Dipartimento di Farmacia

ANTIBIOTICI
BETA-LATTAMICI
Scoperta della Penicillina : cenni storici
•1928 - Alexander Fleming
Nota che la muffa di pane (Penicillium notatum), che puo’ crescere in
piastre di Petri, inibisce la crescita di stafilococchi.
•1939 - Florey, Chain e Collaboratori
Isolano, caraterizzano e sintetizzano e la Penicillina (G).
•1940 –1945 Produzione industriale ed uso durante la II guerra mondiale
•1945 – Dorothy Hodgkins
Risolve l’enigma della struttura della Penicillina G (Rx)
•1958 – John C. Sheehan
Sintesi totale della Penicillina G
• La potenza (purezza) di una penicillina viene misurata in Unita Internazionali (UI). L’ UI è la
q. (mg) di Penicillina che in condizioni sperimentali “standard” inibisce la crescita in vitro dello
Staph. Aureus
1UI= 0.6 mg di Pen. G sodica ; 600 mg di PenG sodica= 1.000.000 UI
PBPs, Penicillin Binding Proteins; Low MW, carboxy-, endo-,
trans-peptidase and B-lactamases
High MW: multimodal, trans-peptidase and trans-glycosilase activity
Me
Me
Me
C55-PP
C55-PP
Me
DAP
Me
Linkers: Acido diaminopimelico (DAP);
Lisina (Lys); Gly-(Gly)3-Gly
NH2
HO
O
NH2
O
OH
PbP-Proteasi seriniche
His
Asp
His
Asp
Ser
Ser
Attacco
nucleofilico
Substrato
polipeptidico
Complesso di Michaelis M.
His
Asp
Ser
Asp
His
Ser
AA N-term
Acil-enzima intermedio
( segue …)
Intermedio tetraedrico
Buca
ossianionica
PbP-Proteasi seriniche
His
Asp
His
Asp
Ser
Ser
idrolisi
Formaz. Leg.
peptidico
Asp
Acil-enzima
intermedio
Asp
His
O
O
Ser
R1
R-NH2
His
H N
N
H
H N
R
Asp
Ser
O
R1
O
O
O
His
H N
H N
R
N
Ser
HO
R1
O
R= -D-Ala-Lys (-Gly)5- or DAP)-Glu-Ala-NAMA-NAG
Cross-linkyng del peptidoglicano
R1= D-Ala-D-Ala-Lys(-Gly)5- or DAP-Glu-Ala-NAMA-NAG
CARATTERISTICHE CHIMICHE E STRUTTURALI
H
6R
5R
3S
• Biogenesi da 2-3 aa: Acil-L-cisteinil-D-valina
• Tre centri chirali (3S, 5R, 6R: H5 e H6 :cis))
• Presenza di un gruppo COOH in 3, pKa = 2,3
• Presenza di un nucleo beta-lattamico
• Instabile in ambiente acido
• Instabile in ambiente basico
STRUTTURA
Catena acilica
R=
O
CH2
C
Benzil penicillina (Pen G)
H H
N
H
S
R
N
R=
O
Me
Me
Acido 6-aminopenicillanico
(6-APA)
O
CH2
CO2H
Tiazolidina
b-lattame
Fenossimetil penicillina (Pen V)
I sostituenti 6-b-acilammidici variano in funzione di precursori acidi presenti nel medium di
fermentazione
CH2
CO2H
Penicillina G
OCH2
CO2H
Penicillina V
(prima penicillina attiva per o.s.)
