Relazione dell`attività svolta durante il primo anno del corso di

Relazione dell’attività svolta durante il primo anno del corso di
dottorato in neuroscienze
Anno accademico 2011-2012
CICLO XXVII°
Dottoranda: Michela Zaltieri
Coordinatore: Prof.ssa Cristina Missale
IL SILENZIAMENTO GENICO DI PGRN IN COLTURE
NEURONALI PRIMARIE:
UN MODELLO “IN VITRO” DI FTLD-U
1. INTRODUZIONE
La degenerazione lobare frontotemporale (FTLD) è la seconda causa più comune di demenza presenile dopo la malattia
di Alzheimer (AD) e rappresenta il 5-15% di tutte le forme di demenza (Neary et al., 2005;Rabinovici and Miller,
2010). Questa classe di patologie comprende molti sottotipi in quanto il quadro istopatologico può includere
degenerazione a livello delle aree prefrontali, extrapiramidali temporali e parietali e dei motoneuroni. I principali
sintomi associati alla perdita dei neuroni localizzati in queste aree cerebrali sono un declino delle funzioni temporali e
frontali che possono precedere o seguire i sintomi di natura motoria. La FTLD viene solitamente classificata in tre
sottotipi sulla base della presenza di inclusioni anomale nei neuroni. Inclusioni citoplasmatiche filamentose nei neuroni
e cellule gliali composte dalla proteina TAU iperfosforilata caratterizzano un gruppo di casi di FTLD comprendenti la
patologia di Pick (Spillantini et al., 1998). Più recentemente sono stati identificati casi di pazienti con inclusioni TAUnegative ma ubiquitina positive (FTLD-U) (Hodges et al., 2004). Il terzo sottotipo di FTLD è invece privo di
caratteristiche istopatologiche distintive e presenta un’insorgenza molto rara (Mackenzie et al., 2006). La FTLD ha una
componente genetica importante e numerosi loci e geni coinvolti sono stati identificati sui cromosomi 3, 9 e 17. Da un
punto di vista clinico, i pazienti affetti da FTLD-U presentano un quadro sintomatologico sovrapponibile a quello della
demenza frontotemporale (FTD), della demenza semantica (SD) e dell’afasia primaria progressiva (PPA). Di questi
sottotipi la FTD è la più comune ed è caratterizzata da disturbi progressivi della personalità e del comportamento
(disinibizione, depressione, apatia) che evolvono gradualmente in alterazioni cognitive e demenza. Dal punto di visita
neuropatologico è spesso osservata una atrofia severa del parenchima cerebrale a livello frontale, che può essere
asimettrica ma possono essere colpite diverse aree cerebrali con frequenza variabile. Altre caratteristiche includono
perdita di pigmentazione della sostanza nera e atrofia dei lobi temporali e parietali. Gliosi e attivazione delle cellule
microgliali sono visibili nelle regioni neocorticali colpite così come nella substantia nigra, nello striato e nei nuclei
talamici. A livello della CA1 dell’ippocampo e del subiculum è inoltre presente perdita neuronale che, in condizioni
gravi, può portare a sclerosi ippocampale. A livello subcellulare i neuroni mostrano inclusioni intracitoplasmatiche e
neuriti distrofici. Queste inclusioni sono positive per TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), una proteina legante
RNA che agisce come regolatore dei processi trascrizionali e dei meccanismi di taglio degli esoni (Buratti et al.,
2004;Mercado et al., 2005). In condizioni fisiologiche TDP-43 è localizzata nel nucleo neuronale e delle cellule gliali e
può essere processata da meccanismi proteolitici (Neumann et al., 2006;Neumann et al., 2007). Le forme patologiche
della proteina sono ubiquitinate e iperfosforilate (Eriksen and Mackenzie, 2008).
Sono state identificate mutazioni causative di FTLD-U a carico di diversi geni quali la proteina contenente valosina
(VCP), una ATPasi coinvolta nei meccanismi di degradazione proteica. Inoltre anche mutazioni nel gene della proteina
multivescicolare carica 2B (CHMP2B), una componente del complesso lisosomiale coinvolto nello smistamento e nella
degradazione di diversi classi proteiche. Entrambe le mutazioni a carico di questi due geni danno origine a forme di
FTLD-U attraverso la perdita di funzione dell’allele mutato (Watts et al., 2004;Skibinski et al., 2005). Queste evidenze
suggeriscono che i meccanismi di degradazione proteica possano essere crucialmente implicati nella patogenesi della
FTLD-U. Nel 2006 sono state identificate diverse mutazioni a carico del gene di progranulina (PGRN) che determinano
la perdita di funzione dell’allele mutato e causano una forma di FTLD-U con inclusioni ubiquitina-positive contenenti
la proteina TDP-43 (Baker et al., 2006;Cruts et al., 2006). Ad oggi sono state identificate più di 70 tipi di mutazioni
diverse a carico del gene di PGRN tra cui mutazioni non-senso, di frameshift e nei siti di splicing. Tali mutazioni
causano l’interruzione prematura delle sequenze codificanti mediante la creazione alleli nulli (Mukherjee et al.,
2006;Huey et al., 2006; Gass et al., 2006). Nei pazienti affetti da FTLD-U di natura ereditaria la trasmissione è di tipo
autosomico dominante con penetranza incompleta (Rademakers et al., 2007;Gass et al., 2006). In questo caso, la forma
mutata di mRNA per PGRN viene rapidamente degradata tramite il processo della “nonsense mediated decay”
generando un allele nullo dal punto di vista funzionale (Baker et al., 2006). Solo alcune mutazioni non creano alleli
nulli, ad esempio alcune mutazioni missenso, e sembrano poter portare alla generazione di proteine instabili, non
funzionali o con meccanismi di secrezione alterati (Van der Zee et al., 2007). Nonostante tutti questi studi di genetica,
ad oggi non è ancora stata identificata una correlazione diretta tra genotipo PGRN-mutato e fenotipo FTLD-U (Baker et
al., 2006). Pertanto, la caratterizzazione dei meccanismi molecolari attraverso i quali una perdita di PGRN possa portare
a neurodegenerazione è oggetto di numerosi studi. PGRN è una glicoproteina di 593aa secreta (Songsrirote et al., 2010)
costituita da 7.5 ripetizioni di un modulo di 12 residui cisteinici (Bhandari et al., 1992) chiamato dominio “granulinico”.
Questa specifica sequenza aminoacidica fa si che PGRN possa formare una struttura tridimensionale unica costituita da
4 forcine β grazie a ponti disolfuro. La proteina è presente in molti tessuti tra cui epitelio, midollo osseo, cellule del
sistema immunitario e del sistema nervoso sia in fase di sviluppo che in età adulta (Daniel et al., 2000;Daniel et al.,
2003;Bhandari et al., 1992;Mackenzie et al., 2006;Matsubara et al., 2012) . A livello cerebrale, l’espressione della
proteina è bassa in oligodendrociti e astrociti mentre è elevata nei neuroni e nelle cellule della microglia con un picco di
espressione nei neuroni piramidali e nelle cellule granulari dell’ippocampo, negli strati superficiali della corteccia, nelle
cellule di Purkinje del cervelletto e nei motoneuroni spinali (Ryan et al., 2009;Ahmed et al., 2010;Daniel et al., 2000).
A livello subcellulare PGRN colocalizza con marker per il reticolo endoplasmatico e l’apparato di Golgi nella via
secretoria e con il marker lisosomiale Lamp1 (Almeida et al., 2011;Hu et al., 2010). L’immunoreattività per la proteina
è di tipo granulare e la sua espressione nei neuroni aumenta in modo età dipendente (Petkau et al., 2010). La struttura
della proteina è conservata da un punto di vista evolutivo in diverse specie animali (Kao et al., 2011). Il precursore di
PGRN è una proteina di 68.5 kDa tipicamente secreta in una forma altamente glicosilata del peso molecolare
approssimativo di 88 kDa (De Muynck and Van Damme, 2011). PGRN può essere secreta ed è stata identificata nel
sangue e nel liquido cerebrospinale (Zhou et al., 1993;Van Damme et al., 2008;Ghidoni et al., 2008). Pazienti portatori
di mutazioni per PGRN mostrano livelli sierici della proteina più bassi dei controlli (Sleegers et al., 2009;Finch et al.,
2009). Il taglio della forma matura della proteina a livello delle regioni di giunzione fra i diversi domini granulinici
dopo rilascio da parte di differenti enzimi porta alla formazione di piccoli peptidi di 6-25 kDa biologicamente attivi
chiamati granuline, che corrispondono ai singoli domini (He and Bateman, 2003). Le granuline svolgono ruoli distinti
rispetto alla forma completa della proteina (Plowman et al., 1992;Bateman and Bennett, 2009). PGRN è implicata in
numerose funzioni biologiche tra cui embriogenesi, differenziamento sessuale, crescita e sopravvivenza cellulare,
repressione trascrizionale, tumorigenesi, neovascolarizzazione, infiammazione e riparo di danni tissutali (Eriksen and
Mackenzie, 2008). Inoltre PGRN attiva numerosi cascate di segnali tra cui quelle delle chinasi extracellulari (ERK),
della fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) e di AKT (Zanocco-Marani et al., 1999). La proteina è implicata in numerose
patologie. Infatti un aumento dei livelli di PGRN è stato associato a numerose forme tumorali dato che questa proteina
può funzionare da regolatore autocrino della tumorigenesi ed è altamente espressa in molte linee cellulare di
derivazione tumorale (He and Bateman, 1999;Lu and Serrero, 2000;Davidson et al., 2004). La proteina è risultata
aumentata anche in numerosi patologie neurodegenerative di natura infiammatoria (Wada et al., 2000;Ohmi et al.,
2003;Johnston et al., 2001;Malaspina et al., 2001). E’ stato osservato che mentre alcune granuline agiscono come fattori
pro-infiammatori stimolando l’espressione di citochine pro-infiammatorie quali IL-1β, IL-8 e TNF-α , la forma
completa della proteina è un potente inibitore di TNF-α e promuove la produzione di citochine anti-infiammatorie (IL4, IL-10, IL-5) (Zhu et al., 2002;He et al., 2003;Pickford et al., 2011). La dualità del comportamento di PGRN nella
neurodegenerazione e nella tumorigenesi in base ai suoi livelli, indica che sono necessari fini meccanismi molecolari di
controllo per regolare in modo appropriato l’espressione della proteina. Numerosi composti e fattori genetici sono stati
recentemente identificati coinvolti nella regolazione dell’espressione di PGRN. Tra questi vi sono un inibitore della
istone deacetilasi, il Vorinostat (Cenik et al., 2011), agenti alcalinizzanti e inibitori della ATPasi vacuolare che
incrementano l’espressione di PGRN tramite meccanismi di regolazione posttrascrizionale (Capell et al., 2011). Un
altro punto critico per comprendere le funzioni di PGRN sono i suoi recettori poichè in recenti lavori sono stati
