Lezioni "Topi transgenici"

Topi transgenici
Biologia dello sviluppo – Tor Vergata
Dott.ssa Merlo
30 Ott 2014
CONCETTI FONDAMENTALI
Cosa sono gli animali transgenici?
 
Animali che sono stati ingegnerizzati geneticamente in modo da
avere uno o più geni provenienti da una fonte esogena
 
I transgeni sono integrati nel genoma
 
I transgeni possono essere trasmessi attraverso la linea
germinale alla progenie
 
Il primo animale transgenico che si produce si chiama “animale
fondatore”- founder
Un modo per studiare la funzione di un
gene è la variazione del dosaggio genico
Inserire nuove copie
geniche (transgenico)
Aumento della
quantità di proteina
DNA
+
wt
0
Proteina
Sostituire i geni
con copie non funzionali
(gene knock-out)
Diminuzione della
quantità di proteina
CONCETTI FONDAMENTALI
Introduzione di geni estranei in un organismo
 
La procedura è praticamente la stessa indipendentemente
dall’animale coinvolto
 
L’integrazione in genere avviene prima della replicazione del
DNA nell’oocita fertilizzato
 
La maggior parte degli animali transgenici ha il transgene in
tutte le cellule, incluse quelle della linea germinale.
La trasmissione alla generazione successiva richiede
l’integrazione nella linea germinale
 
Alcune integrazioni avvengono dopo la replicazione del DNA
dando luogo ad animali mosaico che potrebbero o non
potrebbero contenere il transgene nella linea germinale
Come modificare il genoma di un
mammifero in tutte le sue cellule?
 
Scelta del tipo cellulare da utilizzare
 
Metodi di inserzione del DNA nelle cellule
 
Sito di inserzione del DNA nelle cellule
Procedura per produrre topi transgenici
Sono richiesti tre diversi tipi di coppie da incrociare
1o paio : Maschio fertile + femmina in superovulazione
 
Maschio fertile (si cambia regolarmente)
 
Femmina in superovulatione = femmina immatura che viene indotta a
superovulare
FSH nel giorno 1
Gonadotropina corionica umana (LH) nel giorno 3
 
Incrocio nel giorno 3
 
Gli oociti fertilizzati vengono microiniettati con un costrutto di DNA estraneo
nel giorno 4
 
Gli oociti microiniettati sono trasferiti nell’ovidotto di una madre surrogato
alla fine del giorno 4
http://www.youtube.com/watch?v=HiF9RDZJ0Pg
http://www.youtube.com/watch?v=HiF9RDZJ0Pg
Utilizzo di zigoti appena fecondati
Metodo di inserzione del DNA:
microiniezione
Tutte le cellule dell’organismo hanno
un genoma modificato
Procedura per produrre topi transgenici
Sono richiesti tre diversi tipi di coppie da incrociare
2o paio : Maschio sterile + madre surrogato
 
Maschio sterile (vasectomia)
 
Madre surrogato = si deve accoppiare per essere un recipiente adatto alle
uova iniettate
 
Incrocio nel giorno 3
 
Gli oociti microiniettati provenienti dalla coppia 1 vengono trasferiti
nell’ovidotto della madre surrogato alla fine del giorno 4
 
Gli embrioni si impiantano nella parete uterina e nascono 19 giorni dopo
(tecniche di Southern blotting confermano la presenza ed il numero di copie
del transgene)
Procedura per produrre topi transgenici
Sono richiesti tre diversi tipi di coppie da incrociare
3o paio : genitori adottivi
 
Maschio fertile + femmina incrociata in modo da avere dei cuccioli lo stesso
giorno della madre surrogato
 
I genitori adottivi possono essere utili se dovesse essere necessario un parto
cesareo della madre surrogato
Integrazione di un transgene nel genoma
 
In genere il transgene si inserisce in un cromosoma dando origine ad un
eterozigote
- 50% di probabilità di passare il transgene alla progenie
 
Due topi eterozigoti, incrociati possono dare origine ad un omozigote che
contiene il transgene in doppia copia
- 100% di probabilità di passare il transgene alla progenie
 
Molti transgeni sono stabilmente trasmessi per molte generazioni senza
riarrangiamenti
Meccanismi di integrazione del DNA
 
Molecole lineari si integrano più efficientemente di molecole circolari (~5x)
 
Una volta nell’oocita, le molecole lineari circolarizzano
 
Di solito tutte le molecole che si integrano lo fanno nello stesso cromosoma e nello
stesso sito
 
Copie multiple, in genere, si arrangiano in tandem, head-to-tail
 
La grandezza delle molecole di DNA non è un parametro fondamentale (0.7 – 50Kb)
 
