descrizione del progetto - Università degli Studi di Firenze

NUOVE STRATEGIE ANTI-TUMORALI: PRECURSORI DI CELLULE ENDOTELIALI
(EPC) E CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSC) COME VEICOLI INTRATUMORALI DI MOLECOLE AD ATTIVITÀ ANTI-ANGIOGENETICA ED ANTITUMORALE
L’angiogenesi, ossia la formazione di nuovi vasi a partire da vasi preesistenti, è considerato un
evento fondamentale nello sviluppo tumorale. L’induzione dell’angiogenesi, “angiogenic switch”,
gioca un ruolo rilevante nella progressione tumorale (1,2) e quindi rappresenta un bersaglio
promettente per la terapia dei tumori. L’identificazione nel sangue periferico di precursori di cellule
endoteliali (EPCs) di derivazione midollare ha evidenziato un meccanismo alternativo di
angiogenesi basato sul reclutamento delle EPC dal midollo osseo, la “vasculogenesi post-natale”(3).
Nel nostro laboratorio abbiamo isolato una sottopopolazione di EPC chiamate “Endothelial Colony
Forming Cells” (ECFCs), che sono caratterizzate da un alto potenziale proliferativo, dalla
formazione di colonie secondarie e terziarie e dalla formazione di nuovi vasi in vivo (4). Numerosi
studi suggeriscono un importante ruolo delle EPC nella vascolarizzazione tumorale e nella metastasi
(5). Altre evidenze indicano che anche le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono in grado di
migrare selettivamente verso il tumore, mantenere lo stroma tumorale e contribuire all’angiogenesi
tumorale fornendo la matrice per lo sviluppo di nuovi vasi (6). Entrambi questi tipi cellulari
vengono reclutati all’interno della massa tumorale e pertanto possono essere impiegati come
“veicoli cellulari”di agenti anti-tumorali (7). In particolare, le MSC autologhe possono essere
impiegate senza rischio di rigetto.
Precursori di cellule endoteliali (EPC) e cellule staminali mesenchimali (MSC) nel tumore
Varie evidenze suggeriscono un coinvolgimento delle EPC nelle fasi iniziali dell’angiogenesi
tumorale (8), cosi come nella crescita tumorale e nella transizione metastatica (9). Studi clinici
hanno dimostrato che i livelli di EPC circolanti correlano positivamente con la progressione
tumorale e si riducono dopo chemioterapia (10,11). Tuttavia, il ruolo delle EPC nella
vascolarizzazione tumorale è ancora da definire. Alcuni autori hanno messo in evidenza un
importante contributo delle EPC nella formazione dell’endotelio tumorale, mentre altri studi
suggeriscono uno scarso e irrilevante coinvolgimento di queste cellule (5). L’opinione emergente è
che le EPC, una volta reclutate all’interno della massa tumorale, indipendentemente dalla loro
incorporazione nei vasi tumorali, contribuiscano all’”angiogenic switch” attraverso la secrezione
paracrina di citochine pro-angiognetiche (5). Evidenze in vitro e in vivo mostrano che anche le
MSC sono coinvolte nella crescita tumorale fornendo un supporto stromale per le cellule tumorali e
per i vasi (12). Cellule tumorali trapiantate sottocute mostrano aumentate capacità proliferative,
angiogenetiche e metastatiche se vengono trapiantate insieme alle MSC (13). Le EPC e le MSC
sfruttano due differenti strategie nella crescita tumorale: le EPC sono coinvolte nell’angiogenesi
tumorale mentre le MSC contribuiscono prevalentemente al mantenimento dello stroma tumorale.