Strutture b-lattamiche
5(1)
4(1)
6
7
O
5
N
3(2)
N
Pename
8
O
N
O
1(4) 2(3)
6 S
7
S
S
O
Peneme
Carbapeneme
3
4(2)
N
3(3)
1(5) 2(4)
Cefeme
4
O
2
N
1
Monobactame
[In parentesi numerazione comune : 6-APA-(3-COOH), 7-ACA (4-COOH)]
R
H
N
O
R
S
H
N
O
N
O
S
N
R
O
HO
O
HO
O
Nomi IUPAC di alcuni nuclei b-lattamici
(R)
S
S
Pename
N
N
O
O
4-Tia-1-aza-biciclo[3.2.0]eptan-7-one
N
O
O
N
1-Aza-biciclo[3.2.0]ept-2-en-7-one
H2N
(R)
H H
(Z)
5-Tia-1-aza-biciclo[4.2.0]oct-2-en-8-one
Carbapeneme
(Z)
Cefeme
Clavame
O
4-Oxa-1-aza-biciclo[3.2.0]eptan-7-one
S
(R)
N
O
HO
(S)
O
Acido
6-Amino-3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-1-aza-biciclo[3.2.0
]eptane-2-carbossilico
H2N
(R)
H H
6-APA (Acido 6aminopenicillanico
S
(R)
N
O
HO
(Z)
O
O
O
Acido
3-Acetossimetil-7-amino-8-oxo-5-tia-1-aza
-biciclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carbossilico
7-ACA (Acido 7aminocefalosporanico)
NOMI IUPAC di alcuni composti b-lattamici
Benzilpenicillina (Pen.G)
H
H H
N
S
O
O
N
HO
O
Fenossimetilpenicillina (Pen.V)
H
H H
N
S
O
O
O
N
HO
Acido
3,3-Dimetil-7-oxo-6-fenilacetilamino-4-tia-1-aza
-biciclo[3.2.0]eptan-2-carbosslico
O
Acido
3,3-Dimetil-7-oxo-6-(2-fenossi-acetilamino)-4-tia-1-az
a-biciclo[3.2.0]eptan-2-carbossilico
Principali classi di AB betalattamici
naturali
semisintetici
CH2CO
SAR
Amide
essential
Ammide
O
C
H
N
Stereochimica
cis (5R,6R)
Cis
S tereochemistry
essential
H
H
R
S
Me
N
O
b Lactam
essential CO2H
b-lattame
Me
Carboxylic
acid essential
Acido carbossilico
(3S)
Sistema
biciclico
Bicyclic
system
essential
•
•
•
•
•
Le funzioni ammidica e carbossilica (carbossilato)
sono coinvolte nel binding all’enzima;
Meccanismo d’azione determinato dal b-lattame;
Attività determinata da parametri geometrici del b-lattame;
(fattori di stabilità)
La struttura biciclica incrementa la tensione sterica del b-lattame;
Le modifiche strutturali possibili sono tipicamente limitate alla catena
6-b-acilammidica e influenzano attività/spettro am e proprietà farmacoconetiche
L-Lys-D-Ala-D-Ala
Meccanismo d’azione
O
C
H H
N
S
R
N
Nu
O
H
Me
Me
O
Enz
C
CO2H
+-H
H H
N
R
Enz-Nu
H
S
Me
O
N
Me
O
H
C
CO2H
H H
N
H
R
O C HN
Nu-Enz
S
Me
Me
CO2H
Legame
covalente
al
sito
catalitico dell’enzima;
Inibizione (quasi) irreversibile
(substrato suicida)
TRANSPEPTIDASI: MECCANISMO DI CATALISI E DI INIBIZIONE
Analogia strutturale delle penicilline con la
porzione D-Ala D-Ala del peptidoglicano
O
R
H
CH3
O
H
N
O
N
H
H H
S
H
H3C
O
H
N
R''
O
N
O
[Ser-OH]
D-Ala
z
CH3
CH3
H
O
O
O
H
CH3
Transpeptidasi
TP
R
[Ser-OH]
TP
N
H
O
Gly-R’
H
N
R''
O
R
H
CH3
O
O
H
N
R'
N
H
O
H
H
H H
S
HN
TP
CH3
CH3
O
H
O
O
Analogia Strutturale della Penicillina G con la porzione
D-Ala-D-Ala del Peptidoglicano: sovrapposizione
molecolare
Meccanismo Normale
Peptide
Chain
Peptide
Chain
Peptide
Chain
Peptide
Chain
Peptide
Chain
D-Ala
D-Ala
CO 2H
D-Ala
Gly
Gly
O
OH
D-Ala
OH
H
Meccanismo inibito da penicillina
Blocked
Peptide
