
•Vettore culicoides raggio di volo alcuni km trasportati da vento
•Numerosi focolai nel bacino mediterraneo
•Epidemia 2014 ha interessato le province del centro Italia con la prevalente
diffusione del sierotipo 1
BLUE TONGUE
Reg. (CE) 26-10-2007 n. 1266/2007
REGOLAMENTO DELLA COMMISSIONE relativo alle
misure di applicazione della direttiva 2000/75/CE del Consiglio
per quanto riguarda la lotta, il controllo, la vigilanza e le
restrizioni dei movimenti di alcuni animali appartenenti a specie
ricettive alla febbre catarrale.
ALLEGATO III
Punto B
Animali di specie sensibili
produttori di sperma
degli animali
Sono stati sottoposti a prove sierologiche …….. almeno ogni 60 giorni durante il periodo di
raccolta e tra il ventunesimo e il sessantesimo giorno successivo all’ultimo prelievo dello
sperma da consegnare
Sono stati sottoposti, con esito negativo e conformemente al manuale OIE sugli animali
terrestri, a un test di identificazione dell’agente condotto su campioni ematici prelevati:
ii) durante il periodo di raccolta dello sperma:
- almeno ogni sette giorni, nel caso di test di isolamento del virus, oppure
- almeno ogni 28 giorni, nel caso della reazione a catena della polimerasi
BLUE TONGUE
diagnosi sierologica
diagnosi virologica
ricerca degli anticorpi
ricerca del virus
ELISA
SN
PCR
Malattie nella sfera riproduttiva del cavallo
•Anemia infettiva degli equini
• Morbo coitale maligno
• Arterite virale equina
• morva
•CEM Contagious Equine Endometritis
Malattie nella sfera riproduttiva del cavallo
Non il nome!
ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI
UN QUADRO NORMATIVO IN EVOLUZIONE
• OO. MM. 6/8/2010 (scaduta) concernente il piano di sorveglianza
nazionale dell’anemia infettiva degli equini.
Sono richiamati:
- art 99 RPV 320/54 (sequestro, isolamento, disinfezioni);
- artt 1 e 3 DM 4/12/76 (test Coggins, definizione positivo, misure negli
ippodromi);
- art 4, comma 4 a) 3) DPR 243/94 (tempi revoca: due test a tre mesi di
distanza dall’eliminazione
ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI
Situazione epidemiologica 2007 - 2011
Nel periodo 2007 – 2011 sono stati analizzati dal CRAIE 1.077.464 campioni dalla specie cavallo, 1479 dei
quali confermati positivi (0,14%)
ANEMIA
INFETTIVA DEGLI
EQUINI
La situazione
epidemiologica in
Europa - Anno 2010 -
ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI
Diagnosi sierologica
ELISA
AGID
ImmunoBlot
gp90
gp45
p26
ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI
I metodi AGID
Metodo Coggins
(D.M. 04/12/1976):
-doppio strato di AGAR
-70 µl di siero
-lettura dopo 48 h
Metodo OIE (OIE
Terrestrial Manual
2013):
-unico strato di AGAR
-42-48 µl di siero
-lettura dopo 24 h
ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI
Sensibilità ELISA > sensibilità AGID
L'ELISA rileva circa il 20% positivi in più di AGID (C. J. Issel et
al. 2013);
Le positività in ELISA sono nella maggior parte dei casi
confermate in IB ed anche virologicamente (Scicluna et. al.
2013);
Limite di rilevabilità di ELISA 10 volte superiore rispetto ad
AGID.
ANEMIA INFETTIVA DEGLI EQUINI
Malattie da retrovirus sottoposte a sorveglianza
epidemiologica aggiornamenti epidemiologici e
strumenti diagnostici
Convegno aprile 2015
•Lo schema di provvedimento riguardante il nuovo piano nazionale per l’AIE verrà predisposto congiuntamente
al CRAIE
•una volta definiti tutti gli aspetti tecnici e giuridici dovrà essere sottoposto alla firma del Ministro e quindi
pubblicato in G.U.
•metodo di screening: ELISA
•AGID riservato alle sole movimentazioni internazionali, fintanto che sarà indicato come “prescribed test for
international trade”
MORBO COITALE MALIGNO
• Patologia contagiosa degli equidi causata da Trypanosoma equiperdum (Doflein,
1901) che si trasmette da animale ad animale durante il coito.
