Informazioni sull`analisi genetica per fibrosi cistica in diagnosi

PRODA
Istituto di Diagnostica Clinica
Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare
Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini
Specialista in Genetica Medica
Informazioni sull’analisi genetica per fibrosi cistica in diagnosi prenatale
Che cos’è la Fibrosi cistica.
La fibrosi cistica è una malattia ereditaria, cronica, evolutiva, caratterizzata dalla produzione di
muco particolarmente denso, viscoso, che tende ad ostruire i bronchi ed i dotti del pancreas.
Un bambino ogni 2.500 circa nasce con questa malattia.
La malattia si manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, danneggiando
l’apparato respiratorio (con presenza di tosse persistente, bronchiti ricorrenti, sinusite, poliposi
nasale) e disturbi digestivi (con difficoltà nella crescita). Inoltre, negli uomini si manifesta sterilità
di tipo ostruttivo e nelle donne una riduzione della fertilità. A volte possono essere presenti anche
ostruzione intestinale alla nascita, diabete ed alterazioni del fegato.
La fibrosi cistica, in individui diversi, può esprimersi con maggiore o minore gravità, viene pertanto
trattata con terapie che variano da soggetto a soggetto, con antibiotici, aerosol-terapia, estratti
pancreatici e vitamine, fisioterapia.
Nonostante che il decorso e la prognosi della fibrosi cistica siano notevolmente migliorati negli
ultimi decenni, soprattutto per i pazienti diagnosticati precocemente, allo stato attuale non si ottiene
la guarigione e la durata media della vita è ridotta rispetto a quella della popolazione generale.
Come si trasmette la malattia.
La fibrosi cistica è determinata da alterazioni, chiamate “mutazioni”, a livello di una specifica
coppia di geni, definiti CFTR. I geni sono sequenze di una sostanza chimica complessa, chiamata
DNA, e vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. Ogni persona
eredita complessivamente oltre 30.000 coppie di geni dai suoi genitori.
In un malato di fibrosi cistica entrambi i geni CFTR sono difettosi. Viceversa, un portatore di
fibrosi cistica è un individuo sano che possiede un gene difettoso ed un gene normale.
I portatori di fibrosi cistica sono circa il 4% della popolazione, cioè una persona ogni 25 circa è
portatrice.
Una coppia costituita da due portatori ha ad ogni gravidanza un rischio del 25% di generare un
figlio malato (se vengono trasmessi entrambi i geni alterati), ed una probabilità del 75% di generare
un figlio sano, che può essere portatore o non portatore.
Come si esegue l’analisi genetica.
Per eseguire l’analisi genetica è necessario il prelievo di un campione di sangue.
Dalle cellule del sangue viene estratto il DNA, e su questo si esegue l’analisi molecolare per la
ricerca di un’eventuale mutazione nella coppia di geni della fibrosi cistica. L’analisi fornisce
informazioni solo riguardo alla fibrosi cistica.
Le mutazioni possibili sono numerosissime (~1200), molte di esse sono rare, molte altre ancora
sconosciute e non tutte ancora identificabili. L’analisi genetica normalmente ricerca le 36 mutazioni
più frequenti.
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Materiali e metodi utilizzati
La tecnica adottata per l’analisi delle 36 mutazioni più frequenti del gene CFTR nella popolazione
italiana, utilizza 19 coppie di primers che amplificano tratti di DNA ove sono localizzate le
mutazioni stesse, combinate in 2 multiplex PCR. La presenza o l’assenza delle mutazioni viene
valutata mediante ibridazione inversa non radioattiva (LiPA - Line Probe Assay). Di seguito è
riportato l’elenco delle 36 mutazioni per le quali si effettua la ricerca:
E60X
A455E
Q552X
3905insT
G85E
ΔF508
2183AA>G
W1282X
394delTT
ΔI507
2184delA
S1251N
621+1G>T
3199del6
2143delT
N1303K
R117H
G542X
2789+5G>A
CFTRdele2,3(21Kb)
711+5G>A
1717-1G>A
R1162X
711+1G>T
1078delT
G551D
3659delC
3272-26A>G
R347P
R553X
3120+1G>A
1898+1G>A
R334W
R560T
3849+10KbC>T
I148T
Le mutazioni sopra indicate costituiscono il 73% delle mutazioni presenti nella popolazione
italiana. La capacità di rilevazione di mutazioni del gene CFTR con il test usato (comparata con la
percentuale di rilevazione considerando tutte le mutazioni del gene CFTR fino ad oggi evidenziate
nella popolazione italiana) è superiore al 94% (Rendine et al, 1997; Bombieri e Pignatti, 2001).
