Fisiologia della emopoiesi - Unità Funzionale di Ematologia

FISIOLOGIA DELLA
EMOPOIESI
EMOPOIESI
definizione
L’insieme dei processi che regolano il
mantenimento del numero fisiologico
di cellule circolanti del sangue in
condizioni di omeostasi e intervengono
come compenso in situazioni di
perdita/distruzione, o per rispondere
adeguatamente ad un aumento della
richiesta da parte dell’organismo
EMOPOIESI
meccanismi di regolazione
CELLULARE:
Presenza di cellule con diverse
potenzialità proliferative e
maturative
INTERCELLULARE:
Interazione delle cellule
emopoietiche con elementi
cellulari e proteine dello stroma
ESOGENO:
Cell nonautonomous
Fattori di crescita (citochine) ed
altre molecole non citochiniche
(es. ormoni) che hanno la
proprietà sia di stimolare che di
inibire, a diversi livelli,
l’emopoiesi
ENDOGENO:
Cell autonomous
Molecole di regolazione
intracellulare, come le cascate
dei secondi messaggeri ed i
fattori di trascrizione nucleari.
sinusoidi midollari
maturazione
citochine
prodotte
in loco
CLP
CMP
stimolatorie
inibenti
HSC
cellule dello stroma
osteoblasti
SCF/cKit
Notch/Jagged
proteine della matrice/
recettori
citochine
prodotte
distalmente
IL TURNOVER DELLE CELLULE DEL SANGUE
ERITROCITI
5 x 106 / l
5 x 1012 / L
25 x1012 / PERSONA
120 GIORNI
2 x 1011 / DIE
200.000.000.000
GRANULOCITI
NEUTROFILI
3.6x 103 / l
3.6x 109 / L
PIASTRINE
2 x 105 / l
2 x 1011 / L
18 x 109 / PERSONA 2 x 1011 / PERSONA
~ 10 GIORNI
 12 ORE
0.36 x 1011 / DIE
1 x 1011 / DIE
36.000.000.000
100.000.000.000
NK
Pre-T
Pro-T
DC
CLP
Pro-B
IL-7Ra+ c-mpl-
Pre-B
B/Mf
LT-HSC
ST-HSC
MPP
CFU-M
IL-7Ra- c-mpl+
CFU-G
Epo-R-
GMP
DC
CMP
BFU-E
Epo-R+
MEP
CFU-Meg
CFU-E
CELLULE
STAMINALI
PROGENITORI
PRECURSORI
ELEMENTI
MATURI
NUMERO DI CELLULE
ATTIVITA’ MITOTICA
PLASTICITA’ FUNZIONALE
SPECIALIZZAZIONE FUNZIONALE
differenziazione
differenziazione/
automantenimento
HSC
apoptosi
quiescenza
espansione
SELF-RENEWAL
DIFFERENTIATION
…..
The capacity to
reproduce themselves
The capacity to
generate terminally-differentiated
specialized cells
“Stemness”
genes
ON
OF
Tumor
suppressor
genes
OFF
ON
Differentiation
genes
OFF
ON
CELLULA STAMINALE
EMOPOIETICA
markers
Fenotipo staminale
c-kit
Thy1
CD34
Non espresse
CD10
CD14
CD15
CD16
CD19
CD20
CD38
CELLULE CD34+
•
•
•
1-2% nel midollo
0.05% nel sangue periferico
0.3-0.5% nel sangue cordonale
•
0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato
•
>> in condizioni patologiche (IM)
•
LTR dopo terapia mieloablativa
•
•
•
•
•
•
Proteina transmembrana
Funzione non nota (adesione?)
