Legenda per la descrizione tassonomica p__ = phylum, cioè divisione c__ = classe o__ = ordine f__ = famiglia g__ = genere Per esempio, per descrivere Escherichia coli, scriveremo: p__Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Enterobacteriales; f__Enterobacteriaceae;g__Escherichia …oppure, per descrivere Bacillus licheniformis: p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Bacillales;f__Bacillaceae;g__Bacillus 1 I BATTERI LATTICI Sono batteri Gram POSITIVI, immobili, chemioeterotrofi a forma di bastoncino o cocco Il loro nome deriva dal fatto che formano ACIDO LATTICO come principale (e talvolta unico) prodotto finale del loro metabolismo energetico Hanno un metabolismo fermentativo; sono tutti anaerobi con variabile capacità di tollerare l’ossigeno (con rare eccezioni, legate alla presenza di EME esogeno) Sono incapaci di produrre ATP attraverso un metabolismo aerobio, a causa dell’incapacità di sintetizzare citocromi o altri enzimi contenenti il gruppo eme. A causa dell’impossibilità di produrre proteine eminiche, sono CATALASI NEGATIVI e quindi non possono operare la decomposizione dell’H2O2 in H2O e O2 Una caratteristica propria dei batteri lattici è la loro elevata ACIDO-RESISTENZA, la quale consente loro di crescere fino a quando il pH raggiunge valori inferiori a 5. Questa caratteristica fisiologica è di grande importanza ecologica, perché permette loro di vincere la competizione di altri batteri in ambienti ricchi di materia organica. Come risultato della loro specializzazione fisiologica, i batteri lattici sono confinati in pochi e caratteristici ambienti naturali: alcuni vivono in associazione con le piante e crescono a spese delle sostanze nutritive liberate in seguito alla morte e alla decomposizione dei tessuti vegetali; si trovano quindi in alimenti e bevande preparate con materiale vegetale come sottaceti, crauti, foraggi insilati, vino e birra. Altri fanno parte del normale microbiota degli animali (bocca, intestino, mucosa vaginale). Infine, alcuni sono spesso associati al latte (per es. Streptococcus thermophilus). 2 Alcuni generi di batteri lattici Streptococcus Oenococcus Lactococcus Enterococcus Carnobacterium Pediococcus Lactobacillus Leuconostoc Immagini al SEM p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Lactobacillus p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Pediococcus p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Lactococcus p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Streptococcus p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Leuconostocaceae;g__Oenococcus p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Leuconostocaceae;g__Leuconostoc p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__ Enterococcaceae;g__Enterococcus p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Carnobacteriaceae;g__Carnobacterium 3 I BATTERI LATTICI Sulla base dei loro prodotti di fermentazione, sono divisi in tre sottogruppi metabolici 1 – OMOFERMENTANTI: degradano il glucosio via glicolisi e non sono in grado di utilizzare i pentosi. Il piruvato viene poi ridotto ad acido lattico, unico prodotto della loro fermentazione 2 – ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI: non possono degradare il glucosio via glicolisi in quanto non possiedono l’enzima FRUTTOSIO 1,6 DIFOSFATO ALDOLASI che catalizza la scissione del fruttosio 1,6 difosfato in gliceraldeide-3fosfato e diidrossi-acetone-fosfato. Per tale ragione essi fermentano il glucosio attraverso la via dei pentoso fosfati, ottenendo tre prodotti finali in rapporto equimolare: ACIDO LATTICO, ETANOLO e CO2. Possono utilizzare anche i pentosi, nel qual caso senza produzione di CO2. Possono produrre anche piccole quantità di acido acetico 3 – ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI: in presenza di ESOSI essi li fermentano attraverso la glicolisi con produzione di solo ACIDO LATTICO, comportandosi perciò come omofermentanti. In presenza di PENTOSI, effettuano l’ossidazione di tali composti attraverso la via dei pentoso fosfati, senza produzione di CO2 L’acido lattico prodotto può essere in configurazione L, D oppure in miscela racemica DL 4 5 Omofermentanti Zuccheri Zuccheri pentosi esosi X Eterofermentanti facoltativi esosi Esosi Eterofermentanti obbligati