Recettori metabotropi al glutammato

PROGRAMMA DI RICERCA
RECETTORI METABOTROPI AL GLUTAMMATO ED ENDOCANNABINOIDI:
INTERAZIONI FUNZIONALI RUOLO FISIOPATOLOGICO NELL’ ISCHEMIA
CEREBRALE.
Responsabile del Progetto: Prof. Domenico Pellegrini-Giampietro
INTRODUZIONE
La maggior parte delle sinapsi del sistema nervoso centrale utilizza il glutammato come
neurotrasmettitore eccitatorio. Oltre ad avere un ruolo fisiologico nella normale trasmissione
sinaptica e nei fenomeni che stanno alla base della plasticità neuronale, il glutammato è in gran
parte responsabile della morte neuronale sia di tipo apoptotico che necrotico in corso di numerose
patologie neurodegenerative acute e croniche, fenomeno noto con il nome di eccitotossicità (Choi,
1996; Martin et al., 1998). E' ormai dimostrato che sia le azioni fisiologiche che quelle
potenzialmente patologiche del glutammato sono mediate dalla sua interazione con almeno due
classi di recettori (Hollmann & Heinemann, 1994): i recettori ionotropi (i recettori NMDA, AMPA
e al kainato), che appartengono alla superfamiglia di recettori legati a canali ionici, e i recettori
metabotropi (mGlu) accoppiati, tramite proteine G, alla produzione di secondi messaggeri.
Gli otto recettori mGlu a tutt’oggi conosciuti sono stati suddivisi in tre gruppi in base alla loro
omologia strutturale, al meccanismo di trasduzione e al profilo farmacologico (Conn & Pin, 1997).
Mentre i recettori mGlu del II e III gruppo sono accoppiati negativamente all’adenilato-ciclasi, i
recettori mGlu del I gruppo (mGlu1 e mGlu5) sono accoppiati a proteine Gq e quindi all’idrolisi dei
fosfoinositidi: la loro attivazione porta alla produzione di IP3 e diacilglicerolo ed a mobilizzazione
del Ca2+ libero intracellulare. Questi eventi sono noti per avere una profonda influenza sia sui
meccanismi di plasticità sinaptica che su quelli che portano a morte neuronale. Per questo motivo,
numerosi gruppi di ricerca in ambito internazionale sono attualmente impegnati a studiare il ruolo
dei recettori mGlu del I gruppo in modelli sperimentali di plasticità neuronale (Riedel & Reymann,
1996) e di malattie neurologiche (Bordi & Ugolini, 1999; Nicoletti et al., 1999).
Studi successivi hanno dimostrato che nella regione ippocampale CA1 i recettori mGlu1 sono
espressi prevalentemente da un sottogruppo di interneuroni GABAergici immunoreattivi per la
somatostatina, piuttosto che dalle cellule piramidali, i neuroni più vulnerabili all’ischemia (Baude et
al., 1993). Studi più approfonditi hanno rilevato poi che l'attivazione dei recettori mGlu
appartenenti al I gruppo compromette fortemente in molte regioni del SNC sia la trasmissione
sinaptica inibitoria che quella eccitatoria (Gereau, IV & Conn, 1995) e che, in particolare, gli
antagonisti mGlu1 esercitano la loro azione neuroprotettiva attraverso la modulazione della
trasmissione GABAergica (Battaglia et al., 2001; Cozzi et al., 2002). Inoltre, è recentemente emerso
che i cannabinoidi endogeni come l’anandamide e il 2-arachidonilglicerolo (2-AG), sostanze
prodotte dal nostro cervello che agiscono sugli stessi recettori (CB1 e CB2) su cui agiscono i
principi attivi della marijuana (Cannabis Indica), possono essere coinvolti nel meccanismo di
liberazione di GABA e di glutammato a sua volta modulato dai recettori mGlu1/5 in diverse aree
cerebrali (Piomelli, 2003). In particolare, appaiono molto interessanti gli studi che dimostrano come
l’attivazione di recettori post-sinaptici mGlu1/5 promuove il rilascio di endocannabinoidi dalle
cellule piramidali CA1 (Varma et al., 2001) e quelli in cui si evidenzia come gli endocannabinoidi,
ed in particolare il 2-AG, prodotto in seguito a depolarizazione o aumento dei livelli di Ca2+ libero
intracellulare, possa agire da messaggero retrogrado in CA1 e sopprimere il rilascio di GABA dai
terminali pre-sinaptici degli interneuroni GABAergici (Chevaleyre & Castillo, 2003). Questo
fenomeno è noto con il nome di soppressione dell’inibizione indotta da depolarizzazione
(depolarization-induced suppression of inhibition, DSI) (Alger, 2004).
