TAPPE STORICHE DEL CONCETTO DI MALATTIA

TAPPE STORICHE DEL CONCETTO DI MALATTIA
Patologia d’organo
(Morgagni)
Relazione fra malattia e lesione anatomopatologica
Patologia cellulare
(Virchow, microscopia ottica)
Relazione fra alterata funzione e difetto di
cellule o tessuti
Patologia metabolica
(biochimica)
Relazione fra alterata funzione e alterazioni
biochimico-metaboliche
Patologia subcellulare
(microscopia elettronica e
biochimica frazioni subcellulari)
Relazione fra alterata funzione e difetto a
livello di organelli e strutture sopramolecolari
Patologia molecolare
(Relazioni genotipo-fenotipo)
Relazioni fra alterata funzione e difetto a livello
di singola molecola
Medicina molecolare
Genomica e post-genomica
REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE I
REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE II
REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE III
Controllo trascrizionale del gene della Globina
Controllo trascrizionale di geni fotoresponsivi
TRADUZIONE
Zinc Finger
Helix Loop Helix
Leucine Zipper
FENOMENI COTRADUZIONALI/
POST-TRASCRIZIONALI
Lamda Repressor
IMPORTANZA DEL FOLDING
CLASSIFICAZIONE DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE
ALTERAZIONI DELLA MOLECOLA DI DNA
ROTTURA:
- ossidazione
- idrolisi
delezioni, inversioni, traslocazioni
MODIFICAZIONI DI SEQUENZA:
- mutazioni puntiformi
- microdelezioni
modificazioni di sequenza
aminoacidica, frameshift, splicing
INTRODUZIONE DI SEQUENZE:
- mutagenesi inserzionale
- amplificazione
alterazioni qualitative e/o
quantitative del trascritto
EPIGENETICHE:
- configurazione cromatina,
- metilazione, acetilazione, ecc.
alterata espressione genica
Meccanismi di alterazioni del DNA
Agenti che danneggiano il DNA
•
Radicali dell’ossigeno: rottura scheletro, ossidazione basi azotate
- endogeni (mitocondri, reticolo, perossisomi)
- esogeni (xenobiotici, farmaci, alimenti, fumo, ecc)
•
•
•
•
•
•
Radiazioni
- UV: formazione di dimeri di purine
- radiazioni ionizzanti: danno diretto alle basi azotate e formazione di
radicali liberi
Chimici ambientali e farmacologici: rottura scheletro, mutazioni puntiformi,
depurinazione, metilazione, addotti
agenti alchilanti
analoghi delle basi puriniche e pirimidiniche
metaboliti reattivi che formano addotti covalenti
Agenti virali: mutagenesi inserzionale
Tipi di danno al DNA
•
•
•
•
•
•
•
•
Mismatches per errori di replicazione del DNA (errori DNA polimerasi)
Modificazioni di una o più basi in qualsiasi posizione
Alterazione della metilazione genica (ipo/iperespressione del gene)
Rotture (radiazioni e chimici) della singola o della doppia elica con possibilità di
delezioni e traslocazioni
Cross-links, legami covalenti tra le basi (chemioterapici) delle due catene
Formazione di addotti covalenti con molecole esogene
Errori dell’appaiamento dei cromosomi
Non disgiunzione cromosomica
•
Alterazione dei meccanismi di riparazione del DNA
Meccanismi di alterazioni del DNA
Meccanismi spontanei
•
•
•
Il DNA subisce cambiamenti
continuamente:
A. Depurinazione: Rottura per
idrolisi spontanea dei legami
delle purine con il desossiribosio
(perdita di circa 5000 purine al
giorno /cellula umana).
B. Deamminazione: idrolisi
spontanea del gruppo amminico
con trasformazione della citosina
a uracile (frequenza di circa 100
basi al giorno)
B. IDROLISI
IDROLISI
A. IDROLISI
influenzate da fluttuazioni termiche
Meccanismi di alterazioni del DNA
Danni causati da agenti alchilanti
•
•
Agenti alchilanti (carcinogeni ambientali o chimici) attaccano
preferenzialmente adenina e guanina (purine) rendendo più labile il legame
con il deossiribosio e favorendo la depurinazione. La replicazione del
DNA apurinico può generare una mutazione per sostituzione casuale della
base.
