Clinica molecolare
(molecular medicine):come
utilizzare le informazioni del
genoma per studiare le
patologie genetiche
Clinica molecolare
Nuova branca della medicina che nasce
2.400 anni fa con Democrito che propone
come:
“gli organismi viventi siano composti da
arrangiamenti di atomi che sono
continuamente persi e immediatamente
rimpiazzati”
Clinica molecolare
La moderna medicina molecolare si
occupa di identificare, analizzare e
diagnosticare (in fenotipi patologici o
come fattori suscettibilità) le basi
molecolari delle patologie umane
Clinica molecolare
E’ importante per una corretta definizione
molecolare di una patologia umana una
definizione ottimale del fenotipo
(fenomica).
Questa può indirizzare in modo mirato e
accurato accertamenti specifici in grado di
definire sia il genotipo (analisi genomica
su DNA) che il ribotipo (analisi ribomica
su RNA)
Dissezione del fenotipo
5
Dissezione del fenotipo
(Fenomica)
(1) Esame obiettivo (specialistico)
(2) Consulenza Genetica (Genetica clinica, analisi
del pedigree, valutazione componente genetica
di un fenotipo, valutazione rischi empirici di
ricorrenza, inquadramento genetico)
(3) Esami strumentali specifici (EMG, TAC, RMN,
etc.)
(4) Esami biochimici (dosaggi enzimatici, dosaggi
di metaboliti, ect)
(5) Esami di proteomica (analisi delle proteine,
Western blotting, immunoistochimica,etc.)
(6) Valutazione interazione con fattori ambientali
6
Genotipo
DNA
Replicazione
Riparo
Trascrizione
RNA
Traduzione
Proteine
Recettori
Fenotipo
7
Correlazione
genotipo-fenotipo
Correlazione genotipofenotipo
E’ complessa
Patologie “mendeliane”
Patologie poligeniche
Patologie multifattoriali
Correlazione genotipofenotipo
Per le patologie mendeliane
apparentemente più semplice
(correlazione con l’effetto della
mutazione sul ribotipo e sul
proteotipo)
Correlazione genotipofenotipo: mendeliane
Problema delle interazioni
genetiche (genotipi complessi,
modelli digenici, pathways)
regolazione dell’espressione
genica (tessuto specificità, fattori
trascrizionali e regolativi, splicing)
Correlazione genotipofenotipo: poligeniche e
multifattoriali
Geni suscettibilità!
Correlazione genotipofenotipo: poligeniche e
multifattoriali
Analisi di associazione
The Genotype-Phenotype Correlation
Clinical Phenotype
Instrumental parameters
mRNA Expression, Enzyme Activity, Interaction with other proteins
Genotype
14
IL PERCORSO DELLA GENETICA
Strategie per
l’identificazione di geni
malattia
Quattro metodi per identificare un
gene patologico
Gene patologico non
identificato
Le basi biochimiche
della patogenesi
sono conosciute
Prodotto
genico
Saggio
funzionale
Si conosce la
localizzazione
subcromosomica
Si conosce la
patogenesi
molecolare di
fenotipi patologici
strettamente
correlati
Idea generale
sulla
patogenesi
molecolare
Clonaggio
posizionale
Candidato per
posizione
17
Clonaggio funzionale
Candidato
Utilizzo dei vari metodi nel tempo
% del totale
1980
funzionale
Progetto
Genoma Umano
1985
start ►
1990
candidato
1995
Posizionale
Progetto
Genoma Umano
completo ►
candidato per
posizione
2000
2005
18
Clonaggio funzionale
Alcune informazioni sulla funzione del gene
vengono sfruttate per isolare un clone del
gene. Se il prodotto genico è noto, la
parziale purificazione del prodotto può
permettere l’adozione di varie strategie per
identificare il gene responsabile.
Alternativamente, può essere usato un
saggio funzionale per controllare la
presenza del gene. Questo approccio è
stato utile solo in pochi casi.