identificati due partner proteici con cui interagisce. La prima proteina presente sulla superficie cellulare in grado di
legare PGRN tramite la sua estremità C-terminale è sortilina (Hu et al., 2010). Sortilina svolge numerose funzioni tra
cui il trafficking lisosomiale (Zeng et al., 2009) e l’induzione di meccanismi apoptotici (Lee et al., 2001). Animali
knockout per sortilina sono normali ma mostrano livelli extracellulari di PGRN elevati (Jansen et al., 2007). Questa
proteina dunque regola i livelli extracellulari di PGRN. In seguito è stata identificata un’altra proteina in grado di legare
PGRN, il recettore per il fattore di necrosi tumorale TNF-α (TNFR). Nel 2011 Tang et al., (Tang et al., 2011) hanno
infatti dimostrato che PGRN lega con alta affinità il TNFR bloccando così il legame di TNF-α. PGRN agirebbe dunque
come un antagonista endogeno di TNFα, infatti in modelli murini di artrite PGRN o l’Attristina (una proteina
ingegnerizzata composta da tre frammenti di PGRN) avevano un effetto terapeutico prevenendo l’infiammazione e
inibendo il signalling intracellulare di TNF-α. L’antagonismo di TNF-α può spiegare alcuni degli effetti pro-tumorali di
PGRN. A differenza degli esempi citati non sono ancora stati identificati recettori cellulari per le granuline. Gli effetti
dell’aploinsufficienza di PGRN sono stati studiati in diversi modelli “in vitro”. Tra gli effetti principali è stata osservata
un aumentata vulnerabilità neuronale a stress eccitotossici e ossidativi. Infatti è stato dimostrato un aumento dei
meccanismi di apoptosi caspasi mediata, ridotta vitalità, maggiore sensibilità a insulti quali deprivazione di ossigeno e
glucosio, perossido di idrogeno, e dosi subletali di NMDA (Guo et al., 2010;Kleinberger et al., 2010). Inoltre, la
riduzione dei livelli di PGRN altera la localizzazione e solubilità di TDP-43 (Guo et al., 2010; Kleinberger et al., 2010)
mentre un suo aumento è correlato alla stimolazione del differenziamento e proliferazione cellulare tramite l’attivazione
della gligeno sintasi chinasi 3β (Gao et al., 2010;Nedachi et al., 2011). Sono stati generati numerosi modelli animali con
genotipo knockout (KO) per PGRN. Il primo topo KO per la proteina con una delezione degli esoni 2-13 mostrava
alterazioni sessuali nei maschi, aggressività e ansietà a tre mesi. A 7 mesi era presente lipofuscinosi, ubiquitinazione e
gliosi (Kayasuga et al., 2007). Il gruppo di Yin ha successivamente generato un topo KO eliminando il promotore e i
primi 4 esoni di PGRN (Yin et al., 2010a). Questi animali mostravano un accumulo età-dipendente di ubiquitina,
vacuolizzazione tissutale, microgliosi e astrogliosi, perdita neuronale, accumulo di forme fosforilate di TDP-43 nel
talamo e nell’ippocampo e una risposta infiammatoria esagerata. Da un punto di vista comportamentale mostravano
depressione, disinibizione, deficit di interazioni sociali, apprendimento spaziale e memoria (Yin et al., 2010b). Un terzo
modello è invece stato prodotto da Petkau et al., (Petkau et al., 2012) e presentava alterazioni della connettività e della
plasticità sinaptica. I dendriti apicali dei neuroni piramidali della regione CA1 erano infatti alterati ed era osservabile
una riduzione delle spine dendritiche rispetto agli animali di controllo. Queste alterazioni erano presenti prima delle
anomalie neuropatologiche che comparivano a 18 mesi di età. Un altro recente modello (Wils et al., 2012) mostrava
invece alterazioni a carico del sistema lisosomiale-autofagico ed era visibile un aumento dell’invecchiamento dei tessuti
neuronali e non neuronali. E’ opportuno sottolineare che esistono differenze significative di tipo biochimico e
patologico tra i modelli animali generati fino ad oggi e i pazienti affetti da FTLD-U associata a mutazioni di PGRN.
PGRN dunque agisce in molteplici processi ma ad oggi la sua funzione a livello del sistema nervoso centrale non è
ancora stata del tutto chiarificata. PGRN ha un effetto positivo sulla crescita e la lunghezza dei neuriti,
sull’arborizzazione neuronale, sul numero di spine dendritiche e sul mantenimento della plasticità sinaptica riscontrati
in studi “in vitro” e “in vivo” (Van Damme et al., 2008; Gao et al., 2010; Ryan et al., 2009; Petkau et al., 2012). PGRN
potrebbe dunque modulare la dinamiche microtubulari interagendo con le proteine associate ai microtubuli e
regolandone l’espressione e la funzionalità. I microtubuli sono elementi del citoscheletro composti da polimeri di α e β
tubulina il cui assemblaggio è fondamentale per la formazione e maturazione di dendriti e assoni (Matus, 1988;Avila,
1990;Ginzburg, 1991). I microtubuli sono coinvolti nella regolazione della forma cellulare, nella distribuzione degli
organelli e nella divisione cellulare. Il citoscheletro neuronale inoltre è una struttura altamente plastica per rispondere
agli stimoli che i neuroni ricevono dall’ambiente circostante e numerosi fattori controllano le dinamiche microtubulari
nei neuroni adulti e in via di sviluppo. Le proteine associate ai microtubuli (MAPs) sono in grado di legare la tubulina.
Questo gruppo eterogeneo di proteine include membri con un espressione legata allo sviluppo e in specifici
compartimenti cellulari (Matus et al., 1988). Inoltre la loro funzionalità può essere regolata tramite modificazioni posttrasduzionali attraverso processi di fosforilazione e defosforilazione (Avila and Diaz-Nido et al., 1991). Quattro
famiglie di MAPs sono state descritte: le MAP-1, MAP-2, MAP-3/4 e TAU. La classe MAP-2 che comprende MAP2A,B,C,D svolge un ruolo essenziale nella crescita dei processi neuronali che è stato dimostrato tramite l’utilizzo di
oligonucleotidi antisenso in diversi modelli in vitro (Dinsmore and Solomon, 1991). MAP-2 colocalizza nei microtubuli
con l’actina ed è associata ai microfilamenti, a membrane di organelli cellulari e alle densità post-sinaptiche nelle spine
dendritiche (Caceres et al., 1983;Morales and Fifkova, 1989). Le MAP-2 sono substrati per numerose chinasi e fosfatasi
(Avila et al., 1994). L’attività di queste proteine può essere dunque modulata in risposta ad una serie di stimoli
extracellulari che regolandone la funzionalità possono indurre cambiamenti nell’organizzazione dei microtubuli.
Il glutammato è il neurotrasmettitore eccitatorio più importante del sistema nervoso centrale ed è stato dimostrato essere
coinvolto in numerosi processi quali sviluppo neuronale, neurotossicità e plasticità neuronale. I recettori per il
glutammato, ionotropi e metabotrobi, sono distribuiti in modo differente in siti presinaptici e post sinaptici per
contribuire alla comunicazione neuronale e a funzioni quali apprendimento e memoria (Storm-Mathisen et al., 1983). I
recettori NMDA sono i principali recettori coinvolti in questi processi. Questi recettori sono costituiti da subunità
riarrangiate in diverse combinazioni a formare dei canali ionici ionotropi permeabili a ioni Ca2+, Na+ e K+ . Queste
subunità formano una struttura pentamerica grazie alla combinazione NR1 con NR2A-D e NR3A-B. I recettori NMDA
funzionali sono eteromeri e hanno una distribuzione eterogenea con alti livelli nell’ippocampo, talamo e corteccia
mentre bassi livelli sono stati identificati nei gangli della base e cervelletto. L’espressione di questi recettori a livello
della CA1,CA3 e subicolo cala con l’età in modelli murini (Wenk and Barnes, 2000;Clark et al., 1992) e anche pazienti
affetti da AD mostrano un ridotto legame di glutammato (Greenamyre et al., 1987) e NMDA nell’ippocampo (Ulas et
al., 1992). Questa diminuzione potrebbe essere responsabile del declino di memoria osservato durante
l’invecchiamento. Inoltre una riduzione dei livelli di NMDA potrebbe essere un meccanismo protettivo per prevenire
fenomeni di overstimolazione ed eccitotossicità. I meccanismi di eccitotossicità coinvolgono un eccessivo influsso di
Ca2+ e il suo rilascio dalle riserve intracellulari, produzione di radicali reattivi dell’ossigeno e attivazione dei
meccanismi apoptotici. La cascata eccitotossica inizia a livello delle densità postsinaptiche e può causare degenerazione
o plasticità di queste sinapsi. Infatti i processi apoptotici svolgono un ruolo importante nel rimodellamento e plasticità
strutturale delle sinapsi (Gilman and Mattson, 2002). Infine il segnale eccitotossico può propagarsi dalle terminazioni al
soma neuronale provocando morte cellulare. Dunque una stimolazione fisiologica è cruciale per stabilire circuiti
neuronali funzionanti, plasticità sinaptica, memoria e apprendimento ma se diventa eccessiva è controproducente in
neuroni maturi. Numerosi risultati presenti in letteratura suggeriscono che PGRN possa giocare un ruolo nei processi di
plasticità sinaptica che sono principalmente regolati dai recettori NMDA. PGRN potrebbe pertanto interagire con i
recettori NMDA e modularli.
2. SCOPO DEL LAVORO
L’obiettivo principale di questo lavoro è stato lo studio dei meccanismi molecolari attraverso cui la perdita di funzione
di PGRN può portare a vulnerabilità neuronale. Al fine di raggiungere questo obiettivo sono state sviluppate colture
neuronali primarie da poter utilizzare come piattaforme sperimentale su cui eseguire degli esperimenti di RNA
interference per creare un modello che riproduca “in vitro” le alterazioni correlate ad aploinsufficienza di PGRN.
In particolare i fini specifici di questo studio sono stati:
⋅ Sviluppare e ottimizzare colture neuronali primarie corticali e ippocampali di topi neonati C57BL/6J per usarle
come piattaforma per studiare l’espressione e la localizzazione di PGRN;
⋅ Caratterizzare il pattern di espressione della proteina nei nostri modelli “in vitro”;
⋅ Usare le colture primarie sviluppate per testare quattro diverse sequenze di RNA silenzianti (siRNA) per
PGRN in modo da identificare la sequenza che induce un silenziamento del 60% (che riproduce la riduzione
della proteina osservabile in caso di aploinsufficienza) e valutarne la tossicità;
⋅ Studiare il coinvolgimento di PGRN nella modulazione dei livelli di espressione delle subunità NR1 e NR2 del
recettore NMDA;
⋅ Valutare gli effetti dell’aploinsufficienza di PGRN sulle dinamiche microtubulari studiando in particolare
l’espressione e la localizzazione di MAP-2;
⋅ Caratterizzare l’espressione basale di PGRN in diverse aree cerebrali di topi C57BL/6J coinvolte nella
patofisiologia della FTLD-U, quali corteccia e ippocampo, durante lo sviluppo cerebrale e in età adulta.