Altri agenti alchilanti, come l’ethylmetane sulfonate (EMS) agiscono
trasferendo gruppi etilici e metilici al DNA, causando disappaiamento
delle basi.
Meccanismi di alterazioni del DNA
Danni causati da raggi ultravioletti
•
•
•
Radiazioni UV agiscono sul DNA,
provocando cross-link tra
pirimidine adiacenti, con
formazione di dimeri di timina
(preferibilmente), che bloccano la
replicazione del DNA.
Alternativamente, questa può
procedere e le basi relative
vengono inserite casualmente,
risultando in una mutazione
La capacità di mutagenesi degli
UV spiega perchè inappropriata ed
esagerata esposizione fa aumentare
il rischio dei tumori della pelle.
Meccanismi di alterazioni del DNA
Danni causati da raggi gamma e X, radicali liberi
•
•
•
•
I raggi gamma e X oltre ad interagire
direttamente con la molecola del DNA,
ionizzano molecole vicine, come l’acqua,
provocando la formazione di radicali liberi
I radicali liberi contenenti ossigeno sono
estremamente reattivi ed attaccano
immediatamente la molecola di DNA,
alterando le basi per ossidazione e
provocando frequentemente la rottura
della singola o della doppa elica.
Questo secondo evento è molto difficile da
riparare e causa frequentemente mutazioni
Inoltre le radiazioni ionizzanti possono
provocare anche rottura di cromosomi
Meccanismi di riparazione del DNA
•
•
•
•
•
Nonostante le migliaia di modificazioni casuali create ogni giorno
nel DNA di una cellula umana dall’energia del calore, da incidenti
metabolici, da fattori esterni, etc. si accumulano soltanto pochi
cambiamenti stabili (mutazioni)
Meno di un cambiamento accidentale per mille nel DNA provoca
una mutazione, mentre il resto viene eliminato con notevole
efficienza dai meccanismi di riparazione del DNA
Esistono numerosi meccanismi di riparazione, catalizzati da una
serie di enzimi diversi
Quasi tutti questi meccanismi dipendono dalla presenza di due
copie dell’informazione genetica, una su ciascun filamento di DNA
Se la sequenza di un filamento viene accidentalmente cambiata,
l’informazione resta nella sequenza di nucleotidi dell’altro
filamento.
Gli effetti delle alterazioni del DNA dipendono dal
tipo e dall’efficienza dei sistemi di riparazione.
•
•
•
•
•
•
Correzione degli errori durante la replicazione
Correzione del danno degli agenti alchilanti
Riparazione per rimozione e sostituzione di una singola base
Correzione degli accoppiamenti sbagliati
Riparazione mediante escissione di nucleotidi
Riparazione della rottura della doppia catena
Gli effetti delle alterazioni del DNA dipendono dal tipo di
cellula in cui si verificano
•
Nelle cellule germinali:
- malattie genetiche trasmissibili (I e II generazione)
•
Nelle cellule somatiche proliferanti (staminali)
- malattie malformative (durante lo sviluppo)
- tumori
•
Nelle cellule somatiche non proliferanti (differenziate)
- contributo a degenerazione ed invecchiamento
- alterato ricambio dei componenti cellulari
Mutazioni
•
Lesioni accidentali avvengono continuamente nel DNA
- cambiamenti spontanei
- cambiamenti indotti da eventi danneggianti
•
La maggior parte di questi cambiamenti sono temporanei perchè vengono
corretti da processi di riparazione del DNA.
