Eredita’ X-linked e inattivazione
del cromosoma X
Lezione 10
By NA
1
Inattivazione del cromosoma X
Nel 1966 Mary Lyon formulo’ l’ipotesi che oggi
porta il suo nome (lyonizzazione), per spiegare alcuni
fenomeni osservati nelle cellule di mammifero di sesso
femminile
Si erano accumulate alcune osservazioni:
Nei nuclei delle femmine e’ presente una masserella
condensata che corrisponde al numero delle X meno 1
Lo stesso fenomeno si osserva nei maschi XXY, ma non nelle
femmine X0
Marcando con timidina triziata nella tarda fase S si osserva la
presenza di un cromosoma fortemente marcato che per dimensioni ed
aspetto corrisponde al cromosoma X solo nelle cellule con almeno 2
cromosomi X.
By NA
2
X inattivo
By NA
3
Inattivazione del cromosoma X
Altre osservazioni ottenute da Mary Lyon nei
sui esperimenti sui topi:
Femmine eterozigoti per 2 loci che determinano il colore del pelo
e che mappano sul cromosoma X presentano mantello a chiazze
(anche il gatto ha questo tipo di fenotipo) e non un colore uniforme
anche se intermedio rispetto ai due colori.
Il fenotipo e’
trans:
diverso se si osserva una eterozigote in cis o in
in cis: le macchie sono composte dei due colori
in trans: le macchie sono o di un colore o dell’altro.
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4
Esperimenti di Mary Lyon nei topi I
locus colore A: alleli A1 e A2
colore della punta: grigio (wt) o nero
punte nere su marrone
A1/y
A2/y
X
locus colore B: alleli B1 e B2
colore della base: marrone(wt) o giallo
A1/A1
punte grigie su
marrone
A1/A2
alla base: tutti marroni. alla punta: maschi grigi e femmine grigie e nere
in regioni distinte
By NA
5
Esperimenti di Mary Lyon nei topi II
locus colore A: alleli A1 e A2
colore della punta: grigio (wt) o nero
locus colore B: alleli B1 e B2
colore della base: marrone(wt) o giallo
B2/y
punte grigie su giallo
B1/B1
punte grigie su
marrone
X
B1/y
B1/B2
alla base: maschi marroni, femmine gialle e marroni in regioni distinte.
alla punta: tutti grigi
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6
Esperimenti di Mary Lyon nei topi III
locus colore A: alleli A1 e A2
colore della punta: grigio (wt) e nero
locus colore B: alleli B1 e B2
colore della base: marrone(wt) e giallo
IL FENOTIPO A MACCHIE SI PRESENTAVA CON ENTRAMBI I LOCUS
CHE CHIARAMENTE ERANO X LINKED (Esperimenti sulla Drosophila
Genetica I)
FECE INCROCI PER DEFINIRE IL LINKAGE FRA I DUE LOCUS
(Ricordate i reincroci sempre genetica I?) E EBBE DELLE SORPRESE:
LE FEMMINE CHE AVEVANO UGUALE GENOTIPO, NON AVEVANO
UGUALE FENOTIPO: IL FENOTIPO DIPENDEVA DALLA FASE IN CUI
SI TROVAVANO RECIPROCAMENTE GLI ALLELI DEI DUE LOCUS.
By NA
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Esperimenti di Mary Lyon nei topi IV
locus colore A: alleli A1 e A2
colore della punta: grigio (wt) e nero
punte grigie su giallo
A1/Y
B1/Y
A1/Y
B2/y
A2/Y
B1/Y
maschi tutti marroni alla base
alle punte 1/2 grigi, 1/2 neri
questo mi conferma la fase della
femmina parentale
By NA
locus colore B: alleli B1 e B2
colore della base: marrone(wt) e giallo
X
A1/A2
B1/B1
A1/A1
B1/B2
1/2 femmine:
punte grigie su
macchie gialle o
marroni
punte grigie o
nere su marrone
A2/A1
B1/B2
1/2 femmine:
punte grigie sul
giallo, punte
nere sul marrone
8
Esperimenti di Mary Lyon V
locus colore A: alleli A1 e A2
colore della punta: grigio (wt) e nero
punte nere su giallo
locus colore B: alleli B1 e B2
colore della base: marrone(wt) e giallo
A2/Y
B2/Y
X
A1/A1
B1/B1
punte grigie su
marrone
A1/A2
B1/B2
maschi tutti marroni con
punte grigie
By NA
femmine: punte grigie sul marrone,
punte nere sul giallo
9
Esperimenti di Mary Lyon VI
locus colore A: alleli A1 e A2
colore della punta: grigio (wt) e nero
A2/A1
B1/B2
femmine: punte grigie sul giallo,
punte nere sul marrone
locus colore B: alleli B1 e B2
colore della base: marrone(wt) e giallo
A1/A2
B1/B2
femmine: punte grigie sul marrone,
punte nere sul giallo
Queste femmine sono doppie eterozigoti, geneticamente sono uquali,
ma hanno fenotipi differenti. Hanno anche fasi diverse: gli alleli dei due
locus sono abbinati in modo diverso e’ questo che genera il fenotipo
diverso.
