la tecnologia microarray - W W W . T E L E S A . ORG

XIX CORSO NAZIONALE PER TECNICI DI
LABORATORIO BIOMEDICO
Riccione, 22-25 Maggio 2012
LA TECNOLOGIA
MICROARRAY
Dott.ssa Maria Rosaria Sapienza
Laboratorio di Patologia Molecolare, Sezione di Emolinfopatologia,
Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche "L. and A. Seràgnoli",
Ospedale S. Orsola Malpighi, Università di Bologna
LA RIVOLUZIONE MICROARRAY
15 FEBRUARY 1991
Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D.
Light-directed, spatially addressable parallel chemical
synthesis
LA NASCITA DELLA GENOMICA
PRIMA
MOLTI ESPERIMENTI
1 GENE
LA NASCITA DELLA GENOMICA
PRIMA
MOLTI ESPERIMENTI
1 GENE
DOPO
1 ESPERIMENTO
TUTTI I GENI DI UN INTERO
ORGANISMO
COSA E’ UN MICROARRAY
• MATERIALE: Supporto di silicio, vetro
o plastica
• SONDE: frammenti di DNA che rappresentano
una specifica regione del genoma umano/uno
specifico trascritto
• TECNICA DI IBRIDAZIONE INVERSA: acido
nucleico di partenza marcato con fluoroforo
• PRINCIPALI AZIENDE PRODUTTRICI: Affymetrix,
Illumina, Agilent, Applied Biosystem
IL PROFILO GENOMICO
Microarray:
CGH array e SNPs array
Applicazioni:
• ANALISI CARIOTIPO ad altissima risoluzione: anomalie cromosomiche,
numeriche e strutturali (amplificazioni, delezioni, CNV), LOH, UPD,
genotipizzazione
• Identificazione di TARGET TERAPEUTICI e MARCATORI DIAGNOSTICI e
PROGNOSTICI
• STRATIFICAZIONE in diverse CLASSI DI RISCHIO in base a nuovi
indicatori prognostici e alle diverse risposte terapeutiche
• CGH array in ROUTINE DIAGNOSTICA: diagnosi di fenotipi complessi
associati a ritardo mentale e diagnosi pre-natale
IL PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA
Microarray:
U133 plus 2.0, gene array, exon array
Applicazioni:
• Identificazioni ALTERAZIONI DELL’ESPRESSIONE GENICA (geni up e down
regolati) e più comuni VARIANTI di SPLICING
• Identificazione di MARCATORI DIAGNOSTICI e PROGNOSTICI e di TARGET
TERAPEUTICI
• STRATIFICAZIONE DEI PAZIENTI in diverse CLASSI DI RISCHIO in base a
nuovi indicatori prognostici e alle diverse risposte terapeutiche
• Elucidazione dei MECCANISMI ONCOGENETICI
IL PROFILO DI ESPRESSIONE DEI
MICRORNA
Microarray:
Human miRNA Microarray,
GeneChip miRNA 2.0 Array,
miRCURY LNA™ microRNA Arrays
E DELLE PROTEINE
Microarray:
DNA-Protein array
antibody microarray
ESPRESSIONE GENICA DIFFERENZIALE
CAMPIONE TUMORALE
GENE1
GENE2
ON
OFF
GENE3
ON
CONTROLLO SANO
GENE1
GENE2
OFF
ON
mRNA
Profilo
espressione
genica
TUMOR SAMPLE:
HEALTHY SAMPLE:
ACTIN
ON
INSULIN
OFF
CYCLIN1
ON
UBIQUITIN ON
HISTONE2B ON
MELANIN
OFF
ACTIN
OFF
INSULIN
ON
CYCLIN1
OFF
UBIQUITIN OFF
HISTONE2B OFF
MELANIN
ON
GENE3
OFF
GENE EXPRESSION MICROARRAY WORKFLOW
Array U133 plus 2.0 Affymetrix
Ibridazione frammenti RNA marcato
Analisi bioinformatica dei dati
RNA ibridizzato
LA NOSTRA ESPERIENZA
CoreLab Affymetrix
STAZIONE FLUIDICA
SCANNER
MONITOR IBRIDIZZATORE
PREPARAZIONE MICROARRAY DI ESPRESSIONE IN 3 GIORNI U133
plus 2.0 Affymetrix
1. Poly-A RNA Control
Addition
2. First-strand
cDNA Synthesis
1° GIORNO
3. Second-strand
cDNA Synthesis
4. IVT/Labeling
of a RNA
1°OVERNIGHT
PREPARAZIONE MICROARRAY DI ESPRESSIONE IN 3 GIORNI U133
plus 2.0 Affymetrix
5. aRNA Purification
2° GIORNO
6. Fragmentation
7. Hybridization
2°OVERNIGHT
8. Scanning and
acquisition data
3° GIORNO
9. Bioinformatic Analysis
RISULTATI
PLoS One. 2011
SNPs array karyotyping reveals a novel recurrent
20p13 amplification in primary myelofibrosis
Visani G, Sapienza MR, Isidori A, Tripodo C, Laginestra MA, Righi S, Sagramoso Sacchetti CA,
Gazzola A, Mannu C, Rossi M, De Nictolis M, Valentini M, Donati M, Emiliani R, Alesiani F,
Paolini S, Finelli C, Pileri SA, Piccaluga PP.