Fondamenti di Microbiologia CH2O CH3COOH ....... Substrati Biomasse Interazioni fra Molecole e Microrganismi E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 1 Importanza dei microrganismi nell’ambiente I microrganismi sono presenti ovunque: Nel terreno, come decompositori Microrganismi Nell’acqua, come catalizzatori biologici In organismi più complessi come parassiti, con funzione di catalizzatori biologici E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 2 Alcuni microrganismi di rilevanza ambientale NH4+ Nitrosomonas NO2- Nitrobacter NO3- Acinetobacter N2 ¾ Nitrosomonas: effettua l’ossidazione dell’ammoniaca in nitriti. ¾ Nitrobacter: prosegue l’opera del precedente ossidando i nitriti a nitrati completando così l’ossidazione biologica dell’ammoniaca. ¾ Acinetobacter, Lampropedia: batteri che effettuano la denitrificazione (trasformazione da nitrato ad azoto atmosferico) ed accumulo di polifosfati ¾ Rhizobium: bacillo aerobico che fissa l’azoto atmosferico in noduli associati alle radici delle leguminose ¾ Methanobacterium, Methanococcus: batteri metanogeni in ambiente anaerobico ¾ Microthrix parvicella, Nocardia: microorganismi filamentosi presenti nei fanghi attivi, dove creano problemi di sedimentazione E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 3 Dinamica dei microrganismi ¾ I microrganismi possono adattarsi a qualsiasi condizione ambientale ¾ Molti di essi svolgono funzioni utili o addirittura essenziali per l’ecosistema (degradazione inquinanti, decomposizione dei detriti, produzione di sostanze utili) ¾ Si tratta di organismi elementari (unicellulari) ¾ Il loro metabolismo è molto semplice ¾ Assimilano nutrienti (substrato) attraverso la membrana cellulare ¾ La immagazzinano e la trasformano al proprio interno per ricavarne energia e con questa fabbricare altro materiale cellulare ¾ In mancanza di nutriente esterno, utilizzano materiale nutriente di riserva accumulato nella cellula (crescita sbilanciata) ¾ Si riproducono per scissione E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 4 Ripartizione del Substrato ¾ Il metabolismo dei microorganismi sfrutta il substrato attraverso due diversi percorsi metabolici ¾ Il cammino anabolico converte il Substrato in Biomassa ¾ Il cammino catabolico produce l’Energia necessaria a questa trasformazione BIOMASSA Anabolismo SUBSTRATO Catabolismo ENERGIA E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare Una parte del substrato è convertita in energia biodisponibile per l’assimilazione della restante parte pag. 5 Ingredienti per il metabolismo cellulare ¾ La cellula ricava energia per la crescita ed il mantenimento attraverso reazioni di Ossido-Riduzione (RedOx) ¾ Esse hanno bisogno dei seguenti quattro elementi: ¾ Sorgente di Energia ¾ Fornisce l’energia per le reazioni Anaboliche (Sintesi) ¾ Sorgente di Carbonio ¾ Viene convertito in materiale cellulare (protoplasma) ¾ Donatore di Elettroni ¾ Alimenta la semireazione di ossidazione ¾ Accettore di Elettroni ¾ Alimenta la semireazione di riduzione E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 6 Sorgente di Carbonio ¾ Il Carbonio utilizzato può essere: ¾ Carbonio Inorganico (CO2 atmosferica o disciolta nell’acqua) ¾ Carbonio Organico ¾ Nel primo caso si ha a che fare con microorganismi autotrofi in quanto sintetizzano biomassa (materia organica ~ nCH2O) a partire da sostanze inorganiche ¾ Nel secondo caso si hanno microorganismi eterotrofi, in quanto la biosintesi si basa su composti organici ¾ In questo caso la sorgente di energia coincide con la sorgente di carbonio (organico) E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 7 Forme di carbonio ¾ Carbonio inorganico ¾ ¾ ¾ ¾ Nella molecola c’è un solo atomo di Carbonio Carbonio in forma ossidata La disponibilità di C. inorganico è legato all’equilibrio dei carbonati Fase gassosa CO2( g ) ¾ Fase liquida CO2( aq ) ↔ H 2CO3 ↔ H + + HCO3− ↔ 2 H + + CO32 − ¾ Carbonio organico ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ Ogni atomo di Carbonio è legato ad altri atomi di Carbonio Unica eccezione: Metano (CH4) - unico atomo di C Carbonio in forma ridotta Composti in grado di fornire energia per ossidazione Es. Carboidrati, Acidi grassi, Proteine, etc….. E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 8 Costituenti del metabolismo batterico Sorgente di Energia Micro organismi Sorgente di Carbonio Energia Solare Manca lo stadio di riduzione Fotoautotrofi Chemioautotrofi CO2 CO2 Donatore di elettroni Accettore di elettroni H2S H2O Non necessario perché manca lo stadio riducente H2O CO2 Composti inorganici H2, Fe++, S--, NH4+,NO2- Energia Chimica La sorgente di energia ed il donatore di elettroni concidono C - organico C - organico Chemioeterotrofi C - organico E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare C - organico O2 NO3- Processo Fotosintesi batterica anaerobica Fotosintesi batterica aerobica Fotosintesi algale Ossidazione + Assimilazione O2 Respirazione aerobica NO3- Respirazione anossica C - organico Fermentazione anaerobica pag. 9 Scambio elettronico nei vari metabolismi eterotrofi Il tipo di trasformazione che il Carbonio organico subisce dipende dai livelli energetici disponibili, che sono tipici di ciascun metabolismo. Fermentazione anaerobica Trasformazione del Carbonio Accettore di elettroni Substrato organico C Prodotti di fermentazione Flusso interno di e- Respirazione anossica Substrato organico Respirazione aerobica C CO2 molto negativo ≈ −400 mV ÷ −100 mV E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare C CO2 e- NO3 -, SO4 --, CO3 -- Ossido-Riduzioni interne Substrato organico e- O2 POTENZIALE REDOX debolmente negativo o circa zero ≈ −50 mV ÷ 10 mV positivo > 10 mV pag. 10 Modelli di metabolismo cellulare (1) Growth-decay: Una parte dell’organismo scompare per fornire energia per il mantenimento cellulare (approccio classico). Non è in grado di spiegare fatti sperimentali, come le brusche variazioni di consumo di ossigeno. XH decay SS hydrolysis XS Death-regeneration: Il materiale cellulare in decadimento viene rilasciato attraverso la lisi cellulare, senza consumo di ossigeno. XH E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare Substrato esterno (particolato) decay fP X H XI growth La frazione non-biodegradabile XI=fPXH rimane come materiale inerte SS La rimanente frazione XI=(1-fP)XH è considerata nuovamente disponibile come lentamente biodegradabile (approccio ASM3) XI growth (1 − f P )X H hydrolysis XS Materiale cellulare disponibile come particolato Substrato esterno pag. 11 Caratterizzazione del materiale a base carboniosa Il substrato è caratterizzabile indirettamente attraverso il suo equivalente in ossigeno o in carbonio (contenuto energetico) ¾ BOD (Biochemical Oxygen Demand) (mg O2/l) ¾ Quantità di O2 necessaria per ossidare biologicamente il substrato ¾ Riflette perfettamente i meccanismi naturali di biodegradazione ¾ COD (Chemical Oxygen Demand) (mg O2/l) ¾ Quantità di O2 necessaria per ossidare chimicamente il substrato ¾ Permette di ricavare “l’equivalente in Ossigeno” dei vari composti organici, unificando la rappresentazione di substrati e biomasse ¾ Rende conto dello scambio di elettroni nelle reazioni di ossido-riduzione fra substrato e biomassa E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 12 BOD ¾ Biochemical Oxygen Demand: misura l’ossigeno consumato da batteri (inoculo) per ossidare la sostanza organica. ¾ Due metodi ¾ manometrico (O2 costante) ¾ a depressione (consumo di O2) ¾ Pregi: ¾ Riproduce esattamente la biodegradazione naturale ¾ Difetti: ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ Diluizione del campione Incertezza nell’inoculo Consumo di Ossigeno dovuto alla nitrificazione E’ necessario un tempo considerevole (5 giorni = BOD5) Scarsa riproducibilità E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 13 Misura a depressione del BOD ¾ Si misura l’ossigeno consumato dal metabolismo batterico ¾ Mentre l’ossigeno viene sottratto dallo spazio di testa nella bottiglia, al suo posto viene rilasciata CO2 come prodotto di respirazione ¾ Questa viene assorbita dal reagente presente nel tappo K (OH)2 P atm 'P O2 CO 2 ¾ Perciò si ha una depressione nello spazio di testa della bottiglia, che viene misurata dal manometro ¾ La durata convenzionale è di 5 giorni → BOD5 E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 14 COD ¾ Chemical Oxygen Demand: ossidazione chimica mediante bicromato di potassio ed acido solforico @ 150 °C. ¾ Non ossida l’Ammoniaca (nessun contributo di nitrificazione). ¾ Riflette il bilancio di Carbonio nelle reazioni biochimiche, ossidando ogni sostanza carboniosa (eccetto alcuni aromatici). ¾ E’ il parametro diretto per l’equivalenza stechiometrica di sostanze carboniose. ¾ Include anche componenti NON biodegradabili, ma questo non è un problema per misure differenziali, es. COD per abbattimento. ¾ Questo difetto è risolto da tecniche analitiche che misurano separatamente COD biodegradabile e nonbiodegradabile. E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 15 Spettrofotometro Misura di assorbanza: ¾ Il campione viene miscelato con dei reagenti e riscaldato per un certo tempo ¾ Avviene una reazione chimica che produce dei composti di un determinato colore e densità ottica ¾ Queste caratteristiche sono proporzionali al COD del campione ¾ La determinazione viene fatta per via spettrometrica: si misura l’assorbimento ottico a determinate lunghezze d’onda E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 16 Misura del COD Le cuvette contengono già i reagenti necessari Variano a seconda del campo di concentrazione che si vuole misurare E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 17 Misura spettrofotometrica del COD CUVETTA SPETTROFOTOMETRO E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare TERMOREATTORE pag. 18 Misura spettrofotometrica del COD 1. Dopo la termodigestione che avviene a 148 °C per 2 ore ottenuta nel termoreattore il campione nella cuvetta è pronto per la misura 2. Notare il colore giallastro della soluzione, che sarà oggetto della misura 3. Si inserisce la cuvetta nell’apposito alloggiamento 4. Lo strumento legge il codice a barre e predispone lo spettro di assorbimento per la misura 5. Premendo il primo tasto in alto si dà inizio alla misura E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 19 Bibliografia Lehninger A.L. Biochimica, Zanichelli, 1982. J. Wanner, Microbial population dynamics in biological wastewater treatment plants, IAWQ Scientific and Technical Report n. 5, 1997. Hemond H.F. e Fechner E. J., Chemical fate and transport in the environment, Academic Press, 1994. Bailey J.E. e Ollis D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, 1986. Battley E.H., Energetics of Microbial Growth, Wiley, 1987. Orhon D., Artan N., Modelling of Activated Sludge Systems, Technomic Publ. Co., 1994. Cloete T.E. and Muyima N.Y.O. (eds.) Microbial Community Analysis, IAWQ Scientific and Technical Report n. 5, 1997. E. Giusti: Fondamenti di bioenergetica cellulare pag. 20