By NA
10
Mary Lyon
Ipotesi di Mary Lyon:
Uno dei due cromosomi X presenti
nella linea somatica femminile, viene
precocemente inattivato durante lo
sviluppo embrionale. L’inattivazione e’
casuale. Come risultato la femmina e’
un mosaico di cellule funzionalmente
emizigoti per uno o l’altro dei
cromosomi X.
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11
G6PD-HPRT
Donna eterozigote G6PD+/-
By NA
Donna eterozigote HPRT+/-
12
G6PD
Cellule di donna eterozigote G6PD+/Coltura
originaria
Coltura
di singolo
clone
Coltura
di singolo
clone
Direzione
migrazione
Lenta
Veloce
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13
Inattivazione del cromosoma X
L’inattivazione del cromosoma X avviene intorno al
15mo-16mo giorno dell’embriogenesi (l’embrione e’
composto di circa 5000 cellule). Una volta che un
cromosoma X (materno o paterno) e’ stato inattivato
lo sara’ in tutte le popolazioni cellulari che derivano da
quella cellula.
La casualita’ dell’inattivazione e’ tipica dei mammiferi:
nei marsupiali viene inattivato preferenzialmente il cromosoma
paterno. Nel topo le cellule del trofoblasto inattivano il
cromosoma X paterno per una ragione tuttora ignota.
La casualita’ viene meno in presenza di X riarrangiate
By NA
14
Zigote
15mo-16mo
giorno
Xmat
Xpat
Inattivazione del
cromosoma X
schema
Inattivazione
casuale
Come avviene l’inattivazione e come viene mantenuta?
By NA
15
L’ inattivazione
domande
Vengono inattivati tutti i geni della X?
No, inizialmente si riteneva che l’inattivazione
coinvolgesse tutto il cromosoma, oggi sappiamo che non
vengono inattivati i geni della regione pseudoautosomica :
i geni di questa regione hanno un omologo sul cromosoma Y
Non vengono inattivati geni che hanno pseudogeni sul
cromosoma Y, e altri geni per i quali non si conosce la
ragione. Comunque il cromosoma X risulta inattivato al 90%
C’e’ una regione sul cromosoma X da cui inizia
l’inattivazione ?
Come avviene e come si mantiene l’inattivazione?
By NA
16
L’ inattivazione
domande
C’e’ una regione sul cromosoma X da cui inizia
l’inattivazione ?
Si, la regione Xq13. In questa regione e’ presente
il centro di inattivazione Xic che agisce in cis . E’ stato
individuato un locus Xist che sembra essere il gene che
controlla il processo di inattivazione.
La mappatura di Xic e il clonaggio di Xist sono stati resi
possibili grazie allo studio dei riarrangiamenti del cromosoma
X in cui l’inattivazione non casuale: l’inattivazione dipende dal
tipo di riarrangiamento
By NA
17
L’ inattivazione
le traslocazioni X/Autosoma
Xic agisce in cis:
il frammento fisicamente
separato non puo’ inattivarsi
due copie Xp attive
parte autosoma inattiva
morte della cellula
Inattivazione
casuale dell’X
X X/A
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A/X A
un cromosoma X attivo
due autosomi attivi
questo clone e’
l’unico che si ritrova
18
L’ inattivazione X(isop), X(isoq) e X(del)
Isocromosoma
X
del braccio corto
non si ritrova mai
Isocromosoma
del braccio lungo
sempre inattivato
(Sindrome di Turner)
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delezione del
delezione del
braccio corto
sempre inattivato
(Sindrome di Turner)
braccio lungo
sempre inattivato
se la delezione non
coinvolge Xq13
(Sindrome di Turner)
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L’ inattivazione
Come avviene e si mantiene l’inattivazione?