105-120 kD
Altamente glicosilata
3 epitopi diversi (mAb di tre classi)
Varianti molecolari
IN VIVO
IN VITRO
CFU-GM
CFU-G
CFU-M
BFU-E
CFU-GEMM
16-14 gg
CFU-E
CFU-Mk
14 gg
7 gg
SISTEMI DI ASSAY DELLE CELLULE
STAMINALI E DEI PROGENITORI:
CELLULE STAMINALI:
in vivo:
animali subletalmente irradiati, NOD/SCID,
pazienti sottoposti a trapianto allogenico
in vitro:
?? Colture long-term
PROGENITORI COMMISSIONATI:
in vitro: CFU
SIDE POPULATION:
In vitro: trasportatori della famiglia ABC
altamente espressi nella membrana
dei progenitori immaturi estrudono il
colorante Heochst
CELLULE CD34+
• La capacità proliferativa e differenziativa delle
CD34+Lin- da PB è inferiore rispetto a BM
• Il # di cellule necessario per la ricostituzione
emopoietica
in trapianti xenogenici da PB è
superiore rispetto a BM
• La long-term repopulation ability in trapianti
secondari e terziari delle cellule da PB è inferiore
rispetto a BM
• Non vi è evidenza di senescenza patologica delle
cellule staminali (lunghezza telomerica) in riceventi
di BM vs PB
• L’aggiunta di SCF a G-CSF incrementa il numero di
cellule LTR in topi
MODELLI DI STRUTTURA DEL
SISTEMA EMOPOIETICO
STOCASTICO
I processi di proliferazione e turnover e
differenziamento delle HSC sono guidati da
fenomeni probabilistici
Potenziale predeterminato: fenomeno
programmato a priori a livello genetico
DETERMINISTICO
Controllo Extracellulare: effetto induttivo del
microambiente midollare e dal particolare milieu
citochinico in cui le cellule si vengono a trovare
NICCHIA OSTEOBLASTICA
I processi di automantenimento e differenziazione
delle HSC richiedono uno specifico microambiente,
formato da elementi cellulari e molecole, noto come la
“nicchia” emopoietica
 OSTEOBLASTI
 LT-HSCs
Some of the important molecules within the HSC
niche and their corresponding receptors on HSCs
Ligands in stem cell
niche
Receptors in
HSCs
Function
N-Cad
N-Cad
Cell adhesion
VCAM
Integrin
Cell adhesion
Ang-1
Tie-2
Stem cell maintenance
Jagged1
Notch
Positive regulator of selfrenewal
Wnt3a
Frizzled
Positive regulator of selfrenewal
Ca2+
CAR
Stem cell homing
NICCHIA VASCOLARE
Avecilla ST, 2004
STEM CELL CIRCULATION
Stem cell niche
Extrinsic
Circulation
Intrinsic
REGOLAZIONE INTRINSECA
• egr-1 transcription factor gene (Early
Growth Response Factor-1) gene is highly
expressed by HSC and strongly repressed
during HSC mobilization. It functions by
restricting HSC entry into the cell cycle and
limiting HSC migration through a CXCR4SDF-1 independent mechanism. It seems to
act predominantly through a transcriptional
repression mechanism
REGOLAZIONE ESTRINSECA
Proliferation
Chemokine
Cycloph
G-CSF
circulation
Osteoblastic niche
SDF1
REGOLAZIONE DELL’EMOPOIESI
• Controllo esogena
• Controllo endogena
Fattori di crescita(CSF)
Interleuchine
citochine
Fattori Trascrizionali
Meccanismi epigenetici
CONTROLLO ESOGENO
CITOCHINE
SORGENTE
CELLULARE
BERSAGLIO CELLULARE
FUNZIONE
IL-6
Fattore di crescita multipotente che stimola la
IL-3
Linfociti T IL-11
Progenitori emopoietici precoci crescita dei progenitori emopoietici precoci
e
IL-2
SORGENTE
macrofagi
IL-7 induce l’espressione di M-CSF daiFUNZIONE
SCF
CITOCHINE
BERSAGLIO CELLULARE
CELLULARE
Fibroblasti,
Stimola la sintesi delle proteine di fase acuta negli
Stimola la proliferazione dei linfociti B, lo sviluppo di
Linfociti T, LIF
IL-7,
-4
Linfociti T,
Linfociti T e B, Progenitori
epatociti; induce il differenziamento del linfocita
B
IL-4
cellule TH2, lo switch isotipico verso la classe IgE e
Macrofagi,FL...