3. MATERIALI E METODI
3.1 ANIMALI DA ESPERIMENTO
Sia per la preparazione delle colture neuronali primarie che per gli esperimenti di caratterizzazione dell’espressione
cerebrale di PGRN nel cervello adulto sono stati utilizzati topi del ceppo C57BL/6J. I topi sono stati stabulati presso lo
stabulario della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università degli Studi di Brescia. Gli animali sono stati mantenuti
in gabbie di plexiglas dove avevano libero accesso ad acqua e cibo e venivano sottoposti ad un ciclo luce/oscurità di 12
h e ad una temperatura costante di 23°C. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in accordo con le linee guida del
European Community’s Council for Animal Experiments (DL 116/92) e adottando ogni accorgimento per rendere nulla
o minima la sofferenza animale.
3.2 COLTURE NEURONALI PRIMARIE
Le colture neuronali primarie sono state preparate mediante dissezione dell’encefalo di topi C57BL/6J neonati al giorno
0. In breve, i topi neonati sono stati decapitati, il cranio passato velocemente in etanolo 70% e poi mantenuti in
soluzione Dulbecco Phosphate’s Buffered Saline (D-PBS)(Sigma-Aldrich, Milano, Italia) posta su ghiaccio. I singoli
cervelli sono stati trasferiti in piastre Petri da 3 cm Ø con soluzione D-PBS ghiacciata dove è stata svolta la dissezione
della corteccia e dell’ippocampo. Le diverse porzioni sono state raccolte in terreno di coltura completo posto su
ghiaccio composto da Neurobasal-A medium (Gibco, Milano, Italia), Penicillina/Streptomicina 100X, glutammina (0.5
mM) e B27 (50X). Il tessuto è stato raccolto in provette falcon da 15ml contenente 5 ml di terreno di coltura scaldato a
37°C. Le cellule sono state poi dissociate meccanicamente e centrifugate a 800 x g. La conta cellulare e il saggio della
vitalità sono stati eseguiti utilizzando il colorante Trypan Blue che permette di escludere la conta delle cellule morte
(Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Per i protocolli di immunocitochimica (ICC) e western blotting (WB) le cellule sono
state coltivate rispettivamente in piastre multi pozzetto da 24 su vetrini con coating di Poly-D-lisina (14 µg/mL)
(Sigma-Aldrich, Milano, Italia) (70000 cellule/vetrino) o in piastre Petri da 3 cm Ø con coating di Poly-D-lisina (10
µg/mL) (800000 cellule/piastra). Le cellule sono state mantenute ad una temperatura di 37°C in un’atmosfera
contenente dal 5% CO2 e 95% O2 in terreno completo per 11 giorni in vitro (DIV11).
3.3 SILENZIAMENTO GENICO
Per eseguire gli esperimenti di RNA interference i neuroni ippocampali e corticali sono stati piastrati in dish da 3 cm Ø
e sottoposti a silenziamento genico al DIV7 tramite l’utilizzo di 4 diversi siRNA (Dharmacon, Chicago, USA). In ogni
esperimento è stato inoltre utilizzata una sequenza di RNA non silenziante, detta sequenza scramble (SCR) come
controllo negativo. I siRNA e lo SCR sono stati risospesi in H2O RNAsi free (20µM concentrazione finale) e agitati per
30 min a temperatura ambiente (R.T.). La concentrazione dei siRNA e la loro purezza è stata saggiata grazie alla misura
della loro assorbanza a 260 nm. Tutte le sequenze di siRNA sono state testate a diverse concentrazioni per identificare i
parametri sperimentali più opportuni per limitare i fenomeni di tossicità e ottenere contemporaneamente un
silenziamento genico elevato. I risultati ottenuti ci hanno portato a determinare che la concentrazione ottimale di siRNA
da utilizzare per i nostri esperimenti era di 25 nM (dati non mostrati). In breve, i siRNA sono stati diluiti in Optimem
(Gibco, Milano, Italia) fino alla concentrazione desiderata. In seguito è stato aggiunto INTERFERin (Polyplustransfection, Illkirch, Francia) alle concentrazioni indicate dalla casa produttrice che sono state stimate in rapporto al
volume totale di terreno usato in pozzetto e in dish da 3 cm Ø. La mix ottenuta è stata immediatamente vortexata per 10
sec e incubata per 10 min a R.T. . Nel frattempo il terreno delle cellule è stato parzialmente sostituito con terreno fresco
e dei quantitativi standard della suddetta mix sono stati aggiunti in dish o pozzetto secondo le istruzioni della casa
produttrice. Dopo 4 h di incubazione il terreno è stato parzialmente sostituito con terreno fresco per limitare i fenomeni
di tossicità. Gli effetti del silenziamento genico sull’espressione proteica sono stati saggiati dopo 96 h di trattamento
tramite WB e ICC.
3.4 SAGGIO DI CITOTOSSICITÀ CON IL METODO LDH
Il saggio della lattato-deidrogenasi (LDH) è un test colorimetrico utilizzato per la misura della citotossicità. Esso è
basato sulla misura quantitativa dell’enzima LDH rilasciato in seguito alla lisi della membrana plasmatica conseguente
alla morte cellulare. La reazione di ossidazione di questo enzima produce NADH che viene fatto reagire in vitro con un
sale di tetrazolio per formare un prodotto colorato, un sale di formazano rosso, misurabile allo spettrofotometro.
Abbiamo utilizzato il saggio LDH “in vitro” Toxicology Assay Kit, Lactic Dehydrogenase based (Sigma-Aldrich,
Milano, Italia) che permette di valutare i livelli rilasciati nel terreno di lattato deidrogenasi. In breve, il terreno dei
neuroni di controllo e sottoposti a silenziamento con siRNA o sequenza SCR è stato prelevato e centrifugato 4 min a
250 x g per eliminare i detriti cellulari. Un’aliquota di terreno è stata incubata con la Lactate Dehydrogenase Assay
Mixture composta in equa misura da LDH Assay Dye Solution, LDH Assay Substrate Solution e LDH Assay Cofactor
Preparation. La soluzione è stata aggiunta in un rapporto 2:1 al volume di terreno da saggiare. La reazione è stata
incubata al buio a R.T. per 20 min. In seguito è stata interrotta con l’aggiunta di HCl 1N. Il risultato è stato letto allo
spettrofotometro misurando l’assorbanza a 490 nm e sottraendo quella a 600 nm. I valori di assorbanza misurati sono
stati espressi in % quale indice del quantitativo di LDH rilasciato.
3.5 ICC
Al termine degli esperimenti le cellule sono state fissate grazie all’incubazione per 15 min in 4% paraformaldeide/3%
saccarosio preparato in tampone fosfato salino (PBS) 1M pH 7.4 e poi conservate in PBS contenente 0.05% di NaAzide. I vetrini venivano incubati per 10 min in una soluzione permeabilizzante contenente metanolo al 20% e in
seguito incubati per 30 min a R.T. in soluzione di blocco composta da 3% di albumina serica bovina (BSA) più 2%
Normal Goat Serum (NGS) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) in PBS 1M +TritonX-100 0.1%. I vetrini sono stati
mantenuti O.N. a 4°C con l’anticorpo primario opportunamente diluito in soluzione di blocco. Il giorno seguente le
cellule sono state incubate per 1 h a R.T. con l’anticorpo secondario fluorescente diluito alla concentrazione ottimale in
PBS 1M + TritonX-100 0,1% con l’aggiunta di 1% di BSA. Per i protocolli di doppia marcatura alla fine di questa
incubazione le cellule sono sottoposte ad un altro ciclo di marcatura con un ulteriore anticorpo primario. I nuclei
cellulari sono stati infine contro colorati con HOECHST 2495 (Sigma Aldrich, Milano, Italia). I vetrini sono stati infine
montati su vetrini coprioggetto mediante l’utilizzo del montante specifico per fluorescenza vectashield (VECTOR
Laboratories, Burlingame, CA, USA).
3.6 IHC
Per eseguire gli esperimenti di immunoistochimica (IHC) gli animali sono stati anestetizzati con cloralio idrato (350
mg/kg, i.p) e successivamente perfusi per via transcardiaca con paraformaldeide fredda al 4% in 0.15 M di PBS pH 7.4.
I cervelli sono stati successivamente rimossi, postfissati per 4 h nella medesima soluzione e infine posti in una soluzione
contenente 18% di saccarosio per la criopreservazione. Il giorno dopo i cervelli sono stati congelati a -20°C e sono state
tagliate sezioni coronali di 30 μm di spessore con l’utilizzo di un criostato (Leica). Queste sono state conservate a 20°C in una soluzione contenete glicerolo al 60% (Sigma-Aldrich) in PBS 1M. Per eseguire gli esperimenti di IHC con
metodo “free floating”, le sezioni dopo essere state lavate in una soluzione di PBS 1M contenente lo 0,3%Triton X-100
sono state incubate per 30 min in una soluzione permeabilizzante composta da PBS 1M contenente metanolo al 20%. In
seguito le sezioni sono state trattate per 30 min a R.T. in una soluzione di blocco contenente 3% BSA più 2% NGS PBS
1M + Triton X-100 0,3% e poi incubate O.N. alla temperatura di 4°C con gli specifici anticorpi primari diluiti sempre in
soluzione di blocco. Il giorno successivo, dopo i lavaggi in PBS 1M + Triton X-100 0,3%, le sezioni venivano incubate
per 1 h a R.T. con gli anticorpi secondari opportuni diluiti in PBS 1M + Triton X-100 al 0,3% contenente BSA (1
mg/ml). Per i protocolli di doppia marcatura le sezioni sono state sottoposte ad un secondo ciclo di colorazione. Dopo
un ulteriore lavaggio con PBS, le fettine venivano lavate in H2O e incubate con HOECHST 2495 per marcare i nuclei
cellulari (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Infine le sezioni sono state montate su vetrino e coperte con coprioggetto
mediante l’utilizzo del montante vectashield (VECTOR Laboratories, Burlingame, CA, USA).
3.7 MICROSCOPIA IN FLUORESCENZA E MICROSCOPIA CONFOCALE
I preparati derivati dagli esperimenti di ICC e IHC sono stati montati su vetrino e osservati tramite un microscopio a
epifluorescenza (Olympus IX50, Olympus, Milano, Italia) o di un microscopio confocale Zeiss (Carl Zeiss S.p.a.,
Milano, Italia) con il laser settato sulle lunghezze d’onda 405-488-543 e l’altezza delle immagini acquisite fissata su
1μm. Le immagini ottenute sono state poi analizzate con l’utilizzo dei programmi LSM Image Examiner (Carl Zeiss
S.p.a.,Milano, Italia), Image J (NIH, USA) e Adobe Photoshop 7.0 (Adobe system, Montain View, CA, USA).
3.8 ANTICORPI
PGRN è stata visualizzata usando l’anticorpo policlonale prodotto in pecora (R&D System, Minneapolis, MN, USA).