•
Quando questi processi falliscono, si ha un cambiamento permanente nel
DNA: mutazione
•
Se il cambiamento avviene in un punto vitale della sequenza, che codifica
per un gene, o che ne regola lespressione: mutazione genica
MUTAZIONI GENICHE
IL CODICE GENETICO
MUTAZIONI PUNTIFORMI
MODALITA DI MUTAZIONE
Da genotipo a fenotipo
Da genotipo a fenotipo
ALTERAZIONI QUALITATIVE
perdita o guadagno di funzione
ALTERAZIONI QUANTITATIVE
aumento o diminuzione
PATOLOGIA MOLECOLARE DELLE PROTEINE
ASSENZA
ACCUMULO
STRUTTURA ANOMALA
Mutazione genica
Alterazione della trascrizione
Alterazioni della maturazione e/o dello splicing (comprende stabilità mRNA e/o
espressione genica da siRNA - microRNA, antisenso, ecc..)
Alterazioni della traduzione
Alterazioni post-traduzionali (folding, interazioni molecolari, glicosilazione,
idrossilazione, fosforilazione, proteolisi, modificazioni lipidiche):
PROTEOMICA
CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE DA
ALTERAZIONE DI UN SINGOLO GENE IN BASE AL
MECCANISMO D’AZIONE DELLA PROTEINA MUTATA
1)
DIFETTI DI PROTEINE ENZIMATICHE
2)
DIFETTI DEI RECETTORI DI MEMBRANA
E DEI SISTEMI DI TRASPORTO
3)
DIFETTI DEI RECETTORI NUCLEARI
4)
DIFETTI DI PROTEINE NON ENZIMATICHE
5)
DIFETTI CHE COMPORTANO UN’ALTERATA
REAZIONE AI FARMACI
DIFETTI DI PROTEINE ENZIMATICHE
Catalizzatori che aumentano la velocità delle reazioni chimiche
Specificità di substrato
Piccole quantità
Sito attivo
Alterazione qualitativa
Alterazione quantitativa
DEFICIT ENZIMATICO
SUBSTRATO
Enzima 1
PRODOTTO INTERMEDIO 1
Enzima 2
PRODOTTO INTERMEDIO 2
Ciclo metabolico
alternativo
Enzima 3
PRODOTTO FINALE
B
A
D
ACIDO IDROSSIFENILPIRUVICO
ACIDO IDROSSIFENILACETICO
ACIDO OMOGENTISICO
ALCAPTONURIA
ACIDO IDROSSIFENILLATTICO
E
TIROSINOSI
ACIDO MALEILACETICO
ACIDO FUMARILACETACETICO
ACIDO FUMARICO
C
ACIDO ACETACETICO
A
FENILALANINA IDROSSILASI
B
PEROSSIDASI
C
FUMARILACETATO IDROSSILASI
D
TIROSINASI
E
OMOGENTISICO OSSIDASI
FENILALANINA IDROSSILASI (PAH)
(fegato, rene, pancreas)
FENILCHETONURIA
Numerose varianti
Fenilchetonuria classica (PKU): carenza di PAH (98-99%)
Alte concentrazione di fenilalanina nel sangue e nelle urine.
Attivazione di vie metaboliche alternative con formazione di
acido fenillattico, acido fenilperuvico, fenilacetico, acido oidrossi fenilacetico.
Sudorazione con classico odore di muffa o di topo
FENILCHETONURIA CLASSICA
Ritardo mentale (QI >50-60 in meno del 4%); incapacità a parlare e
camminare; convulsioni; ipopigmentazione di occhi, cute, peli;
eczema.