Pentosi in quantità ridotte ( ) 6 TERRENI COLTURALI PER BATTERI LATTICI Terreno MRS a pH 6,2-7: non selettivo, adatto per il mantenimento dei lattobacilli Terreno SL: selettivo per l’isolamento dei lattobacilli (tripticase, estratto di lievito, citrato, glucosio, arabinosio, saccarosio, acetato, pH finale 5,4) Terreno ATB: adatto per l’isolamento di Oenococcus oeni (peptone, estratto di lievito, succo di pomodoro 25 %, pH finale 4,8) Poiché i batteri lattici sono anaerobi (sebbene ossigeno tolleranti), i migliori risultati di crescita si ottengono incubando le piastre di isolamento in giare di anaerobiosi (Gas-Pak) 7 I BATTERI ACETICI Appartengono alla famiglia delle Acetobacteraceae p__Proteobacteria;c__Alphaproteobacteria;o__Rhodobacterales;f__Acetobacteraceae Sono bastoncini Gram NEGATIVI, aerobi chemio-eterotrofi, catalasi positivi, termolabili e psicrotrofi Sono marcatamente acidofili (crescono fino a pH 4, a concentrazioni di ac. acetico fino a 0,4 M) Il pH ottimale è compreso tra 5,4 e 6,3. Acetobacter pasteurianus cresce anche a pH 3 se l’etanolo è inferiore all’8% Si localizzano soprattutto sulla superficie di piante, in particolare fiori e frutti Sono microrganismi mesofili che crescono con temperatura ottimale intorno a 30 °C; alcuni ceppi si riescono a sviluppare anche a 5 °C, altri sono blandamente termotolleranti (37-40 °C) Tollerano basse concentrazioni di acido acetico; tollerano bene l’etanolo e molti ceppi crescono in un range compreso tra 8 e 15 %. La concentrazione tollerata dipende da pH, temperatura e concertazione di O2 I tre generi più noti: Acetobacter: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus, A. cerevisiae, A. pomorum Gluconoacetobacter: G. xylinus, G. diazotrophicus, G. intermedius, G. liquefaciens Gluconobacter: G. oxydans, G. frateurii Altri generi e specie: Acidomonas methanolica, Asaia spp., Kozakia baliensis, Saccharibacter spp., Swaminathania spp., Frateuria spp. 8 Le specie più importanti nella produzione industriale dell’aceto sono: - Acetobacter aceti subsp. orleanensis - Acetobacter aceti subsp. xylinum (madre dell’aceto) - Acetobacter pasteurianus subsp. lovaniensis - Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens - Acetobacter pasteurianus subsp. paradoxus In particolare, i membri del genere Acetobacter sono particolarmente importati da un punto di vista industriale (sia positivamente che negativamente) per diversi motivi, tra i quali: 1. sono usati per la produzione dell’aceto (usati per convertire intenzionalmente l’etanolo del vino o di altri prodotti alcolici in acido acetico) 2. possono deteriorare il vino producendo quantità eccessive di acido acetico o etil-acetato (entrambi rendono sgradevole il vino). La crescita di Acetobacter nel vino può essere inibita attraverso la completa eliminazione dell’ossigeno durante la conservazione del vino oppure con l’aggiunta di moderate quantità di SO2 3. sono usati per acidificare intenzionalmente alcune birre aventi periodi di maturazione lunghi (per esempio per la produzione della birra tradizionale Flemish Sour Ale) 9 Peculiarità metaboliche I batteri acetici sono aerobi obbligati aventi metabolismo aerobio (respirazione aerobica) In particolare, i batteri acetici sono caratterizzati da metabolismo aerobio con ossidazione incompleta dei substrati organici Utilizzano diverse fonti di carbonio, dagli zuccheri agli aminoacidi. Preferiscono etanolo, glicerolo, lattato, mannitolo, sorbitolo, fruttosio, glucosio Come fonte di azoto molti ceppi utilizzano NH4+ Gli zuccheri sono ossidati esclusivamente attraverso la via del pentosio fosfato L’acetato deriva dalla ossidazione parziale della materia organica e non da un vero processo di fermentazione Il PIRUVATO è trasformato attraverso una decarbossilazione non ossidativa ad acetaldeide (la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad Acetil-CoA e CO2, tipicamente presente nel processo di respirazione, non avviene in quanto il COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI nei batteri acetici è inattivo) FONDAMENTALE!!! DA RICORDARE!!! 