Appare chiaro quindi come questo meccanismo, che vede coinvolti da una parte i recettori mGlu del
I gruppo e dall’altra la trasmissione mediata da endocannabinoidi, possa avere importanti
implicazioni per quel che riguarda la fisologia ma anche la patologia del SNC.
OBIETTIVI E DESCRIZIONE DELLA RICERCA
Obiettivi e di questo Progetto sono i seguenti:
1. INVESTIGARE GLI EFFETTI DI AGONISTI E ANTAGONISTI DEI RECETTORI mGlu1 E
CB1 SULLA MODULAZIONE DELLA TRASMISSIONE SINAPTICA INIBITORIA NELLA
REGIONE CA1 DELL’IPPOCAMPO.
Per questo obiettivo utilizzeremo tecniche elettrofisiologiche di registrazione patch-clamp in fettine
ippocampali di ratto acute. Valuteremo la modulazione pre- o post-sinaptica delle correnti inibitorie
post-sinaptiche spontanee (sIPSC) in seguito all'attivazione o blocco di recettori mGlu1 e CB1.
Verranno utilizzati farmaci selettivi sui recettori mGlu1 o CB1 per verificare l’esistenza di un tono
glutamatergico mediato dai recettori mGlu che regola la trasmissione GABAergica inibitoria
attraverso l’attivazione di recettori CB1 presinaptici. L'ipotesi che questa modulazione possa essere
mediata dalla sintesi ex novo di endocannabinoidi sarà valutata con esperimenti di occlusione
farmacologica. Questi esperimenti saranno complementari a quelli eseguiti a Genova dal Prof.
Bonanno, in cui verrà investigato il ruolo di agenti attivi sui recettori mGlu e CB1 sul rilascio
spontaneo ed evocato di glutammato.
2. VALUTARE IL RUOLO PATOLOGICO DELL’INTERAZIONE TRA RECETTORI mGlu1 E
CB1 NEI MECCANISMI DI MORTE NEURONALE POST-ISCHEMICA.
Utilizzeremo per questo obiettivo fettine organotipiche ippocampali di ratto esposte a deprivazione
di ossigeno e glucosio (OGD), un modello di ischemia cerebrale in vitro da molti anni in uso nel
nostro laboratorio.Valuteremo innanzitutto l’eventuale effetto neuroprotettivo sulle cellule
piramidali della regione CA1 di agonisti e antagonisti del recettore CB1, ed in seguito l’effetto di
tali agenti sulla neuroprotezione mediata da antagonisti mGlu1. In seguito, estenderemo questi studi
in vitro a un modello di ischemia globale in vivo (gerbilli soggetti ad occlusione bilaterale delle
carotidi). Il gruppo di Milano (Prof. Di Luca) esaminerà l’organizzazione strutturale delle densità
post-sinaptiche in questi modelli sperimentali di ischemia cerebrale.
3. VALUTARE L'ESPRESSIONE DEI RECETTORI mGlu1α E CB1 IN MODELLI DI
ISCHEMIA CEREBRALE IN VITRO E IN VIVO
Utilizzeremo poi metodiche di immunocitochimica per esaminare la localizzazione dei recettori
mGlu1α and CB1 in specifiche popolazioni di interneuroni (rispettivamente, somatostatina- e
colecistochinina-positivi) nella regione CA1 dell'ippocampo. Useremo un anticorpo monoclonale
anti-mGlu1α e un anticorpo policonale C-terminale anti-CB1. Esamineremo la localizzazione di
questi recettori in fettine organotipiche ippocampali sia in condizioni di controllo che dopo OGD.
Gli obiettivi proposti verranno perseguiti utilizzando un approccio interdisciplinare. Useremo
metodiche elettrofisiolgiche e di microdialisi in vivo per esaminare l'impatto di ligandi attivi sui
recettori mGlu1 e CB1 sul rilascio di glutammato e GABA nella regione CA1 dell'ippocampo.