Gli anticorpi policlonali anti-GAD-65 (Millipore, Billerica, MA, USA), anti-GFAP (DAKO, Glostrup, DK), anti-MAP2 (Chemicon International, Temecula, CA, USA) e anti-CD11b (AbD serotec, Kidlington, UK)) sono stati utilizzati per
visualizzare rispettivamente l’isoforma 65 della glutammato decarbossilasi, la proteina gliofibrillare acida, la proteina
MAP-2 e per identificare cellule microgliali. L’anticorpo monoclonale per NeuN (Millipore, Billerica, MA, USA) è
stato usato per visualizzare i nuclei neuronali. Gli anticorpi anti-GAPDH (Millipore, Billerica, MA, USA), anti-αtubulina (α-tub) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e anti-proteina precursore dell’amiloide (APP) (Chemicon
International, Temecula, CA, USA) sono stati usati per normalizzare le quantità ottenute negli esperimenti di WB. Gli
anticorpi secondari utilizzati negli sperimenti di IHC e ICC sono anti-mouse coniugato con Cy3 (Jackson
ImmunoResearch, Baltimore, USA), anti-rabbit coniugato con fluoresceina FITC o Cy3 (Jackson ImmunoResearch,
Baltimore, USA) o anti-sheep coniugato a ALEXA 488 (Molecular probes, Eugene, OR, USA). Per analisi di WB sono
stati utilizzati secondari anti-mouse, anti-rabbit (Santa Cruz Biotecnology, Santa Cruz, CA, USA) e anti-sheep
(Southern Biotech, Birminghan, AL, USA) coniugati HRP.
3.9 ANALISI DI SHOLL
Mediante l’utilizzo del programma ImageJ (NIH, USA) è stata svolta l’analisi dell’arborizzazione neuronale. In seguito
a ICC per MAP-2, i neuroni sono stati valutati singolarmente mediante l’utilizzo di cerchi concentrici posti ad una
distanza crescente dal centro del soma con un intervallo fisso di 30 µm. Le intersezioni dei processi neuronali con le
circonferenze sono state contate manualmente. I dati ottenuti sono stati in seguito analizzati tramite il programma
GraphPad Prism 4 e sono stati ricavati i grafici relativi ai neuroni di controllo e silenziati.
3.10 WESTERN BLOTTING
Per estrarre le proteine di interesse le cellule o tessuti sono state lisate usando RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4,
150 mM NaCl, 0.5% Na deossicolato, 0.1% Na dodecilsolfato, 2 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 1 mM N-ethylmaleimide,
Na Ortovanadato 1 mM, 1% Nonidet P40, NaF 1 mM più un mix completo di inibitori delle proteasi (Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany)). La concentrazione proteica dei campioni è stata misurata grazie alla metodica di
Bradford (Pierce, Rockford, IL, USA). Uguali quantità di proteine (30 μg) sono state caricate e corse su un gel 4-12%
Nu-PAGE Novex Bis-Tris (Invitrogen, Milano, Italia). L’analisi densitometrica delle bande è stata eseguita grazie al
software Gel Pro Analyzer versione 6.0 (MediaCybernetics, Bethesda, MD, U.S.A.). Tutte le bande ottenute sono state
normalizzate utilizzando α-tub, GAPDH o APP come controllo del caricamento di una uguale quantità di campioni.
3.11 ANALISI STATISTICA DEI DATI
Per svolgere l’analisi statistica dei vari esperimenti svolti sono stati utilizzati diversi approcci quali: l’analisi della
varianza (ANOVA) ad una via seguita dal test di postcomparazione multipla di Bonferroni, T-test di Student, ANOVA
a due vie seguita dal test di postcomparazione multipla di Bonferroni.
4. RISULTATI
4.1 CARATTERIZZAZIONE DELLE COLTURE NEURONALI
Le colture neuronali sviluppate nel nostro laboratorio sono state caratterizzate valutando l’espressione di vari marcatori
in esperimenti di ICC in fluorescenza (FIG.1). In particolare le cellule neuronali sono state identificate grazie al
marcatore specifico NeuN che permette la visualizzazione del nucleo neuronale. Tramite l’utilizzo dell’anticorpo antiGFAP è stato possibile identificare la percentuale di cellule astrocitarie che era presente nelle due tipologie di colture
che era del 12% nelle colture corticali e del 5 % nelle colture ippocampali. I neuroni GABAergici sono stati identificati
grazie all’anticorpo specifico per GAD-65 e costituivano il 62% dei neuroni presenti nelle colture corticali e il 52% in
quelle ippocampali. Le nostre colture mostravano dunque una popolazione arricchita in neuroni di diverse tipologie, tra
cui GABAergici, con una bassa percentuale di cellule astrocitarie. I neuroni ottenuti presentavano una morfologia
complessa tipica di questa classe di cellule e indicativa di buoni parametri di coltura che garantiscono la sopravvivenza
e la funzionalità dei neuroni piastrati. Infatti non si osservava la presenza di neuroni sofferenti o in fase di
degenerazione. Queste evidenze indicano che il protocollo di dissezione, messa in coltura e mantenimento generato nel
nostro laboratorio rappresentavano perciò un buon metodo per ottenere colture di neuroni corticali e ippocampali da
poter utilizzare nelle fasi successive del progetto.
FIG.1
A. Colture primarie di neuroni corticali DIV11 da topi neonati p0. Singola marcatura in fluorescenza per i
marcatori NeuN, GAD-65 e GFAP.
B. Colture primarie di neuroni ippocampali DIV11 da topi neonati p0. Singola marcatura in fluorescenza per i
marcatori NeuN, GAD-65 e GFAP.
Barra di calibrazione: (NeuN)= 50 µm; (GAD-65 e GFAP)= 100 µm
4.2 ANALISI DELL’ESPRESSIONE E DELLA LOCALIZZAZIONE DI PGRN
L’espressione di PGRN è stata valutata mediante esperimenti di WB che hanno dimostrato che i livelli di PGRN erano
più elevati nelle colture corticali rispetto a quelle ippocampali (** P<0.05 Student’s t-test) come mostrato in figura
(FIG.2).
FIG.2
A. WB per PGRN in estratti proteici di neuroni corticali (CX) e ippocampali (IPP) al DIV11. L’immunoblotting
per α-tub è riportato come controllo per un uguale caricamento dei campioni.
B. In grafico sono rappresentati i livelli medi di PGRN, si noti che i livelli della proteina sono significativamente
superiori nei neuroni corticali rispetto a quelli ippocampali (** P<0.05 Student’s t-test)
Gli studi di ICC hanno permesso di osservare che PGRN era presente principalmente nei neuroni sia nelle colture
cellulari primarie di neuroni corticali che in quelle ippocampali, (FIG.3). Inoltre, PGRN non era ristretta ai neuroni
gabaergici GAD-65-immunopositivi (FIG.3) ad indicare che PGRN era presente in diverse sottopopolazioni neuronali.
Usando protocolli di doppia marcatura in fluorescenza per PGRN e MAP-2 è stato possibile caratterizzare in modo più
approfondito l’espressione della proteina a livello subcellulare. Infatti marcando il citoscheletro neuronale è stato
possibile determinare che PGRN era espressa maggiormente a livello del soma rispetto ai processi dove
l’immunoreattività per la proteina era inferiore (FIG.3). L’andamento di espressione e di localizzazione era simile sia
nei neuroni corticali che ippocampali. I dati di WB e ICC indicano pertanto che le nostre colture rappresentavano un
buona piattaforma per lo studio di PGRN e degli effetti del suo silenziamento.
FIG.3
A. Doppia marcatura in fluorescenza per PGRN in associazione a diverse proteine (NeuN, GAD-65, MAP-2) in
neuroni ippocampali DIV11 da topi neonati p0. Barra di calibrazione: (PGRN+GAD-65/NeuN)= 100 µm ;
(PGRN+MAP-2)= 50 µm.
B. Doppia marcatura in fluorescenza per PGRN in associazione a diverse proteine (NeuN, GAD-65, MAP-2) in
neuroni corticali DIV11 da topi neonati p0. Barra di calibrazione: (PGRN+NeuN)= 100 µm ; (PGRN+GAD65/MAP-2)= 50 µm.
4.3 LA SEQUENZA siRNA N°4 RIDUCEVA L’ESPRESSIONE DI PGRN DEL 60% SENZA INDURRE EFFETTI
TOSSICI SUI NEURONI
Sono state testate quattro diverse sequenze siRNA silenzianti alla concentrazione di 25 nM per PGRN nelle colture di
neuroni corticali e tramite esperimenti di WB è stato possibile determinare che la sequenza che induceva un riduzione
statisticamente significativa dei livelli di proteina era la numero 4 (J-062134-12: GGCCUAGAAUAACGAGCCA)
dopo 96 h di incubazione (-60%, *** P<0.001 ANOVA una via + Bonferroni post-test) (FIG.4A). La stessa sequenza
con i medesimi parametri sperimentali (25 nM di siRNA per 96 h di incubazione) riduceva i livelli di PGRN anche nei
neuroni ippocampali (-50%, ** P<0.01 ANOVA una via + Bonferroni post-test) (FIG.4B). Il silenziamento di PGRN
era specifico e non dovuto ad un effetto secondario dell’INTERFERin, in quanto il trattamento con la sequenza SCR
non era associato ad alterazioni dei livelli di proteina nei neuroni corticali ed ippocampali.
FIG.4
A. WB relativo ai livelli di PGRN in neuroni corticali di controllo (CTR), trattati con la sequenza SCR (SCR) e
con le diverse sequenze silenzianti alla concentrazione di 25 nM per 96 h. In grafico sono riportati i livelli
medi percentuali di PGRN ed è possibile notare come la sequenza siRNA 4 induceva una riduzione
statisticamente significativa del 60% dei livelli della proteina (*** P<0.001 ANOVA ad una via + Bonferroni
post test).
B. WB relativo ai livelli di PGRN in neuroni ippocampali di controllo (CTR), trattati con la sequenza SCR (SCR)
e con la sequenza silenziante siRNA 4 alla concentrazione di 25 nM per 96 h. In grafico sono riportati i livelli
medi percentuali di PGRN ed è possibile notare come, anche in questo caso, la sequenza siRNA 4 induceva
una riduzione statisticamente significativa del 50% dei livelli della proteina (** P<0.01 ANOVA ad una via +
Bonferroni post test).
L’immunoblotting per GAPDH è riportato come controllo per un uguale caricamento dei campioni.
Gli studi di ICC hanno confermato i risultati ottenuti dagli esperimenti di WB in neuroni corticali. Il trattamento con la
sequenza siRNA 4 ma non con gli altri siRNA testati o lo SCR induceva una riduzione dell’immunoreattività per
PGRN rispetto ai neuroni di controllo (FIG.5).
FIG.5
Singola marcatura in fluorescenza per PGRN in neuroni corticali di controllo (CTR), trattati con la sequenza SCR
(SCR) e con le diverse sequenze silenzianti alla concentrazione di 25 nM per 96 h. L’immunoreattività per la proteina
era fortemente ridotta nei neuroni incubati con la sequenza siRNA 4. Barra di calibrazione: (PGRN)= 50 µm.
Per valutare la tossicità indotta dal silenziamento e verificare se la riduzione osservata potesse essere attribuita a un
effetto secondario associato a perdita neuronale è stato saggiato il rilascio di LDH nel terreno di coltura, indice di danni
a livello della membrana plasmatica. L’analisi dei terreni relativi ai diversi trattamenti mostrava che l’incubazione con
le sequenze siRNA silenzianti e lo SCR non induceva differenze statisticamente significative nel rilascio di LDH
(FIG.6).