10 I BATTERI ACETICI Glucosio tutto il NADH generato in queste reazioni di ossidazione è destinato alla catena di trasporto degli elettroni, per creare il gradiente di H+ che permette la sintesi dell’ATP NAD+ ACIDO LATTICO pentosi-P interconversione non ossidativa triosi-P ultime tappe della glicolisi NADH+H+ lattato deidrogenasi NAD+ ETANOLO via del pentosio fosfato NADH+H+ alcol deidrogenasi Ac. piruvico decarbossilazione non ossidativa CO2 Acetaldeide NAD+ aldeide deidrogenasi NADH+H+ acetil-CoA ligasi acetil-CoA sintetasi Ac. acetico Gluconobacter non ha un ciclo di Krebs funzionale e non può dunque ossidare l’acetato Acetil-CoA Ciclo dei TCA CO2 In Acetobacter il ciclo di Krebs è inibito solo a concentrazioni elevate di etanolo CO2 11 I BATTERI ACETICI: la metabolizzazione dell’etanolo Sono capaci di crescere utilizzando etanolo come unica fonte di carbonio ed energia producendo acido acetico L’etanolo, infatti, viene ossidato ad acetato, ed il potere riducente ottenuto si trasforma in energia per la cellula (cioè in ATP) a livello della catena di trasporto degli elettroni CH 3CH 2OH pirrolochinolin-chinone, associato all’aldeide deidrogenasi biosintesi NAD +, PQQ catena respiratoria NADH, PQQH 2 ATP CH 3COOH CH 3COSCoA KREBS acetil-CoA sintetasi rilasciato extracellularmente detta anche acetil-CoA ligasi X Il blocco del ciclo di Krebs è causato da: → presenza di etanolo in Acetobacter → carenze genetiche in Gluconobacter 12 I BATTERI ACETICI: la metabolizzazione dell’etanolo La produzione di acido acetico a partire da etanolo da parte dei batteri acetici NON è una fermentazione, ma il risultato di una semplice ossidazione parziale dell’etanolo, al fine di recuperare potere riducente Solo i membri del genere Acetobacter possono ossidare completamente l’acetato a CO2, se le concentrazioni di etanolo non sono troppo alte 13 Come distinguere Acetobacter da Gluconobacter in laboratorio Si devono preparare piastre contenenti il seguente terreno di coltura agarizzato: Estratto di lievito 50 g/l CaCO3 20 g/l rende il terreno di coltura opaco Etanolo 7% è la fonte di carbonio ed energia per il batterio Agar 20 g/l Dopo semina e incubazione a 28/30 °C per 2-3 giorni, parte dell’etanolo sarà convertito dai batteri acetici in acido acetico, che abbasserà il pH solubilizzando il carbonato di calcio: le colonie appariranno quindi con un alone di chiarificazione intorno a loro. Prolungando l’incubazione la concentrazione di etanolo diminuirà fino a permettere agli Acetobacter di ossidare completamente l’acido acetico prodotto (poiché il ciclo di Krebs è sbloccato). Dopo altri 2-3 di incubazione, quindi, il pH sarà risalito, con conseguente riprecipitazione del carbonato di calcio. Dopo un totale di 5-6 giorni di incubazione, quindi, le colonie di Gluconobacter avranno un alone di chiarificazione, mentre quelle di Acetobacter no, poiché il carbonato di calcio riprecipitando avrà reso di nuovo opaco il terreno (sì vedrà un alone opaco di precipitazione). Acetobacter Gluconobacter colonia batterica 2-3 giorni di incubazione alone di chiarificazione 5-6 giorni di incubazione alone di precipitazione 14 La fermentazione malolattica (o meglio, conversione malolattica) NON è una fermentazione nel senso metabolicamente corretto del termine 15 CENNI DI ANABOLISMO L'anabolismo comprende tutto l'insieme dei processi di sintesi o bioformazione delle molecole organiche (biomolecole) più complesse da quelle più semplici o dalle sostanze nutritive. Questi processi richiedono energia, al contrario del catabolismo Sebbene l'anabolismo e il catabolismo siano due processi contrari, funzionano in maniera coordinata ed interdipendente Le vie cataboliche forniscono gli intermedi biochimici utili all’anabolismo per operare la biosintesi delle macromolecole 16 I PRECURSORI BIOSINTETICI DEGLI AMMINOACIDI 17 SINTESI DELLE STRUTTURE CELLULARI A PARTIRE DA GLUCOSIO I precursori metabolici formati dalla glicolisi, dal ciclo dei TCA e dalle vie correlate entrano nelle vie biosintetiche che producono… …i monomeri o i mattoni di tutte le componenti cellulari. PROTOTROFIA e AUXOTROFIA INCAPACITA’ DI SINTETIZZARE UN ... amminoacido ... una base azotata ... etc... Ulteriori reazioni polimerizzano i monomeri per formare macromolecole… …che interagiscono per produrre le strutture che costituiscono la cellula batterica CAPACITÀ DI SINTETIZZARE... un amminoacido... una base azotata... etc… FABBISOGNO COLTURALE, NUTRIZIONALE 18 LA BIOSINTESI DELLE BASI AZOTATE 19