•Unica patologia provocata da tripanosomi non trasmessa da vettori
•eradicato in Italia negli anni’40. Dopo una grave epidemia negli anni ’70 (casi in
Abruzzo, Emilia Romagna, Lazio, Marche, Sicilia, Umbria), è stato nuovamente
eradicato.
• La normativa nazionale che regolamenta la riproduzione animale (Legge 30/91,
DM 172/94, DM 403/00) comprende il controllo ufficiale di alcune malattie degli
equidi fra cui il MCM
• Normativa specifica relativa al MCM:
- RPV DPR n. 320/54 artt. 136 – 137
- DM 21 ottobre 1975 (abbattimento e distruzione capi infetti)
- DPR 243/94 art 4 comma 4 a) 1) (revoca misure: sei mesi da ultimo contatto)
MORBO COITALE MALIGNO
La situazione epidemiologica internazionale - Anno 2011 (OIE)
L'infezione è endemica in molte aree del continente asiatico, dell'Africa, in Russia, parte del Medio Oriente e
SudAmerica. In Europa le ultime notifiche degli altri Paesi CE risalgono agli anni ’50.
MORBO COITALE MALIGNO
La ricomparsa della malattia in Italia
MORBO COITALE MALIGNO
La ricomparsa della malattia in Italia
• La malattia ricompare in Italia nel 2011 (7 focolai): la prima positività riguarda uno
stallone testato per l’autorizzazione alla monta in provincia di Catania. L’esito delle
indagini evidenza che l’infezione circolava già da alcuni mesi; l’origine presunta dei
casi si attribuisce ad un’attività di monta non controllata e di commercio
irregolare. I controlli estesi del 2011 hanno consentito di definire le aree a rischio.
• I controlli più mirati 2012 hanno consentito di delineare una situazione
epidemiologica favorevole: 25913 capi esaminati nelle Regioni a rischio e 8628 nelle
altre Regioni. Non sono stati confermati ulteriori casi positivi.
• Il provvedimento del 2013 sancisce la conclusione delle misure straordinarie per il
rilievo della “bassa prevalenza dell’infezione” e raccomanda la puntuale applicazione
della normativa vigente sulla riproduzione animale e sulla registrazione e
identificazione degli equidi.
MORBO COITALE MALIGNO
MORBO COITALE MALIGNO
EVA - Arterite Virale Equina
malattia infettiva soggetta ad obbligo di denuncia. L’O.M. 16.2.94 ha pianificato e reso
obbligatorio su tutto il territorio nazionale il controllo dell’EVA negli equini e prevede il
controllo sierologico/virologico dei cavalli di sesso maschile adibiti alla monta
L’infezione può essere trasmessa tra cavalli nei seguenti modi:
- trasmissione diretta durante l’accoppiamento
- trasmissione diretta o indiretta durante il ruffianamento
- con l’inseminazione di cavalle con seme di stalloni infetti o con seme
contaminato durante la raccolta. Il virus può sopravvivere nel seme congelato
o refrigerato senza essere influenzato dagli antibiotici aggiunti al seme
- per contatto con feti abortiti o altri prodotti del parto
- per via respiratoria, attraverso le goccioline che si emettono tossendo o
starnutendo
EVA - Arterite Virale Equina
In molti paesi, tra cui USA, Inghilterra, Irlanda, Francia, è disponibile un vaccino.
Questa sieropositività non può essere differenziata da quella causata dall’infezione
In Italia la profilassi vaccinale non è legalmente praticabile
Gli animali risultati positivi all'accertamento sierologico restano esclusi dalla monta
ed il loro sperma non può essere impiegato fino alla conclusione degli ulteriori
accertamenti per la ricerca del virus dell'arterite equina nello sperma
EVA - Arterite Virale Equina
O.M. 13 gennaio 1994, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale del 17 gennaio 1994, n. 12. Allegato A
Metodi diagnostici per l’accertamento dell’arterite virale negli equidi riproduttori maschi
accertamenti sierologici e virologici le linee direttrici ed i criteri minimi riportati.
a) Identificazione degli anticorpi nei confronti del virus dell'arterite virale equina in campioni di sangue
1.