Il clonaggio di Xist (X-inactive specific transcript) non
ha chiarito completamente il meccanismo: il prodotto di
questo gene (15Kb) non ha ORF, si ritiene che appartenga
alla classe dei geni il cui prodotto funzionale non e’ una
proteina, ma un mRNA.
Viene trascritto solo dal cromosoma inattivo, e’ espresso
nel nucleo, promuove il processo di inattivazione rimodellando
la cromatina attraverso l’ipoacetilazione degli istoni e la
metilazione dei geni.
Dall’inattivazione deriva l’eterocromatizzazione (corpo di Barr e la
replica tardiva del cromosoma X inattivato
By NA
20
L’ inattivazione
Come avviene e si mantiene l’inattivazione?
Si ritiene che l’inattivazione venga ottenuta metilando
le isole CpG. I geni presenti sul cromosoma inattivato
sono ipermetilati se confrontati con gli omologhi dell’altro
cromosoma o del cromosoma X del maschio.
Ricordare che le isole CpG sono presenti al 5’ dei geni e si ritiene che
rappresentino il sito di inizio della trascrizione.
Una volta che la metilazione e’ avvenuta al momento di
duplicare il DNA la citosina metilata verra’ riconosciuta
come tale dall’enzima che metilera’ la citosina dell’elica
neosintetizzata, garantendo il mantenimento
By NA
21
L’ inattivazione e l’eredita’ X-linked
Ipotesi di Mary Lyon:
Uno dei due cromosomi X presenti
nella linea somatica femminile, viene
precocemente inattivato durante lo
sviluppo embrionale. L’inattivazione e’
casuale. Come risultato la femmina e’
un mosaico di cellule funzionalmente
emiziogoti per uno o l’altro dei
cromosomi X.
La femmina portatrice di una patologia X-linked e’
“protetta” dalla presenza nel 50% delle sue cellule di un
gene funzionante. L’inattivazione non casuale di un
cromosoma X per effetto di un riarrangiamento puo’ aiutare
a clonare un gene malattia
By NA
22
L’inattivazione del cromosoma X e i geni
X-linked
By NA
23
X-linked recessiva
?
Esprimono il carattere quasi
esclusivamente i maschi
I genitori di solito non presentano
il carattere soprattutto se e’ una
patologia grave.
Lo stato di portatrice della
madre e’ certo se ha il padre
fratelli o parenti maschi che
manifestano (nel caso dele patologie
?
gravi il padre non e’ mai affetto)
?
?
?
?
Le femmine possono manifestare il carattere:
1. se il padre lo presenta e la madre eterozigote
By NA
2.
se l’inattivazione del cromosoma X non e’ casuale
24
Il gene della distrofina
Perche’ il gene della distrofina?
Perche’ e’ stato il gene il cui clonaggio ha rivelato
la complessita’ del genoma e la presenza di “giant
gene”, perche’ la mutazione del suo gene provoca
una patologia letale relativemente frequente fra i
maschi nati vivi (1:3500), perche’ ci permette di
vedere altri approcci allo studio e al clonaggio dei
geni, perche’ la diagnostica presenta alcune
difficolta’ e ci permettera’ di illustrare alcuni test
By NA
25
Un po ‘di storia DMD-RFLP
Nel 1982 venne identificato il primo RFLP associato al
locus DMD in Xp21. Nel giro di poco tempo altri RFLP
permisero di eseguire il gene tracking. Non si trovarono
pero’ polimorfismi con ricombinazione inferiore al 5%.
Nel 1985 la mappa della regione era stata in parte
ricostruita e la situazione che si presentava era:
L1.28
10cM
OTC 754
C7
2cM 8cM
7cM
99-6
8cM
D2
5cM
DMD
By NA
26
DMD- X/autosomi
Nel frattempo si erano raccolti i DNA di circa 20 ragazze
affette da DMD che presentavano traslocazioni X/autosomi.
Tutte presentavano il breakpoint sulla X in Xp21 ed erano casi
sporadici.