Il sistema uPA/ uPAR nell’angiogenesi e nell’invasività tumorale
Il meccanismo di angiogenesi a partire da vasi pre-esistenti è ben conosciuto. Questo processo è
strettamente correlato alla presenza sulle cellule endoteliali (EC) di un sistema operativo che
favorisce la degradazione della matrice extracellulare (ECM), l’adesione delle cellule all’ECM
stessa e la contrazione del citoscheletro cellulare, richiesta per il movimento cellulare (14). Il
sistema di attivazione del plasminogeno associato alla membrana (attivatore del plasminogeno di
tipo urochinasico, uPA; recettore dell’uPA, uPAR; inibitore dell’uPA di tipo 1, PAI-1) è critico
nell’angiogenesi poiché è coinvolto sia nella degradazione della ECM che nell’adesione cellulare
alla ECM stessa attraverso il meccanismo del cosiddetto “grip and go”. uPAR è costituito da tre
domini (D1, D2, D3) ed è presente sulla membrana cellulare sia in forma intera che in forma
troncata (D2 + D3), la quale non può legare uPA, ma è in grado di interagire con le molecole
dell’ECM, come vitronectina ed altre. Abbiamo precedentemente dimostrato che l’interazione
uPA/uPAR induce la chemiotassi delle cellule endoteliali e stimola la formazione di nuovi vasi
nella cornea del coniglio (15) e che solo la forma intera di uPAR è in grado di mediare
l’angiogenesi (16). Inoltre, l’inibizione dell’espressione di uPAR tramite l’utilizzo di uno specifico
oligonucleotide antisenso (aODN anti-uPAR) inibisce l’invasività cellulare, l’angiogenesi (17,18) e
la formazione di metastasi (19,20). Il ruolo del sistema uPA/uPAR nell’angiogenesi EPCdipendente è poco conosciuto. Esperimenti preliminari svolti nel nostro laboratorio hanno
dimostrato che uPAR è coinvolto anche nella vasculogenesi post-natale e che tale ruolo è correlato
alla sua distribuzione a livello dei “lipid rafts”di membrana (studi in corso). Abbiamo anche
studiato il ruolo del sistema uPA/uPAR nelle EC nella Sclerosi Sistemica (SSc), un disordine
cronico caratterizzato da un deficit di angiogenesi. Abbiamo dimostrato che nelle SSc-EC tale
difetto è principalmente legato alla super-produzione della metallo-proteasi-12 (MMP-12) che è in
grado di troncare uPAR (16,21). Le cellule possono muoversi attraverso la ECM secondo due
differenti modalità di migrazione: mesenchimale e/o ameboide. La prima richiede la proteolisi della
matrice extracellulare, che, attraverso la produzione di MMPs e di uPA/uPAR, crea un varco alla
cellula invasiva, mentre la seconda è indipendente dall’attività di proteasi ed e permette alle cellule
di “scivolare” attraverso la ECM invece che degradarla (22,23). uPAR agisce sia attraverso un
meccanismo enzima-dipendente che enzima-indipendente e ciò suggerisce un duplice ruolo, ancora
non descritto, di questo recettore in entrambi i tipi di motilità cellulare. Risultati preliminari ottenuti
nel nostro laboratorio indicano che le ECFC trattate con un mix di inibitori di proteasi mantengono
ancora buone proprietà invasive che vengono completamente inibite dall’impiego dell’anti-uPAR
aODN. E’ ben noto che il microambiente tumorale induce la super-espressione di uPAR nelle
cellule tumorali e la capacità invasiva e metastatica. Pertanto, la down-regulation di uPAR può
interferire sulla plasticità delle cellule coinvolte nell’angiogenesi, che consentirebbe alle cellule di
eludere il trattamento anti-angiogenetico e anti-tumorale.
Ruolo delle EPC e delle MSC nella terapia tumorale
Le EPC e le MSC sono reclutate all’interno del tumore e sono in grado di sostenere la
vascolarizzazione e la crescita tumorale. Pertanto queste cellule potrebbero essere impiegate come
“veicoli cellulari” di molecole anti-tumorali e quindi rappresentano una promettente strategia per la
terapia anti-tumorale (24,25). Questo nuovo approccio è già stato applicato ad alcuni modelli
tumorali in vivo, e, in una certa misura, ha dimostrato di ridurre la progressione tumorale
(26,27,28,29,30).
Il movimento delle EC nell’angiogenesi e delle cellule tumorali nell’invasione è strettamente
dipendente dalla presenza di uPAR nativo “intero” e il clivaggio di uPAR per azione di MMP12
determina la perdita delle proprietà invasive delle cellule (21,31). Quindi, ECFC e MSC manipolate
ex vivo, super-esprimenti MMP12, potrebbero essere impiegate, insieme o singolarmente, come
veicoli cellulari dell’agente anti-tumorale MMP-12 allo scopo di inibire sia l’angiogenesi che
l’invasività tumorale. Inibire la plasticità uPAR-dipendente delle cellule tumorali mediante la
troncatura di uPAR, potrebbe aprire una nuova possibilità di bloccare la crescita e la metastasi in
quei tumori in cui l’invasività dipende fortemente dalla presenza di uPAR. Le cellule
ingegnerizzate, in grado di liberare MMP12 all’interno della massa tumorale, potrebbero essere
utilizzate da sole o insieme per ottenere un ottimale regressione tumorale.
Su queste basi, l’obiettivo del presente programma è quello di indurre la “gain of function”
dell’attività dell’MMP12 nelle ECFC e nelle MSC allo scopo di :
a) Troncare uPAR nelle ECFC riducendo l’angiogenesi e b) ottenere un clivaggio MSC-dipendente
di uPAR sulle cellule tumorali bloccando l’invasività.
Il nostro principale obiettivo è la produzione di una popolazione di ECFC e di MSC in grado
di tagliare uPAR riducendo conseguentemente l’angiogenesi e la diffusione tumorale.
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Dott.ssa Gabriella Fibbi
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