Lezione 4

O
O
C
HO
Acido Lattico
C
H
CH3
L’acido lattico nelle forme enantiomeriche D ed L viene prodotto a partire da piruvato per
opera dell’enzima lattato deidrogenasi (LdhD, LdhL) e in molti batteri lattici la forma L- viene
anche prodotta a partire da acido malico per opera dell’enzima malolattico (mle). Questo
enzima catalizza la reazione chiave della fermentazione malolattica dei vini ed è messa in
atto da diverse specie di batteri lattici, principalmente Oenococcus oeni.
In diverse specie batteriche, l’acido lattico oltre ad essere uno dei principali prodotti del
metabolismo fermentativo anaerobio attraverso la cui formazione si rigenera NAD+ e si
mantiene costante il flusso glicolitico, è anche un costituente dello scheletro della parete
cellulare.
La fermentazione malolattica
O
O
O
C
HO
C
H
mle
CH2
O
C
HO
CO2
H
CH3
COOacido malico
C
acido L- lattico
NAD+
NADH + H+
acido piruvico
acido ossalacetico
CO2
Oenococcus oeni
(ex Leuconostoc oenos)
Schizosaccharomyces pombe
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Il controllo della fermentazione malolattica e quindi dei batteri coinvolti in questo processo,
rappresenta una parte importante dei sistemi tecnologici moderna di produzione del vino.
L’importanza del processo di conversione dell’acido malico in acido lattico operata a livello
batterico con sviluppo di CO2 può essere più o meno importante in relazione all’andamento
climatico in cui si è sviluppato ed è maturato il grappolo di uva e in base alla tecnologia di
vinificazione. Nelle regioni vinicole climaticamente fredde, la fermentazione malolattica è
desiderata al fine di ridurre l’acidità eccessiva dovuta all’elevato contenuto di acido malico
presente nell’acino. Di contro, nelle regioni più calde, la fermentazione malolattica può essere
richiesta per aumentare la stabilità batterica del vino. Per queste ragioni, è sempre più
diffuso l’impiego di colture batteriche starter che garantiscono lo sviluppo di questo processo
fermentativo.
La specie batterica più utilizzata per la preparazione di starter malolattici è Oenococcus
oeni. Una coltura starter per questa tipologia di applicazioni deve avere le seguenti
caratteristiche: i) una crescita “ragionevolmente veloce” in vino; ii) non deve determinare lo
sviluppo di aromi indesiderati; iii) deve essere facilmente coltivabile a livello industriale.
Mle
(l-malate:NAD+ carboxy lyase)
Il gene che codifica per l’enzima malolattico è stato identificato e sequenziato in
Lactococcus lactis e in Oenococcus oeni (più recentemente in Leuconostoc
mesenteroides, Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Lactobacillus salivarius, L.
rhamnosus, L. plantarum, L. fructivorans, L. hilgardii, L. brevis, ma solo a scopo
tassonomico). In O. oeni il gene mleA codificante per l’enzima malolattico ha
dimensioni di 1623 bp e codifica per una proteina putativa di 542 aa e 59118 Da con
un p.i. di 4.55. Nello stessa regione genica, è stato identificato un secondo gene
codificante una proteina di 314 aa (probabilmente una malato permeasi).
Mle
Il ruolo fisiologico (teoria chemio-osmotica)
E’ stato osservato, che la presenza acido malico nel vino favorisce non solo il
manifestarsi della fermentazione malolattica ma anche la crescita di quei batteri
responsabili del processo fermentativo. Quindi la trasformazione diretta del malato a
lattato risulta essere un processo energeticamente conveniente per la cellula
batterica in un ambiente apparentemente inospitale come il vino (pH acido e ridotta
concentrazione di nutrienti). Il processo metabolico può essere così riassunto:
- la cellula incorpora malato- e non malato2- con
conseguente formazione di una differenza di potenziale
elettrico di membrana (∆φ);
- ad alte concentrazioni di malato (> 1mM) il suo ingresso
dovrebbe avvenire per diffusione passiva o per trasporto
mediato in condizioni di bassa affinità o per simporto con
ioni H+;
- a basse concentrazioni di malato il suo ingresso nella
cellula avviene per uniporto.
- la conversione del malato a acido lattico e CO2 richiede
il consumo di H+ e determina una relativa diminuzione del
pH citoplasmatico.
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- il gradiente di protoni che si viene a formare tra l’interno e l’esterno
della cellula (∆p), favoriscono l’ingresso di nutrienti (simporto con H+)
quali amminoacidi (Leu) e zuccheri residui presenti nel vino.
L- malato-
∆φ
L- malatoL- malatoNADH +H+
H+
L- malatoH+
1 H+
NADH +H+
NAD+
∆pH
Leu
NAD+
H+
Leu
L- lattico + CO2
H+
ADP
ATP
H+
H+
L- lattico
CO2
Teoria dello Spill-off di piruvato
Per giustificare l’effetto stimolante la crescita di Oenococcus oeni da parte della
fermentazione malolattica, è stata ipotizzata una seconda teoria sul ruolo fisiologico di
questo processo fermentativo. Alcuni autori hanno osservato che la reazione di
conversione del malato a lattato non è strettamente stechiometrica e hanno
conseguentemente ipotizzato che parte del piruvato (intermedio metabolico della
reazione malolattica) venga sottratto alla reazione e utilizzato nel metabolismo
fermentativo avendo un effetto stimolante la crescita.
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L’Acido Lattico e la resistenza alla vancomicina
S-layer
acidi
lipoteicoici
polisaccaride
neutro
acidi
teicoici
parete di
membrana
peptidoglicano plasmatica
(D-Ala)
(D-Ala)
(D-Ala)
(D-Ala)
(D-Ala)
(D-Ala)
(D-lattato)
(D-Ala)
D-Ala:D-Ala ligasi
(D-Ala)
D-Ala:D-Xxx ligasi
(D-lattato)
D-Ala
D-lattato
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Vancomicina
VanS
His
P
ATP
Asp- VanR
ADP
P- Asp - VanR
+
vanR
vanS
vanH
vanA
vanR = regolatore
vanS = permeasi
vanH = D-2-idrossiacido deidrogenasi
vanX
vanY
vanZ
vanA = D-Ala:D-Xxx ligasi
vanX = D,D-dipeptidasi
vanY = D,D-carbossipeptidasi
vanZ = ??
In Enterococcus faecium e E. faecalis i geni che conferiscono la resistenza alla
vancomicina sono posizionati all’interno di trasposoni localizzati a livello plasmidico o a
livello cromosomale. Per questa ragione la resistenza alla vancomicina può essere
trasferita (coniugazione) da ceppi VanR a ceppi VanS. Per molte altre specie di batteri
lattici tra le quali Lactobacillus casei, L. rhamnosus, L. curvatus, L. plantarum, L.
coryneformis, L. brevis, L. fermentum, Pediococcus pentosaceus, P. acidilactici,
Leuconostoc lactis e L. mesenteroides la resistenza alla vancomicina è una caratteristica
intrinseca non inducibile e trasferibile e codificata da geni diversi da quelli van di
Enterococcus.
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