L’ipotesi era che il riarrangiamento avesse rotto il gene DMD e
che per effetto dell’inattivazione preferenziale del cromosoma X
normale, venisse manifestato il fenotipo Duchenne
By NA
27
DMD Inattivazione
due copie Xp attive
parte autosoma inativa
gene DMD attivo
morte della cellula
DMD
Inattivazione
casuale dell’X
X X/A
A/X A
un cromosoma X attivo
due autosomi attivi
gene DMD non funzionante
Affetta da DMD
By NA
28
DMD-XJ
1985 A Toronto un gruppo di ricercatori utilizzando il Dna
di una donna DMD portatrice di una traslocazione X/21,
riusci’ a clonare il breakpoint, e individuo’ una serie di
cloni (XJ)che, oltre ad essere polimorfici, evidenziavano
delezioni in alcuni pazienti DMD.
rDNA
rDNA
By NA
DMD?
29
DMD- Clonaggio
1986 A Boston il gruppo di Kunkel utilizzando il DNA di un
paziente, BB, portatore di un delezione citogenetica ed
affettoda DMD, retinite pigmentosa, ritardo mentale e
malattia granulomatosa cronica riesce a clonare il gene DMD.
La loro strategia si baso’ sul clonaggio per sottrazione: il paziente era
deleto per una grossa regione genomica, il suo DNA fatto riassociare con
DNAnormale avrebbe lasciato in soluzione le sequenze normali non presenti nel
DNAdeleto.
Con quei cloni fu testata una libreria di cDNA di muscolo e vennero
clonaticirca 8 cDNA che, testati sui pazienti, misero in evidenza delezioni.
Lo zoo-blot confermo’ trattarsi di un gene conservato, la sequenza evidenzio’ nei
pazienti mutazioni puntiformi di varia natura.
By NA
30
DMD-Distrofina
Quale e’ il prodotto del gene DMD?
L’RNA e’ lungo 13kb, la proteina ha un peso molecolare superiore a 400kDa,
e’espresso dal muscolo, anche se costituisce solo lo 0.002% delle proteine
totali.L’estremita’ N-terminale costituisce il dominio legante l’actina, segue un ampio
dominio a bastoncello, con 24 ripetizioni di sequenze simili composte da 109
amminoacidi. Dopo questo dominio e’ presente un dominio ricco in cisteina leganteil
Calcio, infine l’estremita’ C-terminale (420AA) interagisce con le altre proteine.
N-terminale
By NA
ripetizioni ad α elica
dominio legante Ca
C-terminale
31
DMD-Distrofina
Quale e’ la funzione del gene della distrofina?
Fa parte di un complesso che attraversando la membrana collega i
filamenti di actina del citoscheletro con la matrice extracellulare
(membrana basale)
By NA
32
By NA
33
DMD-Becker
La distrofia di Becker in che relazione e’
con DMD?
Dall’analisi di linkage era gia’ emerso che avrebbero potuto
essere alleliche
Dopo il clonaggio del gene DMD le stesse sonde sono
state testate sui pazienti affetti da BMD: sono
evidenti delezioni e mutazioni puntiformi. tutte le
evidenze sperimentali confermano che il locus e’ lo
stesso.
By NA
34
DMD-Becker
La distrofia di Becker in che relazione e’ con DMD?
Non e’ stato possibile individuare una regione critica specifica per le
due forme. Lo studio a livello di proteina ha evidenziato che in BMD la
distrofina e’ sempre presente anche se piu’ corta o in minore quantita’
By NA
35
Ricerca delle mutazione nel gene DMD
Due terzi dei casi di Distrofia Muscolare di
Duchenne sono dovuti a delezioni che
coinvolgono uno o piu’ esoni
Ci sono due “hot spot” di mutazioni: 5’ esoni dal 3
all’8 e al 3’ esoni dal 44 al 60 (principalmente 4450)
Si usa una PCR multiplex con reazioni prodotte da piu’
coppie di primer, ognuna delle quali amplifica uno specifico
esone. Se c’e’ la delezione non c’e’amplificazione
(naturalmente si sa quale e’ l’aspetto di una corsa elettroforetica di un
maschio normale.)
L’interpretazione nel caso delle femmine eterozigoti puo’
essere ambigua perche’ la X normale viene amplificata
By NA
36
Multiplex per le delezioni DMD
Test per evidenziare gli esoni 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 60
A
M
42
47
50
51
52
53
60
43
44
45
48
Miscela
A
Miscela
B
1A 1B
2A 2B
3A 3B
4A 4B
5A 5B
6A 6B
By NA
DNA
AFFETTI
1
2
3
B
4
5
6
C0
1
2
3
4
5
6
48
44
43
45
51
50
53
47
42
60
52
fig 7.4
37
Il materiale didattico e’ presente in rete:
http://www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.html
NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
By NA
38