Quadro clinico prevenuto da dieta povera di fenilalanina nei primi
30 giorni di vita: test in neonati
Regime dietetico continuo
Fenilchetonuria materna: effetto teratogeno
Alterazioni cerebrali progressive durante lo sviluppo causate da:
•Iperfenilaninemia (saturazione dei siti di fissazione e assorbimento
degli aa per sintesi proteica cerebrale e mielina e competizione su
tirosinasi per sintesi melanine)
•Carenza di tirosina
•Carenza amine biogene: dopamina, serotonina, noradrenalina
(acido fenilpiruvico che inibisce enzimi)
Diverse mutazioni che inibiscono l’attività di PAH dal 50 al 100%
Quadro clinico in base ad attività enzimatica residua
13 esoni
Mutazioni in tutti gli esoni e
nelle flanking regions
Mutazioni:
Missenso
Non senso
Splicing alternativo
Frameshift
Delezioni
inserzioni
EMOGLOBINOPATIE
Disordini delle emoglobine
Alta diffusione
Elevata morbidità
Meccanismi patogenetici noti a livello molecolare
Mutazioni strutturali dellemoglobina
Alterazioni dellespressione genica delle globine (a e b)
FUNZIONE DELLEMOGLOBINA
Trasporto di ossigeno nei globuli rossi
(6 isoforme)
STRUTTURA DELLEMOGLOBINA
Molecola tetramerica a struttura globulare
Subunità uguali due a due
SUBUNITA
1 catena polipeptidica:
GLOBINA
1 gruppo prostetico:
EME
GLOBINA:
- struttuta ad alfa-eliche (7-8)
conservate
- nicchia idrofobica (EME)
- regione di interazione con
altre subunità
EME:
- pigmento (protoporfirina)
contenente ferro che si
combina con lossigeno
Modificazioni allosteriche :movimento critico nel
contatto alfa1 e beta2
+/- O2
SITI CONSERVATI IN TUTTE LE GLOBINE
F8
(istidina):legame covalente con
il ferro delleme
CD1
(fenilalalnina): incastro della
porfirina delleme nella sua
“tasca”
ISOFORME DELLE GLOBINE
6 DIVERSE ISOFORME
PRODUZIONE EQUIMOLARE
2 globine a e z
2 globine b o g o d o e
2 famiglie di geni (asimili e b-simili)
Duplicazione genica
Periodo di sviluppo
(switch temporale)
Combinazioni delle subunità
CROMOSOMA 16
CROMOSOMA 11
Hb f embrionale
5
z
z2 e2
e
yz
z2 g2
Gg
ya1
a2 e2
Ag
ya2
Hb fetale
a2 g2
a1
Sacco
vitellino
Fegato
fetale
yb
d
a2
3
5
Hb adulta
a2 d2
a2 b2
Midollo
osseo
b
3
EMOGLOBINA ADULTA
Globina b2
Hb A
a2 b2
a
141 aa
b
146 aa
Globina b1
E6
E6
EME
Fe
Movimento critico a1 : b2
nel passaggio tra stato
ossigenato a
deossigenato
EME
PM
64500
Fe
Globina a1
Globina a2
DOSAGGIO GENICO e MALATTIA
4 geni a
2 geni b
Corredo diploide
Alterazioni b globina (50%)
malattia postnatale
Alterazioni a globina (25%)
malattia fetale e post-natale
EMOGLOBINOPATIE
1. VARIANTI STRUTTURALI:
alterazioni della struttura della globina,
senza alterazione della sintesi
2. TALASSEMIE:
diminuzione della sintesi di una o più
globine ---> sbilanciamento delle quantità
relative (a : b)
3. HPFH
Persistenza ereditaria dellemoglobina
fetale
1. VARIANTI STRUTTURALI
Mutazioni puntiformi
Mutazioni più complesse di uno dei geni strutturali delle globine
A. Varianti che causano ANEMIA EMOLITICA
alterazioni delle proprietà fisiche di Hb
- HbS
- HbC
Emoglobine instabili
- Hb Hammersmith
B. Emoglobine con ALTERAZIONI del TRASPORTO di O2
- Hb M
- Hb Kempsey
- Hb Kansas
C. Varianti a fenotipo TALASSEMICO
- Hb E
- Hb Lepore
ALTERAZIONI PROPRIETA FISICHE DELLE Hb
EMOGLOBINA S (Hb S)
Anemia falciforme o drepanocitosi
autosomica recessiva
Clinica (omozigosi)
- anemia emolitica
- epato - splenomegalia
- infezioni ripetute
- crisi di gonfiore alle estremità
Eterozigosi: rischio in condizioni rarissime
Distribuzione geografica
alta frequenza in Africa equatoriale
(vantaggio selettivo sulla malaria)
Alterazione genica
mutazione missense A --> T
codone 6 b globina
sostituzione Acido glutammico (E) con Valina (V)
(polare)
(non polare)
PATOGENESI DELLANEMIA FALCIFORME
BASI MOLECOLARI
mutazione A ---> T
sostituzione Glu ---> Val, codone 6 globina b
BASI FISICHE
b
O2.