Il test è da considerarsi altamente specifico e non sono state evidenziate cross-reazioni con
mutazioni rare o polimorfismi in prossimità delle posizioni delle sonde utilizzate.
Quali risultati può dare l’analisi genetica e che implicazioni comporta per la gravidanza
Nel caso di richiesta di analisi molecolare per Fibrosi Cistica in gravidanza, il test viene
innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l’eventuale stato di portatore per ognuno dei
genitori; solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle
mutazioni ricercate, viene valutata la necessità di effettuare la diagnosi prenatale molecolare
(diagnosi di malattia sul feto e diagnosi di esclusione di malattia sul feto;vedi oltre).
• Con l’attuale analisi si possono avere due tipi di risultati:
- l’analisi individua nel DNA la presenza di una mutazione del gene CFTR (soggetto
“positivo” al test): questo risultato evidenzia che il soggetto è un portatore;
- l’analisi non individua la presenza di mutazioni del gene della fibrosi cistica (soggetto
“negativo”al test): questo risultato evidenzia che il soggetto ha una probabilità diminuita,
•
rispetto a prima dell’analisi, di essere un portatore (≃ 1%). Non è possibile che l’analisi
escluda in assoluto la probabilità di essere un portatore, perché non è possibile escludere la
presenza di tutte le numerosissime mutazioni del gene della fibrosi cistica.
Ciò implica che:
- se entrambi i membri di una coppia sono negativi al test, la probabilità di avere un figlio
affetto è inferiore a quello della popolazione generale (1 probabilità su 40.000);
- se entrambi risultano positivi al test (entrambi portatori), il rischio di avere un figlio affetto
è pari al 25% (1 probabilità su 4) ad ogni gravidanza. In questo caso la coppia può fare
ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel feto;
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se un genitore è positivo al test (portatore) e l’altro è negativo, il rischio di avere un figlio
affetto è superiore a quello della popolazione generale (cioè ≃1 probabilità su 400).
In questa circostanza la diagnosi molecolare prenatale (test di esclusione fetale) permette di
escludere la malattia nel feto solo nel 50% dei casi; mentre negli altri casi, la mancata esclusione
raddoppia il rischio di malattia nel feto (1 su 200). In questi casi è possibile fare ricorso anche ad
indagini prenatali di altra natura per ottenere una migliore definizione del rischio, mentre tecniche
più complesse di analisi molecolare per la ricerca di mutazioni per la fibrosi cistica (eseguibili
preferibilmente in fase preconcezionale come analisi di II livello - DDGE, DHPLC,
sequenziamento- e valutate comunque in un colloquio specialistico di consulenza genetica),
richiedono tempi lunghi di esecuzione e costi elevati e, comunque, non arrivano mai ad escludere la
presenza di mutazioni (sensibilità non assoluta, difficoltà nell’interpretare varianti di sequenza dalle
incerte conseguenze cliniche).
Problematiche e limiti dell’analisi genetica molecolare
Le analisi genetiche molecolari sono indagini di recente sviluppo, continuamente sottoposte a
revisione e perfezionamento. E’ possibile che per la complessità delle procedure tecniche utilizzate,
in una percentuale molto bassa di casi (inferiore all’ 1%), il test genetico per fibrosi cistica vada
ripetuto o fornisca un risultato inesatto.
E’ importante ricordare che:
• La probabilità di trovare una mutazione (e quindi di ricevere la diagnosi di portatore di fibrosi
cistica) è maggiore per un soggetto che sappia di avere nella sua famiglia una persona affetta
dalla malattia o un portatore. In questo caso è necessario prima identificare la mutazione nella
persona malata o del portatore presente in famiglia (mutazione “famigliare”) e poi ricercarla
nella persona interessata all’analisi;
• Se un individuo, imparentato con un malato al quale non è stato possibile identificare la
mutazione familiare, chiede l’analisi genetica; o nel caso di diagnosi prenatale uno dei due
genitori è portatore di una mutazione non identificabile, è necessario ricorrere ad indagini più
complesse che coinvolgono oltre al malato altri familiari. Quest’ultime (analisi indiretta
mediante marcatori polimorfici, ovvero sequenze diverse, ma normali, di DNA ereditabili in
associazione al gene CFTR) comportano un moderato aumento di rischio di errore e non sempre
possono fornire un risultato.