FIG.6
Grafico relativo al rilascio di LDH nei terreni di neuroni corticali di controllo (CTR), trattati con la sequenza SCR
(SCR) e con le diverse sequenze silenzianti alla concentrazione di 25 nM per 96 h. Non era visibile alcuna differenza
statisticamente significativa tra i neuroni trattati e quelli di controllo perciò il silenziamento non era tossico.
4.4 IL SILENZIAMENTO DI PGRN RIDUCEVA I LIVELLI DELLE SUBUNITÀ NR1 E NR2B DEL
RECETTORE NMDA
Abbiamo voluto valutare se il silenziamento genico di PGRN fosse in grado di indurre una riduzione dei livelli di
espressione di un recettore canale che è essenziale per il controllo dell’eccitabilità neuronale nonché dei meccanismi di
plasticità sinaptica. Sono stati valutati i livelli basali delle due subunità NR1 e NR2B. Quest’ultima isoforma delle
subunità NR2 è quella che è maggiormente espressa a livello dei neuroni corticali e ippocampali in via di sviluppo
(Nagy et al., 2003). I nostri studi hanno dimostrato che i livelli di espressione della subunità NR1 erano
significativamente più elevati (* P< 0.05 Student’s t-test) nelle colture corticali rispetto quelle ippocampali. Anche i
livelli della subunità NR2B erano maggiori in maniera statisticamente significativa (** P<0.05 Student’s t-test) nelle
colture di neuroni corticali rispetto a quanto si osservava nelle colture ippocampali (FIG.7).
FIG.7
WB per le subunità NR1 e NR2B in estratti proteici di neuroni corticali (CX) e ippocampali (IPP) al DIV11.
L’immunoblotting per GAPDH è riportato come controllo per un uguale caricamento dei campioni. In grafico sono
rappresentati i livelli medi delle due proteine, si noti che i livelli di entrambe sono significativamente superiori nei
neuroni corticali rispetto a quelli ippocampali (** P<0.05 Student’s t-test per NR2B e * P<0.05 Student’s t-test per
NR1)
Poichè queste ultime osservazioni indicavano una maggiore espressione delle subunità NR1 e NR2B nei neuroni
corticali abbiamo deciso di utilizzare queste cellule per svolgere gli esperimenti preliminari degli effetti del
silenziamento sulla loro espressione. Abbiamo osservato che il trattamento con la sequenza siRNA 4 induceva una
riduzione statisticamente significativa dei livelli di espressione delle subunità NR1 (** P<0.01 ANOVA una via +
Bonferroni post-test) e NR2B (** P<0.05 ANOVA una via + Bonferroni post-test). Il trattamento con la sequenza SCR
di controllo non induceva invece alcuna riduzione di espressione statisticamente significativa (FIG.8).
FIG.8
WB relativo alle subunità NR1 e NR2B in neuroni corticali di controllo (CTR), trattati con la sequenza SCR (SCR) e
con la sequenza silenziante siRNA 4. In grafico sono riportati i livelli medi percentuali di NR1 (** P<0.01 ANOVA ad
una via + Bonferroni post test) e NR2B (** P<0.05 ANOVA ad una via + Bonferroni post test). La sequenza siRNA 4
induceva una riduzione statisticamente significativa dei livelli di espressione delle due proteine. L’immunoblotting per
APP è stato riportato come controllo per un uguale caricamento dei campioni.
4.5 IL SILENZIAMENTO DI PGRN ALTERAVA L’ESPRESSIONE E LA LOCALIZZAZIONE DI MAP-2
Il silenziamento di PGRN tramite l’utilizzo della sequenza siRNA 4 modificava l’assetto microtubulare dei neuroni
corticali come mostrato dagli esperimenti di ICC in doppia marcatura per PGRN e MAP-2. Infatti l’espressione di
MAP-2 era fortemente ridotta ed alterata nei neuroni silenziati ed erano visibili segni di degenerazione neuronale
(FIG.9A). Grazie all’analisi di sholl sono state contate manualmente le intersezioni dei processi neuronali con le
circonferenze poste a distanza crescente costante (30µm) dal soma. I dati ottenuti sono stati utilizzati per svolgere
l’analisi statistica ed è stata dimostrata una riduzione statisticamente significativa dell’arborizzazione dendritica nei
neuroni sottoposti a silenziamento rispetto ai controlli (FIG.9B). Infatti i neuroni silenziati avevano un numero inferiore
di processi sia in prossimità del soma sia a distanze più elevate indice di una arborizzazione dendritica inferiore. Perciò
una diminuzione dei livelli di PGRN modificava la localizzazione, l’espressione di MAP-2 e l’assetto dei processi
neuronali.
FIG.9
A. Doppia marcatura in fluorescenza per PGRN e MAP-2 in neuroni corticali di controllo (CTR) e sottoposti a
silenziamento con la sequenza siRNA 4. L’ultimo pannello di immagini è un ingrandimento. Barra di
calibrazione: (MAP-2)= 70 µm; (MAP-2 nella magnificazione)= 30µm.
B. Grafico relativo alla conta manuale dei processi neuronali intersecanti le circonferenze poste a distanza
crescente costante dal soma. Si noti che per ogni distanza valutata la differenza fra neuroni corticali di
controllo e silenziati era statisticamente significativa (*** P<0.001 ANOVA a due vie + Bonferroni post-test).
4.6 ESPRESSIONE E LOCALIZZAZIONE DI PGRN IN TOPI C57BL/6J DALLA NASCITÀ ALL’ETÀ ADULTA
Abbiamo caratterizzato i livelli di espressione di PGRN mediante esperimenti di WB in diverse aree cerebrali di topi
C57BL/6J di 4 mesi. I livelli di proteina erano elevati in aree cerebrali quali la substantia nigra, la corteccia e
l’ippocampo mentre erano più bassi nello striato (FIG.10A). Nonostante anche modificazioni a livelli dei gangli della
base e della substantia nigra siano state associate all’insorgenza di un fenotipo motorio in pazienti affetti da FTLD-U le
aree cerebrali maggiormente coinvolte da alterazioni istopatologiche, perdita neuronale e atrofia cerebrale che
sottendono all’insorgenza dei tipici sintomi di natura cognitiva che caratterizzano il fenotipo FTLD-U sono la corteccia
e l’ippocampo. Abbiamo pertanto approfondito le nostre indagini sulla caratterizzazione dell’espressione neuronale di
PGRN a livello cerebrale focalizzandoci su queste due ultime aree cerebrali .
In particolare mediante studi di WB abbiamo potuto osservare che l’espressione di PGRN nella corteccia e
nell’ippocampo variava durante lo sviluppo. Infatti, analizzando campioni di topi neonati (p0), di 1, 8 e 12 mesi è stato
possibile determinare che la proteina nelle prime fasi di sviluppo cerebrale era maggiormente espressa nella sua forma
immatura di 62 kDa mentre con il procedere dello sviluppo si assisteva ad uno shift di peso molecolare dovuto alla
massiccia glicosilazione che la proteina subisce durante la sua maturazione per cui PGRN migrava a 88 kDa. Questo
processo era visibile sia in estratti proteici di corteccia che di ippocampo a suggerire che gli stessi meccanismi di
maturazione della proteina sono presenti entrambe le aree (FIG.10B).
FIG.10
A. WB per PGRN in diverse aree cerebrali di topi C57BL/6J di 4 mesi. In grafico sono riportati i livelli medi di
proteina. L’immunoblotting per α-tub è riportato come controllo per un uguale caricamento dei campioni
B. WB per PGRN in estratti proteici di corteccia (CX) e ippocampo (IPP) di topi neonati (P0), di 1 mese (1 MO),
8 mesi (8 MO) e 12 mesi (12 MO). L’immunoblotting per GAPDH è riportato come controllo per un uguale
caricamento dei campioni. Nei due grafici sono riportati i livelli medi delle due forme di PGRN (62 kDa e 88
kDa) in riferimento alle età analizzate. Si noti come nei topi neonati il livello di espressione della forma
immatura di PGRN (62 kDa) sia elevato mentre in età avanzate aumenti l’espressione della forma di 88 kDa.
Tramite esperimenti di IHC è stata valutata l’espressione e la localizzazione della proteina in sezioni coronali di topi
C57BL/6J di 4 mesi. La proteina era presente a livelli elevati nei neuroni piramidali degli strati superficiali della
corteccia e la marcatura presentava una distribuzione di tipo granulare. Come precedentemente osservato nel caso delle
colture primarie, PGRN era localizzata principalmente a livello del soma e i processi erano solo parzialmente
immunoreattivi. Grazie al marker Cd11b abbiamo identificato la presenza di una scarsa immunoreattività per PGRN in
cellule microgliali (FIG.11).
FIG.11
Doppia marcatura in fluorescenza per PGRN in associazione con NeuN e CD11b. L’immunoreattività per PGRN era di
tipo granulare e maggiormente presente a livello del soma neuronale. Invece la proteina non era espressa ad alti livelli
nelle cellule microgliali. Barra di calibrazione: (PGRN)= 100 µm.
Gli studi di ICC in fluorescenza su sezioni ippocampali di topi C57BL/6J alle diverse età hanno invece dimostrato che
nei topi neonati erano presenti pochi neuroni fortemente positivi per PGRN ma a livello globale l’espressione della
proteina era bassa. Questi neuroni fortemente positivi erano visibili anche a 1 e 3 mesi di età dove l’espressione di
PGRN era aumenta anche a livello della CA3. Cellule immunoreattive erano presenti anche a livello del giro dentato
dove proiettavano allo strato granulare. Grazie ad una serie di scatti sequenziali tramite microscopia confocale è stata
ricostruita l’intera struttura dell’ippocampo di animali di 4 mesi. Come si può notare PGRN era espressa maggiormente
a livello dell’area CA3 e a livelli più bassi nel resto dell’ippocampo. In animali adulti di 12 mesi PGRN era espressa ad
alti livelli non solo nei neuroni ma anche in astrociti come mostrati di IHC in doppia marcatura per PGRN e GFAP.
L’espressione della proteina perciò aumentava in modo età dipendente a livello dei neuroni mentre in cellule microgliali
e astrociti era presente solo in fasi tardive dello sviluppo (FIG.12).
FIG.12
Doppia marcatura per PGRN e NeuN in sezioni coronali di topi neonati p0 (A), di 1 mese (B) e 3 mesi (C) relative
all’area dell’ippocampo. Le frecce indicano i neuroni fortemente immunoreattivi per la proteina riscontrati in diverse
porzioni dell’ippocampo, quali la CA3 e il giro dentato. In età adulta a 12 mesi (D) PGRN era espressa sia da neuroni
sia da astrociti come mostra la colocalizzazione della marcatura per PGRN e GFAP. (E) La ricostruzione dell’intera
area dell’ippocampo di topi C57BL/6J di 4 mesi mostra che PGRN era presente principalmente a livello della CA3.