interazione Val con sito idrofobico dellaltra catena
(eliche E ed F) in condizioni di bassa tensione di
Aggregazione in fibre e precipitati allungati
BASI CELLULARI
Alterazioni citoscheletriche e FALCIZZAZIONE
Alta tensione di O2
T
VAL
HbS
GAT
GLU
Hb A2/B2
Bassa tensione di O2
CONSEGUENZE:
1. Emolisi splenica
2. Occlusione vasale
ALTRE MUTAZIONI DELLA SUPERFICIE DELLA MOLECOLA
EMOGLOBINA C (Hb C)
Disordine emolitico lieve
BASI MOLECOLARI:
Mutazione puntiforme codone 6 Glu ---> Lys
solubilità ----> cristallizazione
riduzione della deformabilità degli eritrociti
Hb SC:
anemia emolitica più lieve della. falciforme
complicanze per occlusione vascolare
retinopatia
EMOGLOBINE INSTABILI
Hb denaturate ----> corpi di Heinz
EMOGLOBINA HAMMERSMITH
Autosomica dominante
Cartteristiche cliniche:
anemia emolotica grave
cianosi:
Basi molecolari:
mutazioni puntiformi codone 42 globina b
Sost. Phe ----> Ser
Phe42
residuo CD1
Alterazione tasca dellEME
Instabilità di Hb
Affinità per O2
VARIANTI CON ALTERATO TRASPORTO DI O2
METEMOGLOBINE (Hb M)
Autosomica dominante
OSSIEMOGLOBINA
Fe +2
stato ridotto (ferroso)
METEMOGLOBINA (non lega O2)
Fe +3
stato ossidato (ferrico)
Spontaneo
Metemoglobina reduttasi
DESOSSIEMOGLOBINA
Mutazioni (a o b) tasca delleme
Ferro resistente a Metemoglobina reduttasi
Caratteristiche cliniche
Eterozigoti
omozigoti
Esempio:
asintomatici
letale
emoglobina HIDE PARK
b92 His ---> Tyr (residuo F8)
cianosi
EMOGLOBINE CON ALTERATA AFFINITA PER O2
Interfaccia a1 b2:
scorrimento catene
+ O2
Forma rilassata
- O2
Forma tesa
Mutazioni
interfaccia a1 b2
Esempi:
Hb Kempsey
Effetti molecolari e clinci opposti
Hb Kansas
Hb Kensey
b 99
Hb Kansas
Asp ----> Asn ---> Rilassata
affinità per O2 ----->
Policitemia
02 nei tessuti
b 102
Asn ----> Thr ---> Tesa
affinità per O2
Asintomatica, cianosi
VARIANTI CON FENOTIPO TALASSEMICO
Emoglobina E (Hb E)
autosomica recessiva
alta frequenza
eterozigosi composta con b talassemia
mutazione b 26
Glu ---> Lys
alterazione di splicing
1
60%
2
40
%
Omozigosi: asisntomatici o lieve anemia
3
Emoglobina Lepore (fusione)
N-ter 50 - 80 aa d
catena non a
C-ter 60 - 90 aa b
MEIOSI: crossing over ineguale tra d e yb
Gg
d
Ag
b/d
b
Anti Lepore b/d
Gg
Ag
d
Gg
Ag
yb
b
Lepore d/b
Gg
Ag
d/b
b talassemia di grado variabile
TALASSEMIE
Disordine monogenico più comune
Riduzione livelli di sintesi globine a o b
Alterazione del rapporto a : b
Globina in eccesso relativo
Precipitazione
ANEMIA EMOLITICA
Diminuzione di Hb
ANEMIA IPOCROMICA
MICROCITICA
a-TALASSEMIA
b-TALASSEMIA
Distrubuzione geografica:
MEDITERRANEO
AFRICA CENTRO-ORIENTALE
INDIA
ASIA
Vantaggio selettivo degli eterozigoti contro la MALARIA
ALFA - TALASSEMIE
Difetti Hb fetali ed adulte
Hb H =
b4
HB Barth =
g4
Geni a funzionali
Genotipo
Catena a
normale
4
aa/aa
100%
silente
3
aa/a-
75%
Tratto a-talassemico
(anemia lieve, microcitosi)
2
aa/-a-/a-
50%
Hb H
(anemia emolitica,
moderatamente grave)
1
a-/--
25%
a-talassemia omozigote
(idrope fetale
Hb Bart)
0
--/--
0%
condizione clinica
--/aa frequente sud-est asiatico ----> OMOZIGOSI
BASI MOLECOLARI DELLE a - TALASSEMIE
Delezioni del gene
ALTA FREQUENZA
Crossing-over ineguale a1/a2
ya1
a2
a
a1
Complesso gene a triplicato
ya1
a2
a1
ya1
a2
ya1
a
a1
Rari soggetti normali con triplo a
Complesso gene a singolo
Forme mutate non delete
Mutazione del codone di stop
Esempio: EMOGLOBINA CONSTANT SPRING
Arg
CGU
141
CGU
Arg
Stop
UAA …….………….