Utilizzeremo un modello sperimentale in vitro di ischemia cerebrale per studiare la possibile
cooperazione tra i recettori mGlu1 e CB1 nei meccanismi che portano le cellule priamidali CA1 a
morte neuronale post-ischemica. Infine, useremo metodiche di spettrometira di massa e di
immunocitochimica per valutare la formazione di endocannabinoidi e l'espressione di recettori
mGlu1α e CB1 in condizioni di controllo e ischemiche.
I protocolli sperimentali verranno condotti secondo le linee guida nazionali per il trattamento degli
animali da esperimento (DL 116/92) in accordo con le Direttive del Consiglio della Comunità
Europea (86/609/EEC) e sono stati formalmente approvati dal Comitato dello Stabulario del
Dipartimento di Farmacologia dell'Università di Firenze. Il numero di animali utilizzati sarà quello
minimo necessario per il raggiungimento degli obiettivi di questo studio.
APPROCCI METODOLOGICI
1. Registrazioni elettrofisiologiche con metodiche di whole cell-patch clamp in fettine ippocampali
di ratto. Con questo approccio studieremo la modulazione della trasmissione sinaptica inbitoria
nella regione CA1 da parte dei recettori mGlu1 e CB1.
Fettine di ippocampo di ratto (300 µm) verranno ottenuti da ratti Sprague-Dawley maschi e
femmine di 15-20 giorni di età (circa 150 animali/anno) come descritto da Mannaioni et al. (2001).
Le fettine verranno poste in camere di registrazione e superfuse con fluido cerebrospinale artificiale
saturato con 95/5% O2/CO2. Verranno registrati i potenziali postsinaptici inibitori spontanei
(sIPSC) dalle cellule piramidali CA1 mediante registrazioni visivamente guidate in configurazione
whole cell voltage-clamp. Nel fluido cerebrospinale artificiale saranno presenti gli inibitori dei
recettori ionotropi al glutammato D-APV e CNQX. Verranno analizzati sia l'ampiezza che la
frequenza degli eventi rilevati. Alla fine di ogni esperimento verrà aggiunto l'antagonista GABA-A
bicucullina per accertarsi che gli sIPSC siano effettivamente mediati dal recettor GABA-A.
2. Valutazione mediante HPLC delle concentrazioni di GABA e glutammato tramite microdialisi
trasversa ippocampale in vivo. Con questa tecnica, ampiamente utilizzata nel nostro laboratorio
(Cozzi et al., 2002), studieremo la modulazione del rilascio di GABA e glutammato indotto da
ligandi recettoriali mGlu1 e CB1 nell’ippocampo dorsale di gerbilli.
Gerbilli adulti (Meriones unguiculatus) (circa 70 animali/anno) di 60-80 g di peso verranno
anestetizzati con cloralio idrato e fissati su di un apparecchio stereotassico per l’inserimento di una
cannula da microdialisi transcerebrale nell’ippocampo dorsale. Dopo 24 h, le membrane verranno
perfuse con una soluzione iso-osmotica alla velocità di 3.5 µl/min. Dopo un lavaggio di circa 2 h,
verranno raccolti 4 campioni ogni 15 min per determinare il rilascio basale. Le membrane saranno
quindi perfuse per 1 h con una soluzione contenente agonisti e/o antagonisti dei recettori mGlu1 o
CB1 e infine con una soluzione di controllo. Alla fine degli esperimenti verrà iniettata attraverso la
cannula una soluzione 100 mM di KCl per valutare l’integrità funzionale dell’esperimento.
Il dosaggio del glutammato e del GABA verrà effettuato tramite HPLC accoppiata a un fluorimetro,
previa derivatizzazione precolonna con oftalaldeide ed etilmercaptano. Il procedimento è descritto
in dettaglio in Cozzi et al. (2002).