MastocitiLinfociti T, Megacariociti
emopoietici precoci
IL-6
verso
la
plasmacellula;
stimola
la
promuove la crescita dei mastociti
Epatociti,
megacariocitopoiesi; ha un’azione sinergica con
Cellule Linfociti T,
IL-5
Eosinofili IL-3, IL-4, IL-1
Stimola
e IL-2 la proliferazione e l’attivazione degli eosinofili
somaticheMastociti
Induce la formazione di CFU-E; possiede un effetto
Cellule Fegato
IGF-1
Progenitori
IL-7
Progenitori linfoidi
precoci eritroidi
Stimola la proliferazione
dei precursori linfoidi
anti-apoptotico.
stromali
Cellule stromali
Progenitori emopoietici,
Fibroblasti,
Stimolala l’emopoiesi
precoce,e nelle
la proliferazione e
Megacariociti,
Progenitoridella Interviene
durante
megacariocitopoiesi
GM-CSF
Precursori
linea
IL-11
cellule Linfociti T,
di monociti,
granulociti e mastociti
eritroidi,granulocitaria
Linfociti B e monocitaria
fasi terminali l’attività
dell’eritropoiesi
.
stromali Mastociti
Cellule stromali,
Fattore di Stimola
crescita l’emopoiesi
delle cellule
staminali
Progenitori granulocitari,
precoce,
la proliferazione e
Cellule Macrofagi,
G-CSF
SCF
Mastociti, Progenitori
pluripotenti; l’attività
interviene
con IL-3,
Granulociti maturi
dei sinergicamente
granulociti.
stromali, Monociti
(kit
pluripotenti, Progenitori
GM-CSF e Epo nelle fasi terminali dell’emopoiesi;
Fibroblasti,
Cellule
stromali,
ligand)
mieloidi, eritroidi e linfoidi
stimola la proliferazione, il diffenziamento e la
EpatocitiMacrofagi,
M-CSF
Progenitori monocitari,
Monociti dei
Stimola
la proliferazione e l’attività dei monociti
chemiotassi
mastociti
Monociti
Fibroblasti
Cellule staminali e progenitori Fattore di crescita delle cellule staminali e dei
Flt-3L
Eritropoietina
Reni,
Fegato
Progenitori e Precursori
eritroidi emopoietici
Fattore di regolazione della eritropoiesi
stromali
emopoietici
progenitori
regolazione della
Riduce la Fattore
capacitàdi proliferativa;
inducemegacariocitopoiesi;
il
Cellule
Progenitori
emopoietici
Cellula
staminale,
Megacariociti,
attivo
sulle
cellule
staminali;
interviene
LIF
differenziamento dei progenitori emopoietici; in alcune fasi
Trombopoietina
Fegato, Reni multipotenti
stromali
Progenitori eritroidi
della eritropoiesi; stimola l’adesione dei progenitori
stimola la piastrinopoiesi
emopoietici alla fibronectina
GM-CSF
G-CSF
TPO
IL-3
SCF
EPO
CONTROLLO ENDOGENO
• Il differenziamento di linea si spiega in
maniera convincente con il profilo di
espressione di fattori di trascrizione critici
per le diverse linee
• I FT critici agiscono in maniera coordinata,
contesto-dipendente, e interattiva
• Molti di questi FT sono stati scoperti per il
loro coinvolgimento in traslocazioni
cromosomiche in pazienti con leucemia
Geni del “differenziamento”
La specificità di azione dello stesso FT in linee diverse
può essere spiegato con 2 meccanismi diversi:
1. La presenza di co-fattori linea-specifici
es. FOG-1 e GATA1. FOG-1 presenta regioni diverse in grado di
influenzare il differenziamento verso le diverse filiere
emopoietiche .
2. La presenza di differenti livelli di espressione del FT.
Es. GATA1 in cui il differenziamento megacariocitario richiede
livelli di espressione più elevati rispetto a quello eritrocitario .
Es. PI.1 in cui elevati livelli indirizzano verso la differenziazione
macrofacica, livelli intermedi verso quella granulocitaria e livelli
minimi verso il differenziamento B-linfocitario.