La concentrazione e la purezza del DNA iniettato lo sono (massimo 1-3 mg/ml)
Ipotesi per l’integrazione del DNA
 
Le estremità del DNA lineare iniettato si integrano in prossimità di rotture che
avvengono spontaneamente nel cromosoma
 
Molecole iniettate che hanno circolarizzato probabilmente ricombinano fra di
loro e con le copie integrate per generare tandem, head-to-tail
 
La ricombinazione è probabilmente favorita dall’alta concentrazione locale di
DNA e da proprietà speciali come l’assenza di una normale struttura della
cromatina
 
Il numero di rotture cromosomiche è presumibilmente limitante e spiega il basso
numero di eventi di integrazione e perché diverse molecole di DNA di solito
vengono integrate nello stesso sito
Espressione dei geni nel topo transgenico
 
Per discriminare i prodotti del gene iniettato dalla sua controparte endogena, il
gene iniettato deve essere marcato in qualche modo
- mini-genes in cui gli esoni sono stati eliminati dal cDNA e dove gli introni sono
mancanti
- 
Modificazioni per inserzione/delezione/mutagenesi di pochi nucleotidi (per
esempio, l’acquisizione o la perdita di un sito di restrizione)
- geni ibridi in cui degli epitopi sono espressi insieme al prodotto transgenico
Espressione tessuto-specifica
 
In genere, se un gene è tessuto-specifico, allora viene espresso in maniera
appropriata, anche se si è integrato in una diversa posizione cromosomica
 
Le proteine che agiscono in trans e promuovono l’espressione tessuto-specifica
possono “trovare” le sequenze che controllano e attivare la trascrizione a partire
da varie posizioni cromosomiche
 
I livelli di espressione cambiano nei vari animali founder dal momento che la
posizione di integrazione nel genoma può influenzare l’accessibilità del transgene
ai fattori di trascrizione che agiscono in trans
 
Alcuni founders non esprimono per niente il transgene dal momento che
l’integrazione avviene nell’eterocromatina, che è silente a causa della
consistente metilazione del DNA
Le sequenze procariotiche devono essere
eliminate per una espressione ottimale
 
Le sequenze procariotiche derivate dal plasmide o dal vettore fagico usato per
replicare il transgene nei batteri possono essere inibitorie e dare fastidio
all’espressione del transgene
 
Quindi, il frammento con il transgene deve essere purificato dal vettore
“contaminante” prima della microiniezione
Possibili ragioni per cui il transgene
non viene espresso
 
L’integrazione può avvenire in zone di silenziamento in cis (equivalenti, in
negativo, agli enhancers) siti di modificazione covalente del DNA (per esempio
metilazione) che potrebbero avere una condensazione da cromatina inattiva
(fase dei nucleosomi)
 
La perdita, non voluta, di alcune sequenze regolatrici durante la produzione dei
costrutti (zone di binding alla topoisomerasi, siti di legame nucleo matrice)
 
L’uso del cDNA invece del DNA genomico (gli introni potrebbero contribuire alla
stabilità dell’mRNA e potrebbero anche contenere sequenze essenziali per
l’espressione tessuto-specifica; regioni di DNA fiancheggianti un gene
potrebbero contenere sequenze regolatrici)
+
Cosa è un topo knock out?
Un topo geneticamente modificato nel quale viene soppressa
l’espressione di uno specifico gene endogeno (il gene è stato
knocked out)
Mario R Capecchi, Martin J Evans
e Oliver Smithies
Conosciuti per la tecnica della ricombinazione
omologa fra DNA transgenico e DNA genomico, un
metodo utile ad alterare il genoma animale e più
attendibile di quelli usati prima.
Martin J Evans
Capecchi ha anche fatto un’analisi sitematica
della famiglia murina dei geni Hox: questa famiglia
genica ha un ruolo fondamentale nel controllo
dello sviluppo embrionale di tutti gli organismi
multicellulari
Sir Martin John Evans è uno scienziato inglese
che, insieme a Matthew Kaufman, pensò di usare
blastocisti di topo per ottenere cellule staminali
embrionali da mantenere in coltura in laboratorio
(1981). Insieme a Capecchi e Oliver Smithies,
altro scienziato inglese cresciuto negli US, è
conosciuto per il lavoro fatto per mettere a punto
il topo knockout e la tecnologia importante per il
gene targeting, un metodo in cui si usano cellule
staminali embrionali per creare modificazioni nei
geni del topo.
Nel 2007 ricevono il Premio Nobel in Medicina
Oliver Smithies
Mario Ramberg Capecchi
Perché usare un topo knock out?
 