Chain
Blocked
H2 O
O
R
C
O
H
NH
S
N
O
H
OH
Me
Me
R
O
Gly
C
NH
H
O
R
S
NH
H
O
HN
HN
Me
CO2H
O
C
Me
CO2H
Blocked
O
S
Me
Me
CO2H
Irreversibly blocked
Caratteristiche dell’anello b-Lattamico
•Struttura instabile ( forte tensione angolare)
•Elevata capacità elettrofila acilante
•Acila le transpeptidasi e le b-lattamasi
-Labile (idrolisi) in ambiente acido e basico
•I prodotti di degradazione sono immunogenici
Michael I. Page and Andrew P. Laws Tetrahedron 56 (2000) 5631-5638
NUCLEI b-LATTAMICI di PEN e CEF
(cfr. di angoli di legame all’azoto e conseguenze)
S
S


b
N
N

O
b
O

cefeme
pename
N piramidale
(NH3)
N tetraedrico
sp3 (NH4+)
Pename
Cefeme
N trigonale
sp2 (ammidi)

107°
109°
95°
95°
120°
b
107°
109°
117°
126°
120°

107°
109°
128°
133°
120°
S, b, 
321°
327°
340°
354°
360°
360S
39°
33°
20°
6°
0°
3.0 Å > c > 3.9 Å
Cohen
(R.B. Woodward, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1980, B289).
0.5 Å > h > 0.25 Å
Woodward
Attive
Inattive
Stabilità Abl
(3/6)
( Assistenza Anchimerica)
OH
Reattività vs nucleofili
-
CURRENT SCIENCE, VOL. 87, NO. 12, 25 DECEMBER 2004
Stabilità Abl
(1/6)
Stabilità in soluzione acquosa della Penicillina G
Valori di temperatura:
da 25°C (a) a 60°C
(f)
Stabilità Abl
(4/6)
R
R
C
R
C
NR2
O
O
N
R
Ammide 3a
Me
S
Me
S
X
Me
N
O
Me
CO2H
sistema ciclico “folded”
Tautomero stericamente “negato”
H
C
N
H
S
O
N
O
•
•
CO2H
H
b-lattame
R
N
O
N
R
S
N
R
S
-H
O
N
O
O
HN
O
H
L’interazione tra il doppietto dell’azoto con il carbonile non è possibile;
Ne consegue una maggiore reattività del carbonile
Altre reazioni
Stabilità Abl
(I) Penicillina G (Benzilpenicillina)
(5/6)
H H H
N
S
(R)
O
3,3-Dimethyl-7-oxo-6-phenylacetylamino-4-thia
-1-aza-bicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
(R)
N
O
HO
(S)
O
• Penicillina biosintetica (Penicillium notatum Westling o Penicillium
chrisogenum Thom + ac.fenilacetico)
• Poco stabile in ambiente acido (no o.s.)
• Sensibile alla penicillinasi
• Attiva su Gram+ e solo su alcuni Gram- ( spettro AM ristretto)
• Proprietà PK non ideali : rapidamente assorbita ed eliminata (alte dosi):
•inattivata in parte dal succo gastrico (richiesta di dosi molto elevate);
•sale di Na o di K per uso i.m. e e.v.;
•rapida escrezione renale (si somministra ogni 4 h);
•penicillina G sale di procaina, benzatina etc…. (sospensioni acq.):
•lento assorbimento e lento rilascio del principio attivo;
•durata di azione prolungata.
Benzatina  (PenG)2
Procaina  PenG
Stabilità Abl
Penicilline stabili in ambiente acido (o.s.=)
(6/6)
Strategia
Introdurre sostituenti elettronattrattori nel gruppo 6-b-acilammidico per ridurre la
nucleofilia dell’ossigeno carbonilico
X
H
N
E.W.G.
H
HC
S
C

S
N
O
Riduzione della
nucleofilia/assist.
anchimerica
NH2
H
N
N
O
O
CH2
H
C
R
O
PhO
H
N
S
Ampicillina
OH
Carbenicillina
CH3
N
O
O
NH2
HO
H
C
X = NH2, Cl, PhOCONH,
AmoxicillinaCO H
Heterocycles,
2
O
Penicillina V (attiva per o.s.)