Antagonismo funzionale dei FT
CMP
PU.1
GATA-1
EKLF
GMP
MEP
Fli
RBC
Gfi-1
PU.1
MK
GN
Mo/MAc
Cell lineage reprogramming:
single-factor activity
GATA-1
Induction of megakaryocytic differentiation in primary human erythroblasts
Day 0
Green: HbA
Red: GPIIb
Purified GPA+ erythroblasts
Day 2
+ HEL conditioned medium
+ Thrombopoietin
Goldfarb AN, Am J Pathol 2001; 158:1191
Day 5
DISTINCT STAGES OF ERYTHROPOIESIS
DURING DEVELOPMENT
PRIMITIVE
EMBRYONIC
E 9.5
Yolk sac
E7.5 to E11
Shimizu R, 2001; Zang H, 2001
DEFINITIVE
ADULT
E 12.5
Liver
E9.5
to newborn
Bone Marrow
E15
throughout life
DEVELOPMENTAL BLOCK OF
ERYTHROPOIESIS
KO
WT
WT
PRIMITIVE EMBRYONIC
8.5
9
10-11
SCL LMO2
“bloodless GATA-2
mice”
KO
DEFINITIVE
11.5
12.5
GATA-1
13.5
16
EKLF
FOG1
c-Myb
DEVELOPMENTAL BLOCK OF
ERYTHROPOIESIS
KO
WT
WT
PRIMITIVE
EMBRYONIC
8.5
9
10-11
KO
DEFINITIVE
11.5
12.5
13.5
16
Jak2 EpoR
Bcl-X
Lyn
GRdim/dim
Stat5a
Stem cell
IL-3Rα GM-CSFR

gp130
Flt3
FL
SCF
IL-3
GM-CSF
Epo
Tpo
Epo
Mpl
Kit
BFU-E
CFU-E
IL-3Rα GM-CSFR

gp130
gp130
Epo
Epo
Mpl
Kit
Erythr
Mpl
Epo
Mpl
ERITROPOIESI
L’ eritrone
Costituisce l’ unità anatomo-funzionale dell’
eritropoiesi e comprende l’ intera popolazione
cellulare che va dalle cellule staminali orientate
in senso eritroide fino agli eritrociti circolanti . Si
disstinguono :
• Progenitori eritroidi ( BFU-E, CFU-E ), non
individuabili morfologicamente
• Precursori eritroidi, morfologicamente
riconoscibili ( proeritroblasto, eritroblasto
basofilo, eritroblasto policromatofilo, eritroblasto
ortocromatico )
• Reticolociti
• Eritrociti
La più precoce cellula eritroide è chiamata BFU-E (burst forming unit
erythroid). Essa è in grado di dare origine, in terreno di coltura
semisolido (es. metilcellulosa), ad aggregati cellulari che dopo 14-16 giorni
di incubazione danno origine a macrocolonie (burst), di 30.000-40.000
cellule: eritroblasti (ortocromatici e policromatofili) ed eritrociti maturi ricchi
di emoglobina.
Un progenitore più maturo è il CFU-E (colony forming unit erythroid), che
genera in coltura dopo 7 giorni aggregati più piccoli di cellule
emoglobinizzate (8-65 cellule).
I “precursori” sono più maturi dei progenitori e sono identificabili senza essere
messi in coltura. Nella serie eritroide essi comprendono proeritroblasti,
eritroblasti basofili, policromatofili ed ortocromatici. Questi perdono il nucleo e
non contengono più DNA.
La “progenie” è invece rappresentata dai reticolociti che poi diventano
eritrociti.