Barra di calibrazione: (A)= 70 µm; (B/C/D/E)= 100 µm.
5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Le colture neuronali corticali e ippocampali sviluppate in questo progetto rappresentano una buona piattaforma per lo
studio degli effetti del silenziamento genico di PGRN. Infatti entrambe le colture sono costituite da una popolazione
arricchita in neuroni GAD-65-positivi con una bassa popolazione astrocitaria. I neuroni presenti inoltre mostrano una
morfologia complessa caratterizzata da una ricca arborizzazione dendritica come mostrato dalla marcatura con MAP-2 .
PGRN è espressa a livelli maggiori nelle colture neuronali corticali rispetto a quelle ippocampali e a livello subcellulare
l’immunoreattività è localizzata principalmente a livello del soma rispetto ai processi. Queste colture rappresentano
pertanto una buona piattaforma sperimentale per l’esecuzione di esperimenti di silenziamento di PGRN e sono state
utilizzate per testare diverse sequenze silenzianti. La sequenza siRNA 4 è stata dimostrata indurre una riduzione
statisticamente significativa dei livelli di PGRN alla concentrazione di 25 nM dopo 96 h di incubazione senza effetti
secondari tossici. Questa sequenza è stata dunque utilizzata per silenziare PGRN e per mimare l’aploinsufficienza
riscontrata nei pazienti. Il silenziamento di PGRN riduce i livelli di espressione delle subunità NR1 e NR2B. I recettori
NMDA per il glutammato sono coinvolti in numerosi processi di memoria e apprendimento in quanto sono implicati nel
controllo dei meccanismi di eccitabilità neuronale e di plasticità sinaptica, perciò una correlazione tra questi e PGRN
potrebbe essere interessante per spiegare alcuni dei sintomi riscontrati nella FTLD-U. Infatti, come è già stato citato
nell’introduzione di questa relazione, durante l’invecchiamento e in pazienti affetti da forme di demenza si assiste ad un
calo dei loro livelli. Inoltre in condizioni di eccitotossicità o di overstimolazione di questi recettori la cellula attiva una
serie di meccanismi compensatori che riducono l’espressione delle diverse subunità. Il silenziamento di PGRN è in
grado di influenzare l’espressione di due subunità fondamentali per la funzionalità dei recettori NMDA, in quanto NR1
è il sito di legame per la glicina che agisce da co-agonista, mentre su NR2B avviene il legame del glutammato. La
riduzione dei loro livelli di espressione potrebbe giocare un ruolo neuroprotettivo. Infatti se la riduzione dei livelli di
PGRN attivasse meccanismi di eccitotossicità NMDA mediati, la riduzione dei livelli di NR1 e NR2B compenserebbe
questa situazione che se prolungata porterebbe a degenerazione neuronale. Per confermare questa ipotesi sono stati
programmati una serie di esperimenti per valutare se sono presenti alterazioni dei flussi di Ca2+ implicati in meccanismi
di eccitotossicità. Per fare ciò utilizzeremo un colorante stechiometrico (FURA-2) che quando lega il Ca2+ cambia la
sua lunghezza d’onda d’emissione che viene monitorata con lo strumento MiraCal. Il silenziamento di PGRN inoltre
altera l’espressione e la localizzazione della proteina MAP-2. L’arborizzazione dendritica dei neuroni silenziati risulta
fortemente ridotta e sono visibili segni di degenerazione. Una possibile interazione tra PGRN e MAP-2 potrebbe
spiegare questi effetti. MAP-2 in condizioni fisiologiche stabilizza l’assetto microtubulare dei neuroni. In seguito al
silenziamento di PGRN si assiste ad una delocalizzazione di MAP-2 che in questo modo non riuscirebbe più a svolgere
la sua funzione stabilizzatrice. Questo potrebbe causare la degenerazione dei processi e la riduzione di arborizzazione
osservata. Gli effetti globali di questa degenerazione potrebbero implicare danni al trasporto assonale, alla
comunicazione inter-cellulare e all’eccitabilità dei neuroni tra i principali. Perciò l’interazione tra PGRN e l’apparato
microtubulare tramite MAP-2 potrebbe rappresentare la chiave di volta nella patogenesi della FTLD-U. Gli effetti di
PGRN sullo sviluppo dei processi neuronali e delle spine dendritiche e sul mantenimento della plasticità descritti in
letteratura confermano quanto da noi osservato. Un’ulteriore analisi che risulta necessario svolgere è lo studio di
eventuali effetti mediati da PGRN sulla proteina TAU, un'altra MAP deputata alla stabilizzazione e dinamicità dei
microtubuli. In particolare eventuali alterazioni dei processi di fosforilazione di TAU che sono fondamentali per la
funzionalità della proteina. Infatti condizioni di iperfosforilazione causano l’aggregazione della proteina in aggregati
insolubili, le inclusioni tipiche dei pazienti affetti da AD. Mentre, come per MAP-2, sembra fondamentale la
fosforilazione in alcuni siti specifici per garantire un legame efficiente della proteina ai microtubuli. I dati ottenuti dal
nostro modello “in vivo”, il topo di controllo C57BL/6J, confermano un elevato di livello di espressione della proteina a
livello dei neuroni piramidali corticali e ippocampali. L’immunoreattività è di tipo granulare e, come nelle colture
primarie, è superiore a livello del soma rispetto ai processi. L’espressione di PGRN nei neuroni aumenta in modo età
dipendente e in astrociti e cellule microgliali è presente solo in fasi tardive di sviluppo e aumenta dopo la loro
attivazione. Inoltre durante lo sviluppo la proteina subisce un processo di maturazione che causa uno shift di peso
molecolare, da 62 kDa della forma immatura a 88 kDa di quella matura. Questa fine regolazione avviene grazie a
processi di glicosilazione che sono già stati descritti in letteratura. I suoi livelli sono elevati in corteccia, substantia
nigra e ippocampo dove è presente principalmente a livello della CA3. PGRN dunque è una proteina fortemente
espressa a livello cerebrale in diverse aree e la sua funzionalità è finemente regolata. La caratterizzazione dei livelli
basali di PGRN nel nostro modello “in vivo” è il punto di partenza per programmare la seconda parte del progetto ossia
il silenziamento di PGRN “in vivo”.
In conclusione questi studi hanno dimostrato che le nostre colture neuronali rappresentano un buon modello “in vitro”
per riprodurre le condizioni di aploinsufficienza osservate nei pazienti affetti da FTLD-U. Infatti è opportuno
sottolineare che i modelli generati finora sono dei KO in cui la proteina non è espressa. In realtà nei pazienti PGRN non
è del tutto assente ma è presente in dose ridotta. Perciò un buon modello per questa patologia deve mostrare dei livelli
residui di espressione di PGRN e per ottenere ciò il silenziamento genico è la tecnica migliore. La proteina inoltre è
espressa a livelli elevati dai neuroni perciò gli effetti del silenziamento osservati sono ascrivibili a meccanismi di
risposta e adattamento operati dai neuroni stessi per preservare la loro funzionalità. In queste colture dunque i
meccanismi molecolari alla base della riduzione di espressione di PGRN sono saggiabili in modo semplice e
riproducibile.
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ELENCO DELLE PUBBLICAZIONI
Dottoranda: Zaltieri Michela
CAPITOLI DI LIBRI
1) Direct evaluation of protein expression, post-translational modification and interactions by
proximity ligation assay.
Zaltieri M, Spano P, Missale C and Bellucci A.
Neural Stem Cell Assay. Edited by Wiley-Blackwell a cura di Navjot Kaur and E. Mohan Vemuri.
Submitted.
ARTICOLI PUBBLICATI SU RIVISTE SCIENTIFICHE INTERNAZIONALI
1) From α-synuclein to synaptic dysfunctions: New insights into the pathophysiology of
Parkinson's disease.
Bellucci A, Zaltieri M, Navarria L, Grigoletto J, Missale C, Spano P.
Brain Res. 2012 Oct 2;1476:183-202.
2) α-Synuclein synaptic pathology and its implications in the development of novel therapeutic
approaches to cure Parkinson's disease.
Bellucci A, Navarria L, Zaltieri M, Missale C, Spano P.
Brain Res. 2012 Jan 13;1432:95-113.
3) Redistribution of DAT/α-synuclein complexes visualized by "in situ" proximity ligation
assay in transgenic mice modelling early Parkinson's disease.
Bellucci A, Navarria L, Falarti E, Zaltieri M, Bono F, Collo G, Spillantini MG, Missale C, Spano
P.
PLoS One. 2011;6(12)
4) Induction of the unfolded protein response by α-synuclein in experimental models of
Parkinson's disease.
Bellucci A, Navarria L, Zaltieri M, Falarti E, Bodei S, Sigala S, Battistin L, Spillantini M, Missale
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ELENCO DEI CONGRESSI E DEGLI ABSTRACTS PRESENTATI A CONGRESSI
INTERNAZIONALI
Dottoranda: Zaltieri Michela
1) Bellucci A, Zaltieri M, Navarria L, Falarti E, Bodei S, Sigala S, Spillantini MG, Missale C and
Spano PF. Induction of the unfolded protein response by α-synuclein in experimental models of
Parkinson disease. 7th FENS, Forum of European Neuroscience 2010, Amsterdam, Netherlands,
July 3-7, 2010.
ABSTRACT:
Parkinson's disease (PD) is characterized by the accumulation of Lewy bodies (LB), proteinaceous inclusions which are mainly
composed by fibrillary aggregated alpha-synuclein, and by loss of nigrostriatal dopaminergic neurons. A central role for aggregated
alpha-synuclein in the pathogenesis of dopamine (DA) neuron degeneration emerges from studies showing that alpha-synuclein
increase and aggregation induces the death of dopaminergic cells (Bellucci et al., 2007 J. Neurochem., 106, 560-577; Sidhu et al.,
2004 Ann. N. Y. Acad. Sci., 1035, 250-270) and that alpha-synuclein overexpression triggers apoptotic mechanisms (Saha et al.,
2000 Eur. J. Neurosci., 12, 3073-3077). Recent evidence showed that, in nigral neurons bearing alpha-synuclein inclusions in the
brain of PD patients (Hoozemans et al., 2007 Biochem. Biophys. Res. Commun., 354, 707-711) there is the activation of a pathway
implicated in the induction apoptotic cell death (Lin et al., 2009 PLoS. One., 4, e4170): the unfolded protein response (UPR). Thus,
activation of the UPR may be involved in the alpha-synuclein-dependent DA neuron degeneration. To determine whether alphasynuclein accumulation can directly induce the UPR and the consequent pro-apoptotic changes we investigated whether alphasynuclein directly binds to the misfolded protein sensor/UPR activator GRP78/Bip within the ER of cells showing insoluble alphasynuclein aggregates. Moreover, we studied the induction of the downstream UPR-associated transcription factor ATF4/CREB-2.