Cl
N
Cl
Dicloxacillina
CH3
O
N
Cl
O
Cloxacillina
PENICILLINE DI PRIMA GENERAZIONE
Il prototipo
Penicillina G
Acido resistenti
Penicillina V
Penicillinasi resistenti
Meticillina, Ossacillina
PENICILLINE DI SECONDA GENERAZIONE
“Largo Spettro”
Amoxicillina, Ampicillina
+inibitori della b-lattamasi (Augmentin,Unasyn)
PENICILLINE DI TERZA GENERAZIONE
“Antipseudomonas”
Carbenecillina, Ticarcillina
+inibitori della b-lattamasi (Timentin)
PENICILLINE DI QUARTA GENERAZIONE
“Spettro esteso”
Mezlocillina, Piperacillina,
Mecillinam
Resistenza Abl (1/6)
Penicilline b-lattamasi resistenti:
Meticillina, Nafcillina, Isossazolil-penicilline.
Resistenza agli Abl:
•Nei Gram- gli Abl devono permeare specifiche porine nella regione esterna della
parete cellulare, attraversare lo spazio periplasmatico ed infine attacare il target
PbP, localizzate nella regione esterna della membrana citoplasmatica
Resistenza
generata da
modificazioni
delle PbP
Resistenza
generata da
alterazioni
delle porine
Gram -)
Resistenza
generata da
produzionei di
b-lattamasi
Resistenza Abl (3/6)
Sensibilità alle b-lattamasi
In sintesi
• Enzimi che inattivano gli Abl per opertura dell’anello b-lattamico;
• Inducono resistenza trasferibile, tra ceppi, agli Abl (p.e. infezioni da Staphylococcus
aureus, 80% delle infezioni Staph. ospedaliere sono resistanti alla penicillina G e ad altri
antibatterici sin dal 1960)
• Il meccanismo d’azione delle b-lattamasi è identico al meccanismo di inibizione del
proprio enzima target.
O
O
C
H
N
H
S
R
N
Me
Me
b-Lactamase
C
H
N
H
S
R
HO2C
HN
Me
Me
O
CO2H
CO2H
Meccanismo di azione di due classi
di Beta-lattamasi
(H2O)
Resistenza Abl (5/6)
•
•
•
•
O
Instabile in ambiente acido
Resistente alle b-lattamasi
Attiva verso Gram+,
Attiva contro lo S. Aureus. La
resistenza insorge per
modificazione di PBPs (MRSA)
O
N
H
O O
H H
(R)
Meticillina
S
(R)
N
(S)
O
HO
Impedimento sterico dei due OMe
O
O
N
H
O O
Gruppo ingombrante
H H
(R)
H
N
S
N
H
H
S
Me
R
(R)
HO
Nafcillina
C
N
Me
O
(S)
O
Sito catalitico
_____ betalact
_____ transpept
Impedimento sterico di OEt e di un anello arom. del Naftile
CO2H
Resistenza Abl (6/6)
Isoxazolil-penicilline (penicillinasi resistenti, os)
Oxacillin (R1 = R2 = H),
R2
(Penstapho®)
Cloxacillin (R 1 =Cl; R 2 =H)
Dicloxacillin (R 1 =R 2 =Cl)
Floxacillin (R 1 =Cl ; R 2=F)
R1 N
RCOCH2- > RCO-
•Bioisosteria dell’anello isossazolico con il fenile
•Stabili alle b-lattamasi
•Stabili in ambiente acido
•Attive contro Gram+
•La Dicloxacillina è il composto più attivo
•Inattive verso MRSA
O
O
H H
N
H
O
(R)
S
(R)
N
HO
(S)
O
Inibitori blat (1/8)
Inibitori b-lattamasi
•Hanno una attività antibatterica trascurabile
•Dati in combinazione con antibiotici b-lattamici (un esempio
di sinergismo di farmaci)
•Augmentin® = amossicillina + ac. clavulanico
•Unasyn® = ampicillina + sulbactam
•Zosyn ® = piperacillina + tazobactam
6
H 1
O2
5
7 N
4
O
3
9
H
OH
8
CO2H
clavulanic acid
O O
S
N
O
sulbactam
Pivsulbactam, prodrug: 3-COOCH2O-COC(CH3)3
N
N
O
CO2H
O O
S
H
N
N
CO2H
Tazobactam
Inibitori blat (2/8)
Acido Clavulanico: Meccanismo di inibizione delle b-Lattamasi
Spettro attività Abl (1/6)
Estensione dello spettro di attività
Resistenza batterica
• Pareti cellulari che presentano modificazioni tali da ridurre la penetrazione
degli Abl;
• Iperespressione di PbB;
• Modificazioni delle PbP con conseguente resistenza agli Abl;
• Presenza di b-lattamasi e loro trasferimento tra ceppi;
• Alterazione dei meccanismi di efflusso (>).