ERITROPIESI
PROERITROBLASTO
TempoERITROBLASTO
di produzione – 5 giorni
BASOFILO I
ERITROBLASTO
ERITROBLASTO
BASOFILO II POLICROMATOFILO
I
Il citoplasma cambia dal blu all’arancione
• diminuzione di RNA
• aumento in emoglobina
GLOBULI ROSSI
ERITROBLASTO
POLICROMATOFILO II
RETICOLOCITA
•
Nucleo sempre più piccolo
•
Cromatina sempre più aggregata
ERITROBLASTO
ORTOCROMATICO
SINTESI
DELLA
EPO
•Cellule del sistema monocito-macrofagico intorno
ai tubuli prossimali nella corticale del rene
•Cellule renali peritubulari
•Progenitori eritroidi
•Cellule epatiche
(epatociti e cellule di Ito)
Fe
-O2
Goldberg MA et al, 1988
EPO
FemRNA
ERITROPOIETINA
ERITROPOIETINA
PERCHE’ NEL RENE? IL FLUSSO EMATICO RENALE E’ PARI AL 20%
DEL TOTALE E IL CONSUMO DI O2 NELLA CORTICALE DEL RENE E’
PRESSOCHE’ COSTANTE (PROPORZIONALE AL RIASSORBIMENTO DEL
Na). QUINDI NON VI SONO ELEMENTI LOCALI CHE MODIFICHINO LA
pO2. LA pO2 DIPENDE DALLA QUANTITA’ DI O2 TRASPORTATA DAGLI
ERITROCITI. LE CELLULE PERITUBULARI “SENTONO” LA pO2
ATTRAVERSO UN SISTEMA DI PROTEINE EMICHE LA CUI
CONFIGURAZIONE OSSI/DESOSSI REGOLA LA SINTESI DI UN FATTORE
DI TRASCRIZIONE (HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR, HIF) CHE REGOLA LA
SINTESI DI EPO.
La visione “classica” del sistema eritropoietico
La visione “classica” del sistema eritropoietico
effetto
stimolo
bersaglio
sensore
prodotto
Epo
Epo-R
EPO
JAK2
P
PJAK2
P
P
P
P
P
EPO
P
JAK2 JAK2
P
P
STAT5
P
P
LYN
P
STAT5
STAT5
PI-3 K
P
P
P
P
RAS
MAP/ERK Kinase
Transcription
R129C
EPO
SHP
1
JAK2 JAK2
P
P
P
JAK2 JAK2
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
JAK2 JAK2
P
P
P
P
SHP
1
SOCS
PIAS
STAT5
STAT5
STAT5
STAT5
P
P
P
EPO
X
Transcription
delayed
immediate
prom
Bcl-XL
prom
GATA-2
prom
β-globin
X
APOPTOSIS
X
PROLIFERATION
-globin
Motoyama 1995; Merika 1985; Gregory 1999; Wagner 2000; Haughn 2003; Vannucchi 2002
MECCANISMI di CONTROLLO EPIGENETICO
Me
Me
C
G
G
C
Me
Me
C
G
G
C
Me
G
C
C
G
Me
Me
C
G
G
C
Me
Methylation
K27
K9
H3
H2A
K4
Pre-microRNA
H4
H2B
K27
K9
Ac
H3
H2A
gene
K27
K9
H4
H2B
microRNA
K4
RIBOSOME
Ac
Transcriptionally
inactive
Transcriptionally
active
miRISC
Vannucchi AM et al, JCMM 2009
miRNAs Functions:
• Cell Development
1
• Metabolism
2
• Cell Proliferation
3
• Stress Response
• Angiogenesis
4
5
6
• Apopotosis
• Cell Dead
• Differentiation
microRNAs nell’EMOPOIESI
Pro-T
CLP
T
miR-150 miR-146
Pro-B
B
miR-181a
HSC
CMP
miR-223 miR-142
NFI-A
miR-155
C/EBPb, BREBBP,
JUN, MEIS1, PU.1
AGTR1, AGTR2, FOS
miR-221 miR-222 miR-16
MEP
c-KIT, CREBBP, FOS,
ETS1, PPARg
miR-10a, miR-10b, miR-20,
miR-17, miR-126, miR-130a
miR-142, miR-16, miR-15
Pluripotent
Stem cells
Multipotent
Stem cell
Committed
Precursors
Chen ey al science 2004 , Fazi et a Cell 2005l Felli et al 2005, Garzon et al 2006, Bruchova et al 2007
Mature
cells