Per valutare gli effetti dell’ischemia globale sul rilascio di glutammato e di GABA, alcuni dei
gerbilli cui verrà impiantata la cannula da microdialisi verranno anche sottoposti ad occlusione
bilaterale delle carotidi per 5 min. Gli animali verranno anestetizzati con alotano e attraverso
un’incisione nella parte ventro-mediale del collo dell’animale verranno isolate le carotidi, che
saranno poi occluse tramite clips chirurgiche per 5 min. Al termine del periodo di occlusione, le
clips verranno aperte per permettere il ripristino del flusso attraverso le arterie e l’incisione verrà
suturata. A distanza di 7 giorni dall’insulto ischemico, i gerbilli verranno sacrificati e i loro cervelli
verranno isolati e congelati. Sezioni coronali (20 µm) verranno tagliate al criostato e colorate con
blu di toluidina. Almeno 4 sezioni per ogni animale saranno analizzate al microscopio. Il danno
ippocampale verrà valutato quantitativamente contando il numero delle cellule piramidali della
regione CA1 dell’ippocampo che appaiono normali da un punto di vista istologico.
3. Studi di neuroprotezione in un modello sperimentale in vitro di ischemia cerebrale. Per valutare il
contributo dell’interazione tra i recettori mGlu1 e CB1 nel meccanismo della morte neuronale postischemica utilizzeremo fettine organotipiche di ippocampo sottoposte a OGD, una tecnica che viene
abitualmente utilizzata nel nostro laboratorio (Pellegrini-Giampietro et al., 1999a e 1999b).
Fettine organotipiche di ippocampo (420 µm) verranno preparate in ambiente sterile da ratti Wistar
maschi e femmine di 8-10 giorni di età (circa 320 animali/anno). Le fettine verranno prima
sciacquate in soluzione salina bialnciata di Hank e quindi trasferite su membrane semiporose di 30
mm di diametro collocate in piastre da 6 pozzetti contenenti 1.2 ml di terreno di coltura. Le fettine
verranno coltivate in un incubatore a 37° e in un’atmosfera di aria umidificata e 5% di CO2 e il
terreno di coltura verrà cambiato due volte a settimana. Le fettine verranno fatte maturare in coltura
per 12-14 giorni.
Le fettine organotipiche, dopo 14 giorni in vitro, verranno sottoposte a OGD incubandole per 30
min con un medium privo di siero e di glucosio e saturato con una miscela di N2 95% /CO2 5% in
una cameretta ipossica dotata di controllore del flusso e della tensione di ossigeno. Al termine, le
colture verranno incubate con un medium privo di siero ma contenente glucosio e ricollocate
nell’incubatore in condizioni normossiche fino al momento della valutazione del danno 24 h dopo.
Tale valutazione verrà effettuato utilizzando la molecola fluorescente propidio ioduro (PI), un
composto altamente polare che entra nelle cellule solo se la membrana è danneggiata e diventa
fluorescente una volta che si lega al DNA. Il PI sarà aggiunto al terreno di coltura alla fine delle 24
h post-OGD. La fluorescenza verrà valutata 30 min dopo utilizzando un microscopio a
fluorescenza, equipaggiato con un obiettivo 4 X e un filtro per la rodamina. Le immagini saranno
analizzate utilizzando l’immagine video ottenuta con una videocamera controllata da software. Per
quantificare la morte cellulare, la regione CA1 dell’ippocampo verrà identificata ed analizzata
mediante un programma di densitometria (Image-Pro Plus, Media Cybernetics), che consente di
misurare l’intensità dell’emissione di fluorescenza nella regione danneggiata.
4. Studi di immunocitochimica in fettine organotipiche ippocampali di ratto. Per esaminare la
localizzazione dei recettori mGlu1α and CB1 in specifiche popolazioni di interneuroni nell'area
CA1 dell'ippocampo eseguiremo esperimenti di immunocitochimica in fettine organotipiche
ippocampali in condizioni di controllo o di OGD.
Le fettine, come descritto in Boscia et al. (2008), verranno fissate in paraformaldeide al 4% e acido
picrico allo 0.2% in tampone fosfato 0.1 M (pH 7.4) per 1 h, bloccate con albumina serica bovina al
3% e quindi incubate con gli anticorpi primari per il recettore mGlu1α (di topo, monoclonale, antimGlu1α, 1:1000, fornito dal Dr. Peter Nemeth, Università di Pécs, Ungheria) o per il recettore CB1
(L15, C-terminale, di coniglio, anti-CB1, policlonale, 1:4000, fornito dal Dr. Ken Mackie,
University of Washington, Seattle, USA). Dopo 48 h, le fettine verranno incubate con l'anticorpo
secondario biotinilato corrispondente. Verrà eseguita quindi la reazione perossidasica utilizzando
come cromogeno la 3,3'-diamonobenzidina 4-HCl.
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