• Quando siano coinvolti più familiari, se i legami di parentela di coloro che si sottopongono al
test sono diversi da quanto dichiarato, il test può rivelare tale situazione (ad esempio quando il
padre anagrafico non sia quello biologico), oppure può fornire un risultato sbagliato. Una
diagnosi sbagliata in un membro di una famiglia può portare ad altri errori diagnostici per altri
soggetti di quella famiglia.
• Il risultato dell’analisi genetica può condurre a fare diagnosi non solo di portatore, ma anche di
malato di fibrosi cistica, qualora nel soggetto analizzato vengano individuate non una, ma due
mutazioni del gene della fibrosi cistica.
• Il risultato dell’analisi genetica può condurre a considerare l’eventualità di una diagnosi
prenatale.
• E’ importante ricordare che casi eccezionali di fibrosi cistica potrebbero essere dovuti a
mutazioni de novo, alleli complessi (combinazioni di più polimorfismi diversi in grado di
influenzare la funzionalità del gene), disomia uniparentale. Nell’1% dei pazienti con fibrosi
cistica tipica eterogeneità genetica (coinvolgimento di geni diversi dal CFTR) non può essere
esclusa.
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E’ importante sottolineare che:
• in rari casi un risultato non interpretabile può evidenziarsi a causa della presenza di polimorfismi
di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3’
dei primers. In questo caso ulteriori approfondimenti in Centro di II livello sono necessari.
• e’ possibile che siano presenti altre mutazioni ma, che non essendo incluse nel kit, non siano
rilevabili
• il test LiPA non è in grado di rilevare se le 2 mutazioni di un paziente eterozigote composto
siano presenti su uno o 2 cromosomi (in cis o in trans). Solo lo studio del DNA parentale potrà
dare indicazioni sulla fase cromosomica.
In considerazione delle problematiche sopra esposte, in concomitanza del test genetico viene
sempre offerta una consulenza genetica. I risultati ottenuti con l’analisi del DNA sono strettamente
confidenziali; potranno essere comunicati ad altre persone solo dopo autorizzazione dell’interessato.
Referenti per l’analisi genetica per fibrosi cistica
Conformemente alle Linee Guida Nazionali sui Test Genetici, il prelievo di sangue e l’analisi
molecolare sui genitori, il prelievo di liquido amniotico per l’eventuale test molecolare di FC sul
feto, sono precedute da una consulenza genetica, effettuata da Medici Specialisti in Genetica
Medica, che ha la finalità di trasmettere a chi chiede di sottoporsi al test le informazioni necessarie a
comprenderne il significato e le implicazioni correlate al risultato e, quindi, di ottenere il consenso
informato degli interessati.
L’analisi molecolare è effettuata presso l’Istituto di Diagnostica Clinica PRODA Sezione
Citogenetica e Genetica Molecolare.
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Consenso informato all’indagine genetica per fibrosi cistica
Ho preso visione delle informazioni allegate, che ho integrato con ulteriori precisazioni fornite dal
Dottor …………………………………………….
.
Avendo compreso il significato e le implicazioni di questa procedura, chiedo di sottopormi
all’indagine genetica per la ricerca delle più frequenti mutazioni associate alla fibrosi cistica.
La mia richiesta di sottopormi al test è completamente volontaria.
Una copia di questo consenso informato resterà in mio possesso ed una copia resterà al Laboratorio.
Sono consapevole che raramente l’analisi può fornire un risultato errato ma che, comunque, la
probabilità di un errore diagnostico è inferiore all’1%. In rarissimi casi può evidenziarsi un risultato
non interpretabile a causa della presenza di polimorfismi di CFTR o di altre mutazioni rare di CFTR
nelle regioni coperte dalle sonde o alle estremità 3’ dei primers. In questo caso ulteriori
approfondimenti in Centro di II livello sono necessari.
Sono consapevole che nel caso di richiesta di analisi molecolare per FC in gravidanza il test
viene innanzitutto effettuato sulla coppia per valutare l’eventuale stato di portatore per ognuno dei
genitori; solo successivamente, nel caso che un genitore od entrambi risultino portatori di una delle
mutazioni ricercate, viene effettuata la diagnosi prenatale molecolare per FC (diagnosi di malattia
sul feto e diagnosi di esclusione di malattia sul feto).
Sono, inoltre, consapevole che, per una corretta e completa interpretazione conclusiva, sarà
opportuno esibire, al Medico che ha prescritto l’esame, il risultato del test consegnatomi dal
Laboratorio.
Dati anagrafici del paziente
Cognome:
Nome:
Data e luogo di nascita
Indirizzo:
Recapito telefonico:
e-mail:
Roma,
Firma del paziente
Firma del Medico che ha raccolto il consenso
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