UAA
173
CAA………………...
Gln
Stop
UAA
31 aa in più ---> alterazioni sito di poliadenilazione ---> RNA instabile
BETA - TALASSEMIE
Difetti emoglobina adulta
Patologia post-natale (prima dei 2 anni)
Diminuzione b ------>
anemia ipocromica
microcitemia
sbilanciamento a : b
Aumento relativo a ------>
a2 d2
Hb A2 aumentata
a2 g2
Hb F aumentata
emolisi periferica
eritropoiesi inefficace
Sopravvivenza selettiva sottopopolazioni di globuli rossi
Grande variabilità genetica degli alleli
omozigoti
TALASSEMIA MAJOR
eterozigoti composti (+ frequente)
eterozigoti
TALASSEMIA MINOR
Lieve anemia
Microcitemia
Globuli rossi ipocromici
TALASSEMIA MAJOR (Morbo di Cooley)
b0
no Hb A
b+
piccole quantita di Hb A
FENOTIPO CLINICO
Anemia emolitica post-natale
(emolisi intramidollare e periferica)
Difetti di crescita
Splenomegalia
Grossa espansione midollo osseo
FACIES TALASSEMICA
Zigomi sporgenti e
mascelle prominenti
Ittero
Emocromatosi
Globuli rossi ipocromici e variabili in forma e grandezza
TRASFUSIONI
TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO
TERAPIA GENICA ?
BASI MOLECOLARI DELLE b -TALASSEMIE
DELEZIONI
(infrequenti)
TALASSEMIE SEMPLICI
Hb Lepore
Delezione 619 bp
Indiani Asiatici
TALASSEMIE COMPLESSE
Grosse delzioni di più geni del cluster
TALASSEMIA db0
severe
TALASSEMIA gdb0
delezione db
db0 (17 % Hb F)
HPFH Persistenza dellemoglobina fetale
Stato benigno (a2 b2)
Non avviene switch post-natale
Hb F persiste e compensa Hb A
HPFH senza delezioni
Mutazioni promotore gene g (CAAT Box)
Clinicamente normali
ALTERAZIONI SEQUENZE CODIFICANTI RNA NON FUNZIONALE
Mutazioni non senso
(b0)
Sardegna
Cod 39
CAG ---> UAG
gln
Stop
Mutazioni con scivolamento del codice di lettura
Delezione 1 base codone 16 senso
Trp
Gly Lys Val Asn
UGG GGC AAG GUG AAC
UGG GCA AGG UGA
Trp
Ala Arg stop
Stop codone 18
(b0)
ALTERAZIONI DELLO SPLICING
1. GIUNZIONI INTRONE / ESONE (b0)
Introne 2
2. NUOVO SITO DI SPLICING
Esone 3
CAG / CTC---------------CGG / CTC
(b+)
Introne I
GG ------> AG
10 %
1
Accettore
Uso di siti di splicing criptici (introne 2)i
1
2
2
90 %
3
Proteina alterata
Proteina più lunga
3
3. Hb E
60% Hb A
+19 nucleotidi --> stop
(b+, bE)
40% Hb E
Struttura dei recettori per le LDL