Dipartimento Patologia e Oncologia Sperimentali
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Progetto dal titolo: “Caratterizzazione metabolica di cellule staminali ipossia
resistenti nel modello epatoma ascite. Inibizione del loro sviluppo ad opera di
metaboliti fisiologici”.
Responsabile della ricerca: Dott.ssa Maria Grazia Cipolleschi
In una serie di studi dedicati alla caratterizzazione delle sottopopolazioni cellulari staminali
normali (1-9), abbiamo dimostrato che l’incubazione in ipossia profonda (1% ossigeno) favorisce il
mantenimento del potenziale staminale di popolazioni ematopoietiche murine ed umane. Si è infatti
osservato che in ipossia le cellule staminali ematopoietiche (HSC) vengono mantenute meglio che
in normossia, mentre i progenitori meno immaturi (CFC) vengono eliminati. Inoltre l’adattamento
all’ipossia è risultato tanto maggiore quanto più alto è il livello del progenitore nella gerarchia
ematopoietica (2, 6). La peculiare resistenza all’ipossia delle HSC è in grado di consentire la loro
sopravvivenza in aree caratterizzate da tensioni di ossigeno particolarmente basse, la cui esistenza
in condizioni fisiologiche è coerente con una serie di informazioni sulla struttura e la
vascolarizzazione del tessuto ematopoietico. Si è così ipotizzato che in queste aree, che abbiamo
denominato "nicchie staminali ipossiche", l’ipossia contribuisca a mantenere le proprietà staminali
inibendo il commissionamento delle HSC alla generazione di progenitori meno immaturi, ipossiasensibili, quali le CFC (2). La questione degli effetti dell’ipossia sulle CSC, che sembrano
mantenere molte caratteristiche delle cellule staminali (10), richiede di essere esaminata nel
contesto sopra delineato. Il microambiente tumorale è infatti costantemente caratterizzato dalla
presenza di zone profondamente ipossiche, dato che l’irrorazione sanguigna della massa cellulare
neoplastica è, fino dalle fasi iniziali dello sviluppo della malattia, fortemente irregolare e spesso
insufficiente. Ciò pone l’adattamento all’ipossia, che favorisce il mantenimento e l’amplificazione
staminale, tra gli aspetti principali della cancerogenesi, aspetto che viene in effetti oggi indicato
come elemento rilevante delle sue fasi iniziali (11). La capacità di resistere all’ipossia risulta
peraltro cruciale per il successivo processo di progressione neoplastica, essendo l’ipossia stessa un
induttore di instabilità genomica (12). Le cellule capaci di sopravvivere in ipossia sono pertanto
bersagli preferenziali di mutazioni che, una volta sottoposte a selezione microambientale di tipo
1
darwiniano, hanno una elevata probabilità di generare cloni caratterizzati da un crescente vantaggio
proliferativo rispetto alle altre cellule del tessuto.
Sulla base di quanto sopra, nel nostro laboratorio sono da tempo in corso studi incentrati
sulla riproduzione in vitro di “nicchie staminali ipossiche” sperimentali, dove le CSC possano
essere mantenute in un ambiente selettivo paragonabile al loro habitat in vivo. Questo sistema
sperimentale facilita grandemente studi sulle CSC diretti a svelarne le peculiarità fenotipiche e
metaboliche sulle quali basare i suddetti orientamenti terapeutici. Il presente programma di ricerca
si basa su una serie di studi condotti nel nostro laboratorio nell’ultimo decennio. Tali studi hanno
permesso: a) l’allestimento di un metodo di arricchimento delle sottopopolazioni staminali
neoplastiche basato sull’incubazione della popolazione tumorale complessiva in ambiente
fortemente ipossico; b) la caratterizzazione di popolazioni staminali di epatoma AH130 di Yoshida
spontaneamente sincronizzate in vivo in seguito al loro arresto in fase G1 per carenza di O2 e
nutrienti.