19
Clonaggio posizionale
Significa isolare il gene conoscendo solo la sua
localizzazione subcromosomica, senza utilizzare
alcuna informazione riguardante la patogenesi o la
funzione biochimica. La strategia è di cercare di
costruire la mappa fisica e la mappa genetica della
regione, precisare la localizzazione subcromosomica
e poi identificare i geni presenti nella regione per
valutarli come possibili geni patologici. Il clonaggio
posizionale rimane arduo e sta diventando sempre
meno necessario per l’accumularsi di informazioni
che permettono un approccio posizionale al gene
candidato
20
POSITIONAL CLONING
21
ANALISI DI LINKAGE (CONCATENAZIONE)
•L’analisi di linkage permette determinare la posizione
cromosomica di un locus responsabile di una determinata
malattia/carattere genetico rispetto a marcatori polimorfici la
cui localizzazione è nota
•L’analisi di linkage è un approccio molto utile per il mappaggio
e l’identificazione di geni responsabili di malattie genetiche
Mendeliane
(oltre 1,400 geni identificati)
•Più difficoltosa è l’identificazione dei numerosi geni implicati
in malattie più comuni, ad ereditarietà complessa
(pochissimi geni identificati finora)
22
REQUISITI
per l’ANALISI DI LINKAGE DI CARATTERI MENDELIANI
1) Una o più famiglie in cui segrega il carattere/malattia in questione
= individuo affetto
23
MARCATORI MOLECOLARI (DEL DNA)
RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
•Presenza/assenza sito di taglio di enzima di restrizione
•Biallelici
•Southern blot / PCR
MICROSATELLITI
• ripetiz in tandem di 2-3-4 nucleotidi (CA)n
•Molti alleli, molto informativi
•Distribuiti in modo uniforme nel genoma. ≈ ogni 100 Kb
•PCR / marcatura con fluorescenza
SNPs (Single Nucleotyde Polymorphisms)
•Differenze di singola base, non necessariamente riconosciuti da enz. di restriz.
•Biallelici
•Molti frequenti,
•Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in larga scala
24
REQUISITI
per l’ANALISI DI LINKAGE DI CARATTERI MENDELIANI
2) MARCATORI GENETICI
• Polimorfici -> presenza di 2 o + alleli
alternativi
• Allele più raro con frequenza di almeno 1%
nella popolaz.
• Facilmente tipizzabili e stabili di generazione
in generazione
• Posizione nota nel genoma
Gli individui delle famiglie vengono tipizzati per un
set di marcatori polimorfici distribuiti su tutto il
genoma o in particolari regioni candidate
Per tutti i cromosomi sono state create mappe
genetiche di marcatori polimorfici
25
GENOME WIDE SCAN
Marcatori polimorfici
distribuiti su tutto il
genoma
26
TABELLA LOD SCORES A 2 PUNTI
(Abifadel et al. Nat Genet 34:154, 2003)
27
COSTRUZIONE DI APLOTIPI: definizione della regione critica
28
Geni e patologie identificati con:
Clonaggio posizionale
1986
• Distrofia muscolare di
Duchenne
• Retinoblastoma
1989
• Fibrosi cistica
1990
• Neurofibromatosi di tipo 1
• Tumore di Wilms
1991
• Aniridia
• Poliposi familiare del colon
• Sindrome dell’ X fragile
• Distrofia miotonica
1993
• Malattia di Huntingtion
• Sclerosi tuberosa
• Malattia di von Hippellindau
1994
• Acondroplasia
• Cancro mammario/ovarico
a esordio precoce
• Malattia del rene
policistico
1995
• Atrofia muscolo spinale
29
Allestire un percorso di medicina
molecolare
FENOMICA
ANALISI DI LINKAGE (albero informativo)
• Ricerca marcatori appropriati e loro designing
ANALISI MOLECOLARE GENE CANDIDATO
• Ricerca geni candidati (pubmed-OMIM-HGDB)
• Valutazione anatomia genomica dei geni candidati
• Valutazione espressione geni candidati
• Sequenze annotate in HGMP
• Gene Card
• Strategie molecolari
• Analisi dei dati molecolari (HGMP blast, HGDB, database
specifici)
• Validazione delle mutazioni identificate (ESE finder, etc)
30
WES
31
ricadute immediate
2) Microarray technology:
- Whole genome microarrays
Identifica in maniera comparativa variazioni nell’espressione genica
- Comparative genomic hybridization (CGH)
Identifica in maniera comparativa delezioni o duplicazioni
- Chromatine immunoprecipitation on chips (ChIP on Chip)
Identifica in maniera comparativa variazioni nella metilazione del
DNA e nel legame di fattori di trascrizione alle regioni promotori dei
geni
Microarray technique
Hybridization of nucleic acids is based on complementarity
A DNA or RNA “probe” is a single strand nucleid acid whose
nucleotide sequence allows it to hybridize uniquely to its
complementary nucleic acid
In classical techniques such as Southern or Northern blotting
The labeled probe
DNA or RNA are
separated on a gel
The gel is transfered to
a filter
finds complementary
targets
Hybridization to solid-state probe array allows detection of
multiple sequences in the same complex sample
Individual probes are
spotted to a filter
…and hybridized
to the filter
RNA or DNA are
extracted from tissues
… labeled during RT
DNA microarrays
DNA chips: thee are currently two major types available:
cDNA microarrays
10,000 - 20,000 probes / cm2 are spotted
on glass slides using an automated
microarrayer
Probes are cDNA or PCR products
representing known genes or simply
EST
Oligonucleotide arrays
Up to 250,000 oligonucleotides / cm2 are
sythesized directly on the chip surface,
using a photolitographic technique.
These 20-25nt long oligonucleotides
represent sequences of known genes or
EST
Highly parallel probe
arrays: “DNA chips”
Dot diameter: 200µm
Pitch: 400 µm
Fluorochrome labelling of DNA and RNA
RNA from sample and from reference are
labeled by introducing two different
fluorochromes.