Finally, we investigated whether the activation of the UPR pathway, in cells showing alpha-synuclein accumulation, coincides with
cytochrome c (cyt c) release from the mitochondria. We found that GRP78/Bip was bound to alpha-synuclein and was increased in in
vitro and in vivo models showing aggregated alpha-synuclein accumulation. Alpha-synuclein accumulation induced the expression of
ATF4/CREB-2. Also, we observed cyt c release from the mitochondria of cells displaying alpha-synuclein aggregates. Our findings
indicate that the accumulation of alpha-synuclein within the ER results in the activation of the PERK-dependent pathway of the UPR.
Activation of the UPR may in turn be implicated in the induction of the apoptotic pathway. Our observations suggest a
novel role for alpha-synuclein as activator of ER stress-related responses.
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ABCSTRACT:
Parkinson disease (PD) is characterized by dopaminergic cell loss in the substantia nigra pars-compacta (SNpC) and by the
presence of intraneuronal proteinaceous inclusions, named Lewy bodies, that are mainly composed by fibrillary aggregated of αsynuclein (Lees et al,2009; Tofaris et al., 2006). In the past decade, it has became an evidence that mutations in the SNCA gene,
encoding for α –synuclein)(α-syn) , are responsible for the onset of familial PD (Cookson and Van der Brug, 2009) thus leading to
the argument that α-syn can be considered a causative agent for PD and related disorders (Cookson, 2005 ). These considerations
leave us with the simplest possible sketch of the pathogenesis of PD: that α-syn is an initiator of damage and the final outputs, after
many years, are cell loss and LB formation. On this line, recent evidences indicates that α-syn aggregation into insoluble inclusions
may lead to dysfunction and degeneration of dopaminergic neurons due to alterations in the trafficking of key proteins involved in
the regulation of dopaminergic synapses such as the dopamine transporter (DAT) and SNARE proteins (Bellucci et al., 2008;
Garcia-Reitböck et al., 2010). Thus, α-syn plays a crucial role in the control of these cells, by finely tuning dopamine (DA) release
and reuptake. It is noteworthy that, the basal functional activity of dopaminergic neurons in the SNpc is modulated by glutamatergic
stimulation via the activation of N-methyl-d-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) which are located on the soma and dendrites of
dopaminergic neurons (Chergui et al., 1993). Indeed, within the basal ganglia circuits , nigral dopaminergic neurons receive
excitatory afferents from the subthalamic nucleus (STN) which selectively activate NMDAR (Mereu et al., 1991) to induce burst
firing of these cells (Johnson et al., 1992). NMDAR are member of a superfamily of ligand-gated ion channels (Monaghan et al.,
1989) activated by glutamate in presence of the co-agonist glycine. In particular, NMDAR activation results in intracellular Ca2+
influxes that play critical roles in synaptic trasmission and cell survival. On the other hand, an aberrant intracytoplasmic Ca2+
increase may be lethal for the cell as it has been demonstrated that NMDAR may contribute to excitotoxic death of dopaminergic
neurons in PD (Blandini et al., 2000). In particular, NR2B selective subunit NMDAR antagonist have therapeutic potential in PD
(Hallett and Standaert, 2004). In the present study, we investigated whether the pathological accumulation of α-syn may induce
alterations in the expression, localization and activation of NMDAR in “in vitro” and “in vivo” models showing α-syn aggregates.
To this aim, we developed two different “in vitro” models: the glucose deprived SH-SY5Y neuroblastoma cell line differentiated
toward a dopaminergic phenotype (SH-SY5Y+ cells) (Bellucci et al., 2008) and the SK-N-SH neuroblastoma cell line stable
transfected with the full length 140 aa (syn140) and the truncated 120 aa (syn120) form of α-syn. Furthermore, we studied the
occurrence of alterations in NMDAR localization and expression in a transgenic animal model overexpressing the human syn120
form of α-syn under the guidance of a TH promoter (SYN120 mice). Co-immunoprecipitation and immunocytochemical studies
showed that α-syn interacts with- and controls the trafficking of the NR1 and NR2B subunits NMDAR. Furthermore, over-expression
and aggregation of α-syn within intracellular inclusions altered NMDAR expression and activation measured by detecting the
phosphorylation level of extracellular signal-regulated kinase ½ (ERK1/2) and the Ca2+ fluxes measured “in vivo” by the use of
Fura-2AM Ca2+ indicator dye. Other co-immunoprecipitation studies showed that in SNpc α-syn also interacts NMDAR-associated
protein post synaptic density 95 (PSD-95). Finally, we observed that in the SNpc of 12 month-old transgenic homozygous SYN120
mice(Tofaris et al., 2006) there was a reduction of NMDAR expression which may reflect the functional changes of the basal ganglia
circuitry observed in this model (Garcia-Reitböck et al., 2010). Overall, these data indicate that syn may play a crucial role in the
regulation of post-synaptic density and of the firing of nigral dopaminergic neurons.
3) Navarria L, Zaltieri M, Bodei S, Sigala S, Spillantini MG, Missale C, Spano PF and Bellucci A.
Induction of the unfolded protein response by alpha-synuclein in experimental models of
Parkinson’s disease. 10th AD/PD, International Conference on Alzheimer’s and Parkinson’s
Diseases. Barcelona, Spain, March 9-13, 2011.
ABSTRACT:
Introduction: Parkinson disease (PD) is characterized by the accumulation α-synuclein in Lewy bodies. It was shown that an
endoplasmic reticulum (ER) stress-related pathway, the unfolded protein response (UPR) is activated in dopaminergic neurons
bearing α-synuclein inclusions in the PD brain. Thus, the activation of the UPR may be related to α-synuclein. The UPR is induced
by the accumulation of misfolded proteins within the ER. These are bound by the UPR sensor glucose regulated
protein/immunoglobulin heavy chain binding protein (GRP78/BiP), which in turn dissociates from and activates three ER stress
receptors mediating the UPR. Among these latters, pancreatic (PKR)-like ER kinase (PERK) drives a cascade of events leading to
the production of activating transcription factor 4/cAMP responsive element 2 (ATF4/CREB-2) which induces the transcription of
genes involved in ER homeostasis, stress-induced apoptosis and autophagy.
Aims: To evaluate whether the accumulation of α-synuclein within the ER triggers the activation of the UPR and whether this
activation coincides with the induction of pro-apoptotic events.
Methods: The expression of GRP78/BiP and ATF4/CREB-2 in “in vitro” and “in vivo” models of PD showing α-synuclein
accumulation was studied by western blot, RT-PCR, immunocyto- and immunohistochemistry.
Results: We found that GRP78/BiP was bound to α-synuclein and was increased in “in vitro” and “in vivo” models showing αsynuclein accumulation. In parallel ATF4/CREB-2 was induced.
Conclusions: Our findings indicate that accumulation of α-synuclein within the ER activates the PERK dependent pathway of the
UPR leading to the induction of ATF4/CREB-2. Activation of the UPR may in turn induce pro-apoptotic events.
4) Navarria L, Zaltieri M, Spano PF and Bellucci A. Alpha-synuclein modulates the localization,
expression and function of NR2B-containing NMDA receptors: implications in the pathogenesis of
Parkinson’s disease. 8th IBRO, World Congress of Neuroscience, Florence, Italy, July 14-18, 2011
ABSTRACT:
Parkinson disease (PD) is characterized by dopaminergic cell loss in the substantia nigra pars-compacta (SNpC) and by the
presence of intraneuronal proteinaceous inclusions, named Lewy bodies, that are mainly composed by fibrillary aggregated of αsynuclein (α-syn). Recent evidence indicates that α-syn aggregation into insoluble inclusions may lead to dysfunction and
degeneration of dopaminergic neurons due to alterations in the trafficking of key synaptic proteins. Nigral dopaminergic neurons
receive excitatory afferents from the subthalamic nucleus (STN) which selectively activate glutamatergic N-methyl-d-aspartate
receptor (NMDAR) to induce burst firing of these cells. In particular, NMDAR activation results in intracellular Ca2+ influxes,
which regulate synaptic trasmission and cell survival. On the other hand, an aberrant intracytoplasmic Ca2+ increase may be lethal
for the cell as persistent NMDAR activation can contribute to excitotoxic death of dopaminergic neurons in PD. In the present study,
we investigated whether the pathological accumulation of α-syn in dopaminergic neurons may induce alterations in the expression,
localization and function of NR2B-containing NMDAR and of the NMDAR-associated protein post synaptic density 95 (PSD-95) in
cellular models showing a-syn overexpression. By immunocytochemistry and western blotting (WB) we found that α-syn
accumulation altered the localization and expression of the NR1 and NR2B subunits of NMDAR and PSD-95. Coimmunoprecipitation studies showed that a-syn directly interacted with the NR1, NR2B subunit and PSD-95. To evaluate the
occurrence of NMDAR dysfunctions, we measured the phophorylation of ERK1/2 by WB and we assayed NMDA-dependent Ca2+
influx by the use of Fura-2AM dye. We found that NMDAR function was reduced by the presence of α-syn aggregates. Overall, these
data indicate that a-syn accumulation may crucially affect the regulation of the NMDAR-induced firing of nigral dopaminergic
neurons.
5) Bellucci A, Navarria L, Falarti E, Zaltieri M, Spillantini MG, Missale C and Spano PF.
Redistribution of DAT/α-synuclein complexes visualized by "in situ" proximity ligation assay in
transgenic mice modelling early Parkinson's disease. 8th IBRO, World Congress of Neuroscience,
Florence, Italy, July 14-18, 2011
ABSTRACT:
Alpha-synuclein, the major component of Lewy bodies, plays a central role in the onset of dopaminergic synaptic dysfunctions in
Parkinson's disease (PD) (Tofaris and Spillantini, 2007, Cell. Mol. Life Sci. 64: 280-82) . Recent evidence indicates that α-synuclein
may affect dopaminergic neuron function as it interacts with the key protein modulating dopamine (DA) content at the synapse: the
DA transporter (DAT) (Lee et al., 2001, FASEB J. 15: 916-926; Wersinger et al., 2003, FASEB J. 17: 2151-2153; Bellucci et al.,
2008, J. Neurochem. 106:560-577). In particular, our data indicate that α-synuclein aggregation decreases the expression and
membrane trafficking of the DAT as this protein is retained into α-synuclein-immunopositive inclusions in cultured dopaminergic
cells following insults which stimulate α-synuclein aggregation (Bellucci et al., 2008, J.Neurochem. 106:560-577). We thus aimed at
investigating whether the pathological aggregation of α-synuclein “in vivo” may lead to alterations in DAT distribution in a
transgenic mouse model of PD. By using a novel technique which allows the visualization of protein-protein interactions: the
proximity ligation assay (PLA), we studied the occurrence of alterations in the localization of DAT and α-synuclein complexes in the
SYN120 transgenic mouse model, showing insoluble α-synuclein aggregates into dopaminergic neurons of the nigrostriatal system,
reduced striatal DA levels and altered distribution of synaptic proteins in the striatum (Tofaris et al., 2003, J. Neurosci. 26:3942-50;
Garcia-Reitböck et al., 2010, Brain 133: 2032-44). We found that α-synuclein/DAT PLA-positive complexes were redistributed in the
striatum and substantia nigra of SYN120 mice. These alterations were accompanied by a significant increase of DAT striatal levels
in transgenic animals when compared to wild type littermates. Our data indicate that, in the early pathogenesis of PD, α-synuclein
likely alters dopaminergic synapse arrangement by modulating the subcellular distribution and the levels of key synaptic proteins
including the DAT.