Utilizzando queste popolazioni si sono ottenuti i seguenti risultati: la respirazione
mitocondriale è indispensabile per la crescita tumorale in quanto trasporta fino all’O2 gli equivalenti
riducenti (elettroni) derivati dalle numerose reazioni ossidative che contribuiscono al metabolismo
cellulare, mentre la funzione energetica di questa catena (cioè il rifornimento di ATP) può essere
facilmente sostituita dalla glicolisi. In altre parole il compito fondamentale della respirazione
mitocondriale consiste nella regolazione del cosiddetto stato redox che rappresenta il turnover
generale degli elettroni espresso dai rapporti NAD(P)/NAD(P)H. Tra le varie vie metaboliche
controllate da questi rapporti le più importanti ai fini del risveglio replicativo delle cellule staminali
sono risultate quelle strettamente connesse con processi ossido-riduttivi del metabolismo del folato
che utilizzano questa vitamina nella sintesi dell’anello purinico, tappa indispensabile per la sintesi
del DNA. Da queste ricerche è risultato che l’aggiunta al mezzo di incubazione delle cellule
staminali del principale substrato fisiologico del Ciclo degli Acidi Tricarbossilici (TCA) o ciclo di
Krebs, il piruvato, produce un forte effetto citostatico sul processo di espansione proliferativa delle
stesse cellule staminali. Ciò è dovuto ad una vera e propria saturazione che gli equivalenti riducenti,
derivati dal piruvato, producono sulla catena respiratoria mitocondriale impedendo così l’espletarsi
della via redox del metabolismo dei folici. Questa saturazione si verifica solo in cellule che, come
quelle staminali, sono costituzionalmente dotate di una scarsa capacità respiratoria a seguito del loro
adattamento all’ipossia.
Una ulteriore importante acquisizione emersa dai nostri studi è stata ottenuta con la
dimostrazione che la tappa metabolica respiratorio-dipendente del reclutamento in ciclo delle
cellule staminali, inibita dal piruvato, è bloccata altresì dall’aggiunta del prodotto terminale del
processo redox che porta all’utilizzazione del folato nella sintesi dell’anello purinico. Tale prodotto
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è il tetraidrofolato, che si produce mediante un processo di riduzione da diidro- a tetraidrofolato ad
opera di un enzima fondamentale per la crescita cellulare, la diidrofolicoredattasi (DHFR).
È risultato che la somministrazione della forma ossidata del folato rimuove l’effetto inibente
del piruvato in quanto la suddetta riduzione operata dalla DHFR produce il NADP necessario allo
svolgimento del processo redox del folato stesso. In queste condizioni l’aggiunta del tetraidrofolato,
inibisce il rifornimento del NADP, esercitando, di conseguenza, un forte effetto citostatico.
In conclusione le nostre ricerche hanno dimostrato che metaboliti fisiologici essenziali,
come il piruvato e il tetraidrofolato, possono, se impiegati a dosi farmacologiche, comportarsi come
agenti citostatici sui compartimenti staminali, cioè su cellule il cui equilibrio ossido-riduttivo può
essere decisamente alterato dal loro impiego. Questi risultati sono stati esposti in un lavoro
attualmente in corso di pubblicazione e del quale alleghiamo una copia.
Programma di ricerca
Gli obiettivi del presente programma è dettato dai risultati ottenuti dagli studi fin qui condotti sul
metabolismo delle cellule staminali tumorali che hanno dimostrato l’effetto citostatico del piruvato
e del tetraidrofolato.
Obbiettivo n°1. Caratterizzazione metabolica di popolazioni staminali tumorali sensibili
all’effetto citostatico del piruvato e del tetraidrofolato. Saranno impiegate popolazioni staminali
tumorali di vario tipo (epatoma, neuroblastoma, melanoma, leucemie mieloidi e linfoidi acute e
croniche) esaminate attraverso uno screening iniziale basato sulla sensibilità all’effetto citostatico
del piruvato in aggiunta o meno al tetraidrofolato. Il metabolismo energetico e la distribuzione in
ciclo delle cellule sensibili saranno analizzati mediante le tecniche biochimiche e biomolecolari
attualmente in uso nei nostri laboratori.
Obbiettivo n°2. Verifica dell’attività citostatica del piruvato e del tetraidrofolato sullo sviluppo
tumorale in vivo. L’effetto citostatico del piruvato e del tetraidrofolato sulle cellule staminali
risultate sensibili in vitro sarà verificato in vivo, mediante esperimenti di trapianto delle linee
tumorali sensibili in topi immuno-deficienti (topi nudi o scid). Le informazioni così ottenute
saranno messe a disposizione di un gruppo di oncologi clinici, tra cui il Prof. Di Leo, primario
oncologo presso l’ospedale di Prato, per discutere l’eventualità di un loro utilizzo ai fini di
protocolli clinici in cui gli effetti citostatici del piruvato e del tetraidrofolato potrebbero essere
associati a comuni trattamenti antiblastici.
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Riferimenti bibliografici
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