Si possono studiare gli effetti dei prodotti genici, le pathways biochimiche, le
pathways alternative (compensatorie) e le pathways di sviluppo
 
Si possono studiare le malattie umane in animali, stabilire modelli per testare
gli effetti benefici di trattamenti medici o terapia genica
Come generare un topo knock out
 
L’alterazione genica nel topo KO è “indirizzata” a geni specifici
 
Il DNA esogeno si deve integrare in una posizione precisa del genoma
 
L’integrazione del gene “modificato” avviene nelle cellule staminali embrionali
ex vivo
 
Bisogna verificare l’esatto sito di integrazione prima che le ES cells vengano
introdotte nella blastocisti e diventino parte dell’embrione in sviluppo
Si utilizzano le cellule staminali embrionali
(Embryonic Stem cells; ES cells)
Le ES cells sono la parte
della blastocisti di mammifero
che darà luogo all’embrione
Le ES cells sono pluripotenti
ovvero possono dare origine a tutti gli
istotipi dell’organismo
Cellule ES pluripotenti
 
Le ES cells sono cellule pluripotenti, indifferenziate, derivate da cellule
embrionali precoci (cellule della massa interna della blastocisti di topo)
 
Le ES cells vengono mantenute in coltura, in vitro, sopra uno strato di
fibroblasti feeder per evitare che differenzino
 
L’introduzione del transgene può avvenire per elettroporazione o infezione
retrovirale
 
Il transgene si deve integrare per ricombinazione e non in maniera casuale
 
Le cellule trasfettate con successo possono essere identificate prima
dell’iniezione nella blastocisti accettrice
Gene targeting nelle ES cells
 
Il gene targeting si ottiene usando dei costrutti disegnati per la ricombinazione
omologa. Questa tecnica può essere usata per
- 
Il Knockout funzionale dei geni per studiare il loro contributo ai diversi stadi
embrionali o processi patologici (mutazioni null)
- 
Rimpiazzare un gene mutato/non funzionante con un gene funzionante per
ripristinare il fenotipo wild type
Le ES cells possono essere modificate
(inserendo DNA nel loro genoma)
rimanendo pluripotenti
-Trasfezione
- Elettroporazione
La trasfezione
Diversi tipi di sostanze chimiche
sono in grado di legarsi al Dna
e ne mediano l’ingresso
nella cellula
Il DNA entra nella cellula
mediante sostanze chimiche
che alterano la permeabilità
della membrana
L’elettroporazione
Il DNA entra nella cellula mediante una scarica elettrica controllata
che altera la permeabilità della membrana
Costrutti di DNA per la ricombinazione
 
I vettori di DNA usati per generare KO hanno il gene di interesse interrotto dal
gene per la resistenza ad un antibiotico (igromicina o G418/geneticina)
 
Per ottenere l’integrazione “indirizzata” avvenga le regioni che fiancheggiano il
DNA contengono il gene per la timidina chinasi (TK) come marker. Se la TK si
integra (integrazione casuale), allora le cellule trasfettate muoiono quando
vengono mantenute in un terreno selettivo (gancyclovir)
Selezione delle ES cells
 
Le ES cells resistenti al Gancyclovir e a G418 crescono in piccoli “grumi” sopra
delle cellule feeder
 
Le colonie possono essere “picked” e trasferite in nuove piastre che contengono
cellule feeder
 
Quando si ha il numero sufficiente di cellule:
 
- 
Si congelano per sicurezza
- 
Si analizzano per Southern blotting o PCR per determinare la natura
dell’evento di integrazione
Si microiniettano nel blastocele, la cavità della blastocisti
Le ES cells modificate possono essere
reinserite nella blastocisti
tramite microiniezione
E’ dunque necessario
selezionare la progenie per
otterere topi con un
genotipo omogeneo
eterozigote o omozigote
Il topo chimerico (P1) è
eterozigote per la
mutazione o non la porta
Conseguentemente, qualora
la chimera sia eterozigote,
in P2 ci saranno
eterozigoti o wt
In P3 l’assortimento
genotipico segue le regole
mendeliane per l’incrocio
tra due eterozigoti
Dove si deve inserire il DNA nella cellula?
- Nei transgenici il DNA può inserirsi casualmente nel genoma
ospite (a patto che non modifichi altri geni o sia silenziato)
- Nel “gene Knock-out” il DNA deve ricombinare esattamente con la
copia del medesimo gene del genoma ospite
Metodi per inserire un transgene
Differenza fondamentale
tra l’uso delle ES cells
e delle cellule della linea germinale
Chimera
L’animale generato possiede solo in alcuni tessuti il transgene o la copia non
funzionale del gene (quelli derivati dalle ES cells modificate e reinserite);
viene pertanto detto“chimera”. Solo le chimere che avranno incorporato la
copia genica nella linea germinale potranno passarla alle generazioni future
Esempi di animali Knock-out:
Il topo Knock-out di p53