6) Zaltieri M, Navarria L, Spano PF and Bellucci A. Ex vivo characterization of progranulin gene
silencing in primary neuronal cultures to study the biological basis of FTLD-U. 8th IBRO, World Congress
of Neuroscience, Florence, Italy, July 14-18, 2011
ABSTRACT:
Frontotemporal lobar degeneration with tau-negative ubiquitin-positive inclusions (FTLD-U) is a subtype of FTLD, a common
cause of dementia clinically overlapping with frontotemporal dementia (FTD), semantic dementia (SD) and primary progressive
aphasia (PPA). The main symptomatological features include: language disorders, personality and behavioural changes, and
eventually a late onset cognitive impairment. Genetic studies have shown that loss of progranulin (PGRN) function caused by genetic
mutations are responsible for the onset of this disorder (Goedert and Spillantini, 2006 Brain, 129: 2808-10). PGRN is a
multifunctional protein that is widely expressed by microglia and neurons. This precursor protein undergoes proteolytic cleavage by
extracellular proteases generating smaller peptides termed granulins (GRNs). PGRN, has a role in several physiological and
pathological processes and its properties are distinct from those of GRNs. Primary neuronal cultures are a helpful and versatile tool
to study the biological basis of neuronal dysfunction and degeneration. To evaluate the molecular mechanisms through which loss of
PGRN function may affect neuronal vulnerability we developed primary cortical and hippocampal neuron cultures from mouse P0
C57BL/6J puppies with the aim to characterize PGRN RNA interference “ex vivo”. Cell viability and the percentage of neuronal
cells, astrocytes, and GABAergic neurons in the cultures were evaluated by using standardized methods. PGRN localization and
expression was monitored by immunocytochemistry and western blot (WB). The efficiency of PGRN gene silencing as well as its
effects on cell viability were evaluated. Finally, PGRN expression in different brain areas of 4 month-old C57BL/6J mice was studied
by WB and immunohistochemical methods. We found that PGRN expression in cortical and hippocampal neurons supported the use
of this cultures for the “ex vivo” characterization of PGRN gene silencing. A specific siRNA sequence for “in vivo” PGRN gene
silencing was identified to be tested “in vivo” on C57BL/6J mice.
7) Navarria L, Zaltieri M, Missale C, Spano PF and Bellucci A. NMDA receptor expression is altered in
primary cortical neurons from α-synuclein null mice. Molecular Mechanisms in Neuroscience, Rome, Italy,
October 3-4, 2011
ABSTRACT:
Alpha‐synuclein is a 140 amino acid protein mainly expressed in neurons and located in the presynaptic termini (Maroteaux et al., 1988). The pathological deposition of α–synuclein aggregates in various types of neurons or glial cells is associated with several neurological disorders, including dementia with Lewy bodies (DLB), Parkinson’s disease (PD), multiple system atrophy (MSA), LB dysphagia as well as neurodegeneration with brain iron type I, pure autonomic failure, and the LB variant of Alzheimer’s disease which are commonly defined as α‐synucleinopathies (Uversky 2007). The physiological role of α–synuclein in neuronal cells hasn’t been yet fully characterized. Nonetheless, substantial evidence indicates that although this protein is predominantly natively unfolded in solution, it can bind to phospholipid membranes by adopting an α helical structure in its N‐terminal region (Bennett et al., 2005), thus suggesting that α –synuclein may play important roles in regulating synaptic membrane proteins. Remarkably, α‐
synuclein regulates the pool of synaptic vesicles through an interaction with membranes (Auluck et al., 2010). Furthermore, recent evidence indicates that it can modulate the trafficking of proteins transporter (DAT) and SNARE proteins (Bellucci et al., 2008; Garcia‐Reitböck et al., 2010). Cortical neurons receive excitatory afferents, which selectively activates glutamatergic N‐Methyl‐d‐
aspartate receptor (NMDAR) to induce burst firing of these cells. In particular, NMDAR activation results in intracellular Ca2+ influxes, which regulate synaptic transmission and cell survival (Papadia et al., 2008). We used a subpopulation of the widely used inbred mouse strain C57BL/6J bearing a deletion of the α–synuclein locus (C57BL/6S) (Specht and Schoepfer). To obtain a better insight into the physiological function of α‐synuclein and its role in synucleinopathies. C57BL/6J wild type mice were used as controls. Primary cortical neurons were dissected from P0 puppies of C57BL/6J mice (CX/J) and C57BL/6S (CX/S) and grown for 11 days in vitro (DIV11). The specific aims of this work were: 1) to investigate whether α–synuclein interacts with the NR1 and NR2B subunits of NMDAR as well as with the NMDAR modulator post synaptic density‐95 (PSD‐95), 2) to investigate whether the lack of α‐synuclein may alter the levels of expression of NMDAR and PSD95 in cortical neurons and 3) to evaluate whether cortical neurons from α–synuclein null mice may differently respond to neurotoxic stimuli which can also induce α–synuclein aggregation such as rotenone treatment. We found that α –synuclein directly interacts with the NR1 and NR2B as well as with PSD‐95. Furthermore, the levels of NR2B, NR1 and PSD‐95 were lower in primary cortical neurons from α‐synuclein null mice with respect to wt mice. We observed that after rotenone treatment NR2B levels in cortical neurons were unchanged in C57BL/6S mice while a significant decrease of NR2B was found in the WT cell. Finally, we found that cortical neurons from the α–synuclein null mice were more resistant to rotenone‐induced cell death. These data strongly indicate that α–synuclein may act as a key modulator of NMDAR. 8) Zaltieri M, Navarria L, Missale C, Spano PF and Bellucci A. Characterization of the molecular
pathways underlying the onset of frontotemporal lobar degeneration in a cellular model of PGRN
haploinsufficiency. SINS 2012, XIV Congress of the Italian Society for Neuroscience, Catania,
Italy, April 19-22, 2012
ABSTRACT:
Mutations resulting in haploinsufficiency of progranulin (PGRN) gene are related to the onset of frontotemporal lobar degeneration
with tau-negative ubiquitin-positive inclusions (FTLD-U), a form of neurodegenerative dementia. PGRN is expressed in microglia
and neurons but its function in the nervous system still needs to be elucidated. Here, we aimed at generating an “in vivo” model of
FTLD-U in order to evaluate the molecular mechanisms through which loss of PGRN function may affect neuronal vulnerability. We
induced PGRN haploinsufficiency by using RNA interference in primary cortical and hippocampal neuron cultures from mouse P0
C57BL/6J puppies. These neuronal cultures were characterized using standardized methods to asses their composition, viability and
functionality. PGRN expression and subcellular localization was evaluated also “in vivo” in adult C57BL/6J mice and P0 C57BL/6J
puppies using immunofluorescent and western blot techniques. We generated enriched neuronal cultures expressing high levels of
PGRN. In the brain of adult and P0 C57BL/6J mice the protein was present in neuron of different brain areas. PGRN gene silencing
induced a 60% decrease in protein expression, indicating that our model may represent an ideal platform to study neuronal
alterations related to PGRN haploinsufficiency.
9) Bellucci A, Navarria L, Zaltieri M, Grigoletto J, Spillantini MG, Missale C & Spano PF. Alphasynuclein modulates synapsin III in nigrostriatal dopaminergic neurons: implications for
Parkinson's disease . 8th FENS, Forum of European Neuroscience 2012, Barcelona, Spain, July 48, 2012.
ABSTRACT:
Alpha-synuclein, the major component of Lewy bodies, plays a central role in the onset of dopaminergic synaptic dysfunctions in
Parkinson's disease (PD) (Bellucci et al., 2012, Brain Res. 1432: 95-113). On this line, we recently demonstrated that α-synuclein
aggregation induces a subcellular redistribution of the dopamine (DA) transporter (DAT). This phenomenon occurs as a
consequence of the direct interaction of the DAT and α-synuclein and coincides with a reduction of DA turnover (Bellucci et al.,
2008, J. Neurochem. 106: 560-577 ;Bellucci et al., 2011, PLoS ONE, 6(12):e27959). Here, we aimed at investigating whether
synapsin III, a negative modulator of DA release (Kile et al., 2010, 30(29):9762-70), may be regulated by α-synuclein. We found that
primary dopaminergic mesencephalic neurons from C57BL/6S α-synuclein null mice expressed higher levels of synapsin III when
compared to those from C57BL/6J controls. Remarkably, insults which are known to induce α-synuclein aggregation, such as
glucose deprivation or 6-hydroxydopamine, were able to induce an increase of the expression and a redistribution of synapsin III
only in primary dopaminergic neurons obtained from C57BL/6J mice, but not from those of C57BL/6S mice. Moreover, we observed
that synapsin III interacts with both DAT and α-synuclein in the striatum of control C57BL/6J mice and of a human C-terminallytruncated (SYN120) transgenic mouse model of PD. Finally, the expression of synapsin III was strongly increased in the striatum of
12-month-old SYN120 mice which also showed a decreased DA release (Garcia-Reitbock et al., 2010, Brain, 133(Pt 7): 2032-44)
when compared to control mice. Taken together, our data indicate that, in the early pathogenesis of PD, α-synuclein likely alters
dopaminergic synapse arrangement by modulating the subcellular distribution and the levels of key synaptic proteins including
synapsin III.
10) Zaltieri M, Navarria L, Missale C, Spano PF and Bellucci A. Pgrn gene silencing in primary
neuronal cultures: an haploinsufficiency model of frontotemporal lobar degeneration. The 8th
International Conference on Frontotemporal Dementias, Manchester, UK, September 5-7, 2012.
ABSTRACT:
Mutations leading to progranulin (PGRN) haploinsufficiency have emerged as a key players in the onset of a subset of
frontotemporal lobar degeneration characterized by the presence of tau-negative ubiquitin-positive inclusions (FTLD-U). Although
PGRN is a widely expressed multifunctional glycoprotein, its role in the nervous system still needs to be elucidated. In order to study
the molecular mechanisms through which loss of PGRN function related to its haploinsufficiency may affect neuronal vulnerability
we have established an “ex vivo” model by using RNA interference (RNAi) techniques in primary cortical and hippocampal neuronal
cultures from C57BL/6J mouse p0 puppies. The effects of PGRN gene silencing on the expression of a series of protein involved in
the modulation of neuronal resilience and morphology were investigated. In addition, we studied PGRN expression and subcellular
localization in different brain areas of adult mice and p0 puppies. We found a specific siRNA sequence inducing 60% reduction of
PGRN expression. This event reduced cell viability and the expression of NMDA receptors. In addition, we found that neurons
showing reduced PGRN expression exhibited diminished levels of phosphorylated tau as well as signs of dendritic shrinkage. These
changes may underlie the onset of neuronal degeneration in FTLD-U. Our “ex vivo” model may thus represent a good platform to
study the alterations in neuronal vulnerability and functionality underlying the pathogenesis of FTLD-U related to PGRN
haploinsufficiency.