Strategie possibili
• Il numero delle variabili coinvolte
rende, ad oggi, impossibile l’adozione
di una singola strategia di disegno;
• Uso massivo del protocollo trial-error
mediante modificazioni dei
sostituenti
6-b-acilammidici;
• Identificazione di Abl ad ampio
spettro in conseguenza della sintesi
e screening di migliaia di nuovi
composti;
• Analisi di alcune relazioni generali tra
struttura ed attività.
>
<
logP: ≥ Gram+; « Gram-
logP: ~ Gram+; > Gram-
O
H H
N
H
O
S
N
HO
NH2; OH; COOH
» Gram-
O
Parete batterica
Spettro attività Abl (2/6)
(II) Penicilline ad ampio spettro
R = H : Ampicillina
(Ampilux,Amplital,Amplizer,Ampilium..)
R = OH : Amoxicillina
(Alfamox,Amoxillim,Miopen…,Zimox)
R
O
(R)
N
NH2 H
O
H H
S
(R) (R)
N
HO
(S)
O
• 2-8 volte più attive della Pen G.
• Composti anfoteri (il gruppo amminico del sostituente in posiz. 6
è protonato a pH fisiologico).
• Migliore penetrazione della parete cellulare dei Gram (per la maggiore idrofilia della molecola).
• La carica positiva sulla catena laterale dà maggiore stabilità in
ambiente acido, minore assistenza anchimerica (il gruppo
amminico protonato è un forte elettron attrattore)
Profarmaci della ampicillina
Spettro attività Abl (3/6)
(R)
(R)
O
N
NH2 H
O
H H
(R)
EtOH+CO2+CH3CHO
S
O
H H
(R)
N
NH2 H
O
O
S
(R)
N
O
OH
O
(S)
O
O
Pivampicillina
(R)
J. Med. Chem. 13:607-612.
N
O
(S)
O
O
O
O
(R)
O
N
NH2 H
Bacampicillina
(R)H
O
H
S
(R)
O
N
(S)
O
O
(Bacacin, Bacagen,..,Campixen)Penglobe,Rebacil,Winnipeg)
O
(Z)
O
O
ANTIMCROBIAL AGzNTS AND CHEMOTHzRAPY, Nov. 1975, p. 518-526
OH
Lenampicillina
Antimicrob Agents Chemother. 1986 May; 29(5): 948–950.
• Composto basico (l’ampicillina è anfotera)
• L’ idrolisi enzimatica nella parete intestinale libera:
ampicillina alcool etilico, CO 2 e acetaldeide
• Stesso spettro dell’ampicillina, meno effetti
collaterali (diarrea)
(R)
O
N
NH2 H
(R)H
O
H
(R)
N
O
(S)
O
O
O
S
O
HO
HO
Talampicillina
Br Med J. 1976 June 5; 1(6022): 1378–1380
Spettro attività Abl (4/6)
Penicilline Antipseudomonas (biacidi)
Carbenicillina
• Prima penicillina attiva contro P. aeruginosa
• Il gruppo carbossilico la rende + idrofila ( Gram-)
• Miscela di epimeri (Stereocentro fenilmalonico)
• Instabile in ambiente acido (decarbossila a Pen G)
• Sensibile alle b-lattamasi
• Prodrug della carbenicillina ( estere
aromatico). Il semplice estere fenolico,
poco usato, si chiama carfecillina)
Carindacillina
•Isostere della carbenicillina
•Associazione con ac. Clavulanico (Timentin)
Ticarcillina
Spettro attività Abl (5/6)
Acilureido Penicilline
( derivati ureidici dell’ ampicillina)