Raccolta dei campioni di sangue.
Per la diagnosi sierologica il prelievo di sangue deve essere effettuato da riproduttori in
buono stato di salute utilizzando provette sterili. Qualora fra gli equini mantenuti assieme
ai riproduttori fossero presenti soggetti con sintomatologia clinica riferibile a malattie
infettive, il prelievo di sangue dovrà essere effettuato trascorsi 15 giorni dall'ultimo caso di
malattia.
2.
Prova di sieroneutralizzazione. Uno stallone è considerato sieropositivo se al test di
sieroneutralizzazione viene riscontrato un titolo anticorpale ≥a 4.
EVA - Arterite Virale Equina
b) Isolamento e identificazione del virus dell'arterite virale equina in colture cellulari
1. Raccolta dei campioni di sperma. Per l'isolamento del virus è essenziale disporre dello sperma
degli stalloni. Lo sperma deve essere raccolto mediante vagina artificiale a fondo cieco (tipo
Colorado o Missouri). Per il lavaggio dei genitali dello stallone prima del prelievo non devono
essere impiegate soluzioni disinfettanti e la temperatura interna della vagina artificiale non deve
essere superiore a 40 °C. Ai fini dell'isolamento virale è necessario raccogliere campioni di
sperma contenenti sia la parte liquida sia la frazione cellulare dell'eiaculato. Il campione deve
essere quindi conservato in ghiaccio secco e comunque trasportato immediatamente al
laboratorio in regime di refrigerazione.
2. Isolamento del virus.
Interpretazione dei risultati. Uno stallone sieropositivo viene considerato eliminatore quando
il virus, isolato da almeno uno dei 3 campioni di sperma prelevati a distanza di 10-15 giorni,
viene identificato come virus dell'arterite equina. Uno stallone sieropositivo non è da considerare
eliminatore se dai 3 campioni di sperma, di cui al precedente paragrafo, non viene isolato il virus
ell'arterite equina.
MORVA
•patologia batterica che interessa i perissiodattili
•grave zoonosi
• causata da Burkholderia mallei (previously known as Pseudomonas mallei,Yabuuchi et al.,
1992)
• trasmissione avviene tramite contatto diretto, mediante aerosol o,indirettamente, con
mangime, acqua o oggetti contaminati.
•asini e muli sviluppano forma acuta con esito letale
•cavallo generalmente sviluppa la forma sub-acuta – cronica a più lento decorso
•forma nasale esioni a livello del setto nasale con essudato- purulento interessamento
linfonodale sottomascellare
•forma cutanea “farcino morvoso” con formazione di noduli a livello del derma
•forma polmonare
•In Europa occidentale la malattia è stata eradicata
•persiste in alcune aree in Asia, Africa e Sud-america (Turchia ?)
•Rischi di introduzione tramite importazioni illecite
•Non esistono vaccini
MORVA
Diagnosi sierologica
•fissazione del complemento
•Positivi titoli > = 1:5
Rinopneumonite Virale (Herpesvirus Equino-EHV)
L’Herpesvirus Equino (EHV) è un virus che si trova tra gli equini di tutto il mondo. I
due ceppi più comuni sono l’EHV1 che causa aborto, malattia respiratoria e paralisi e
l’EHV4 che causa solo malattia respiratoria e occasionalmente aborto.
L’EHV, per effetto del D.P.R. 320/1954 - Regolamento di Polizia
Veterinaria-, è considerata una malattia infettiva soggetta ad obbligo di
denuncia.
L’infezione può essere trasmessa tra cavalli nei seguenti modi:
-per via respiratoria
-per contatto con feti abortiti o cavalle che hanno abortito membrane
fetali e fluidi(sono una fonte particolarmente pericolosa di infezione)
Rinopneumonite Virale (Herpesvirus Equino-EHV)
Diagnosi sierologica su campioni di sangue/siero:
•Sieroneutralizzazione
•Diagnosi virologica su tamponi nasali/organi/liquidi di lavaggio
•PCR
Molto diffusa la somministrazione di vaccini
Il Controllo Ufficiale della riproduzione animale
Grazie per l’attenzione
Empoli, Mercoledì 11 Novembre 2015