This allows co-hybridization of the two
samples to the same chip, providing
direct comparison by two-color analysis
Use of microarrays for Gene
Expression Profiling
“Test” sample (tumor tissue, stimulated cells)
RNA Extraction,
cDNA Synthesis
and labelling
Hybridization
“reference” sample (normal tissue, unstimulated cells)
Transformation to
Gene Id.
Sample X
Laser scanning of
individual chips
equal to median
HNF3a
KDR/Flk1
ERα
Keratin 17
Troponin I
Integrin β4
GATA bp3
AP-2α
+1-3-fold
…….
false-color code
->6-fold
-3-6-fold
Representation
-1-3-fold
of results
+3-6-fold
……
+>6-fold
…..
….
...
Cluster analysis 1
->6-fold
-1-3-fold
T47D
MCF7
BT474
SKBR3
equal to median
BT549
MDAMB231
HUVEC
HMEC
-3-6-fold
+1-3-fold
+3-6-fold
+>6-fold
HNF3α
KDR/Flk1
ERα
Keratin 17
Troponin I
Integrin β4
GATA bp3
AP-2α
Cluster analysis 2
->6-fold
-1-3-fold
T47D
MCF7
BT474
SKBR3
equal to median
BT549
MDAMB231
HUVEC
HMEC
-3-6-fold
+1-3-fold
+3-6-fold
+>6-fold
KDR/Flk1
AP-2a
Troponin I
Keratin 17
Integrin b4
HNF3a
GATA bp3
ERa
GeneChip experiments: data analysis
`Unsupervised cluster analysis´: Pattern
recognition algorithms are used to identify
subgroups of tumors that have related gene
expression patterns.
`Supervised approach´: Statistical methods
are used to compare gene expression data
between different groups that have been
predefined according to their clinical
characteristics.
Applicazioni della “microarray technology”
1) Classificazione molecolare delle malattie
2) Identificazione di nuovi target terapeutici
3) Identificazione dei meccanismi molecolare di funzionamento dei
farmaci
La bioinformatica come
tool per la analisi di geni
malattia
Genoma Umano
3000 Mb
Geni e sequenze associate
DNA extragenico
900 Mb
2100 Mb
Non codificante
Codificante
DNA unico e a
DNA ripetitivo
810 Mb
90 Mb
basso numero
420 Mb
di copie
1680 Mb
Introni
Pseudogeni
Regioni di
Ripetuto in tandem
Minisatelliti
Microsatelliti
Disperso
SINE
LINE
controllo
Satellite
Il DNA spazzatura è veramente tale?
Retroposoni
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/
- OMIM: online mendelian inheritance in man
- Creato da Victor McKusick
- Continuamente aggiornato
- Punto chiave per acquisire informazione sui caratteri mendeliani
umani, patologici e non
- A ogni carattere viene attribuito un numero a 6 cifre MIM
How is genomics impacting on the practice of medicine?
…(genomics) catalogues only the birth of the genomic era
and thus no more captures in detail the ultimate effect of
genomic medicine than does the examination of a newborn
foretell what the mature adult will be like…
ricadute immediate
1) Identificazione rapida di patogeni di recente scoperta (SARS)
NAVIGARE NEI
GENE
DATABASE
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
How to build up a gene-specific molecular
testing
Gene cards
The AceView genes
(last updated September 13th, 2005)
77
agttatgtgacactttatctttcattgttatgaattgcctttttactttt
tgcagtcttgcgttgaaatgtatcagaaactataatgtaaaaaaaagctg
agtagaaatcttataattaaaagttgtagcaagtcatgaaaatggctcat
gcttttattgccattttgatgtttttgatggcaaaagtgttgagaaaaag
tctttagattcacgtgataagctgacagagtgaaacatcttaaggcttga
aagggcaagtagaagttataattattgtgtagattcacagtccttgtatt
gaattactcatctttgctctcatgctgcagGCCATAGAGCGAGAAAAAGC
TGAGAAGTTCAGAAAACTGCAAGATGCCAGCAGATCAGCTCAGGCCCTGG
TGGAACAGATGGTGAATGgtaattacacgagttgatttagataatcttct
tagggatttgataaacacataggttcatatttatcagctgaattatatca
gacaagcacttgttaaatacaaatttaaattaaaaggtgtttgtatgttt
tttattattctttttttaatgctaaggaaattattaggagaaattcaact
ttgagttcattggaagaaaatgggatgtggtagaatattttatcagtctg
tagcagagaaataaattttaatgcaaatctgctagaatttatccaaataa
tttaagaaaataaggttaacagaaatttgaaaacattaacagtcatgtta
Exon 44
mRNA summary
cDNA clones
Gene summary
Protein
annotation
mRNA structure
Sequences
Diagram
Phenotype
Function
Expression and
regulation
Introns and exons
Gene card