O
O
N
N
H
N
R
O
O
H H
N
H
O
• Ampio spettro; attive vs produttori di b-lattamasi
S
• H. influenzae, Klebsiella species, Pseudomonas species, Proteus
N
O
OH
Piperacillina
H3C
O S N
O
HR O
N
N
O
O
H H
N
H
O
S
N
O
OH
Mezlocillina
HN
O
H
N
N
O
RO
H H
N
H
O
N
O
Azlocillina
S
OH
mirabilis, E. coli, Enterobacter species, Streptococcus faecelis,
Peptococcus species, Peptostreptococcus species, Bacteriodes
species (including B. fragilis), Morganella morganii, Serratia species,
N. gonorrhoeae, P. vulgaris, and Providencia rettgeri.
• Infezioni delle basse vie respiratorie, del tratto
urinario, intraddominali e della cute; setticemie;
appendicite complicata; infezioni in pazienti
neutropenici.
Spettro attività Abl (6/6)
Ammidinopenicilline
H H
N
N
O
S
N
O
OH
• Gruppo ammidinico al C-6
Mecillinam
H H
N
N
O
• Solo Gram neg.; pseudomonas poco sens.; poco
stabile b-lattamasi
S
• Pivmecillinam: prodrug attivo per os; per idrolisi
N
O
O
O
Pivmecillinam
vengono prodotti
•Ac. pivalico, aldeide formica e Mecillinam
DIAPOSITIVE ADDIZIONALI
EFFETTI INDESIDERATI DELLE
PENICILLINE
• Bassa tossicità diretta
sui tessuti
• Ipersensibilità
– 5% della popolazione
– Acute-Immediate
(shock anafilattico)
– Immediata
– Ritardata
• Prevenzione?
Reazioni Allergiche
• Acute (entro 30 min): orticaria, angioedema,
broncocostrizione, disturbi gastrointestinali, e
shock.
• Immediate (da 30 min a 48 hrs): orticaria, prurito,
mild edema alla laringe, reazioni infiammatorie
locali
• Ritardate (dopo 2 o più giorni): arrossamento della
pelle, glossite acuta, stomatiti severe.
Resistenza Abl (2/6)
Resistenza Abl (4/6)
Meccanismo
H2O
enzyme
H
enzyme
Livermore, D. M. Clin. Microbiol. Rev. 1995.
Structure made in Chemdraw
OHH
Inibizione b-lattamasi (IC50 mg/mL)
Patogeno
Classe
enzima
Acido
clavulanico
Sulbactam
Tazobactam
BRL 2715
S. aureus
A
0.063
1.4
0.27
0.016
E. coli (TEM1)
A
0.055
1.7
0.028
0.002
E. coli (SHV-1)
A
0.035
13.0
0.14
0.001
Enter. cloacae
(P99)
C
>50
5.0
0.93
0.002
E. coli (OXA-1)
D
0.71
2.2
1.1
0.001
Amoxicillina + Inibitore (mg/mL)
Patogeno
Classe
enzima
Senza
inibitore
Acido
clavulanico
Sulbactam
Tazobactam
BRL 2715
P. mirabilis
A
>512
16
64
16
2
E. coli (TEM1)
A
>512
8
128
8
2
K. pneumoniae
(SHV-1)
A
256
4
64
16
2
Enter. cloacae
C
512
>510
256
256
2
E. coli (OXA-1)
D
>512
>512
>512
>512
2
Stabilità Abl
(2/6)
Reazioni di degradazione in ambiente acido e basico
CURRENT SCIENCE, VOL. 87, NO. 12, 25 DECEMBER 2004
Inibitori blat (3/8)
1. Oxapenemi
Acido Clavulanico
1. I derivati oxapenemici sono inibitori delle b-lattamasi a spettro ristretto;
2.Lenta deradazione durante i test biologici e prolungato stoccaggio
Inibitori blat (4/8)
2. Penemi
(1975-Woodward Research Institute in Basel;
I più potenti inibitori di bLat sinora scoperti)
Ar (tiofene o furano >> CH3
Z>E
Sost << H