Devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. E’ essenziale che i reagenti al lattice siano agitati energicamente prima dell’ uso in modo da ottenere una sospensione omogenea delle particelle. Al momento dell’uso il reagente enzimatico deve essere ricostituito con acqua distillata, come indicato in etichetta. Il controllo positivo contiene estratti di tutti i sei gruppi di antigeni. Key Code TSMX3981F www.oxoid.com/ifu Europe + 800 135 79 135 CA 1 855 805 8539 US 1 855 236 0910 ROW +31 20 794 7071 Kit Per L’identificazione Di Gruppo Degli IT Streptococchi 5. SALUTE E SICUREZZA Conservanti 5.1. Ogni reagente al lattice e reagente di controllo positivo contiene 0,1% di sodio azide che è classificato come nocivo in caso di ingestione. 5.2. L’enzima di estrazione contiene l’1,7% di thiomersal e acromopeptidasi al 7,32% che è classificato come tossico e un sensibilizzatore. Di seguito sono riportate le indicazioni appropriate di pericolo (H) e precauzione (P): PERICOLO H332 Nocivo se inalato. H311 Tossico per contatto con la pelle. H301 Tossico se ingerito. H373 Può provocare danni agli organi in caso di esposizione prolungata o. H334 Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato. H317 Può provocare una reazione allergica cutanea. H412 Nocivo per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. P301+P310 IN CASO DI INGESTIONE: contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI o un medico P280 Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso. P302+P352 IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE: lavare abbondantemente con acqua e sapone. P333+P313 In caso di irritazione o eruzione della pelle: consultare un medico. P285 In caso di ventilazione insufficiente utilizzare un apparecchio respiratorio. P260 Non respirare la polvere/i fumi/i gas/ la nebbia/i vapori/gli aerosol. P312 In caso di malessere, contattare un CENTRO ANTIVELENI o un medico. P304+P340 IN CASO DI INALAZIONE: trasportare l’infortunato all’aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. DR0585A............................................50 1. FINALITÀ D’USO Test di agglutinazione al lattice per l’identificazione degli streptococchi di gruppo A, B, C, D, F, G Lancefield1 ha dimostrato che la maggioranza degli streptococchi patogeni possiede carboidrati con caratteristiche antigeniche specifiche che permettono la loro classificazione in gruppi. I differenti antigeni di gruppo possono essere estratti dalle cellule e la loro presenza dimostrata mediante particelle di lattice preventivamente sensibilizzate con anticorpi gruppo-specifici. Le particelle di lattice agglutinano in presenza dell’antigene omologo e rimangono invece in sospensione omogenea in assenza di detto antigene. Il kit Oxoid per la identificazione di gruppo degli streptococchi permette quindi, mediante una semplice reazione di agglutinazione al lattice, di classificare gli streptococchi nei gruppi, A, B, C, D, F, G. L’adozione di un nuovo procedimento di estrazione enzimatica accorcia considerevolmente il tempo richiesto per l’estrazione dell’antigene e ne incrementa la resa, in particolar modo per gli streptococchi di gruppo D. 2. KIT COMPONENTS DR0586G................................ Reagente al lattice gruppo A DR0587G................................ Reagente al lattice gruppo B DR0588G................................ Reagente al lattice gruppo C DR0589G................................ Reagente al lattice gruppo D DR0590G................................ Reagente al lattice gruppo F DR0591G................................ Reagente al lattice gruppo G DR0592G................................ Controllo positivo polivalente DR0593G................................ Enzima per l’estrazione dell’antigene DR0500G................................ Cartoncini di reazione monouso 3. DESCRIZIONE, PREPARAZIONE PER L’USO E RACCOMANDATI CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE Vedi anche le avvertenze e le precauzioni Conservare a 2-8°C al riparo dalla luce. Usare entro la data di scadenza indicata sull'etichetta. Tutti i componenti devono essere conservati a temperatura ambiente (15-28°C) prima dell'uso; mescolare accuratamente per inversione. I componenti del kit sono intercambiabili con i componenti di lotti aventi lo stesso codice. I componenti possono essere acquistati anche singolarmente. 4. PRECAUZIONI Tutti i reagenti sono indicati esclusivamente per uso diagnostico “in vitro”. I reagenti al lattice non devono essere congelati. Preparazione dei reagenti I reagenti al lattice sono pronti per l’uso. 6. CONSERVAZIONE A. Reagenti al lattice Tutti i flaconi di lattice devono essere conservati in posizione verticale a 2-8°C. In queste condizioni mantengono la loro validità sino alla data riportata in etichetta. B. Enzima per l’estrazione L’enzima di estrazione, allo stato liofilo, deve essere conservato a 2-25°C. In queste condizioni conserva la sua attività sino alla data riportata in etichetta. Dopo ricostituzione con acqua distillata, conservare la soluzione a 2-8°C. In queste condizioni rimane stabile per 4 mesi. CONTROL + C. Controllo positivo Conservare il controllo positivo polivalente a 2-8°C. In queste condizioni mantiene la sua validatà sino alla data indicata in etichetta. 7. PREPARATION OF CULTURES Samples for identification should be grown on a blood agar plate overnight at 37°C. Note the haemolytic reaction of suspect colonies. It is also advisable to carry out a Gram stain and catalase test to confirm the presence of Grampositive, catalase-negative cocci. For further details, please consult standard texts.2 For each culture to be grouped: 7.1. Reconstitute a bottle of Oxoid Streptococcus Extraction Enzyme (DR593) with sterile distilled water to the amount shown on the label. Label test tubes appropriately and dispense 0.4 ml of enzyme into each test tube. 7.2. Select 2-5 test colonies equivalent to 2-3 mm of growth with a bacteriological loop and emulsify in the enzyme preparation. If the culture is mixed, avoid obvious contamination. 8. PREPARAZIONE DELLE COLTURE I campioni da sottoporre ad identificazione devono essere coltivati a 37°C per una notte su un terreno agarizzato al sangue. Prendere nota della reazione emolitica delle colonie sospette. E’ consigliabile inoltre eseguire una colorazione di Gram ed il test della catalasi per confermare la presenza di cocchi Gram-positivi, catalasi-negativi. Per ulteriori dettagli consultare sull’argomento i testi classici.2 Per ogni coltura da sottoporre ad identificazione di gruppo: 8.1. Ricostituire un flacone di enzima di estrazione Streptococcus Extraction Enzyme Oxoid (DR593), aggiungendo la quantità di acqua distillata sterile riportata sulla etichetta. Contraddistinguere opportunamente le provette e distribuire in ciascuna di esse 0.4ml di enzima. 8.2. Prelevare 2-5 colonie di 2-3mm di diametro con un’ansa da batteriologia e stemperarle nella soluzione enzimatica. In caso di coltura non pura evitare di prelevare le colonie inquinanti. 8.3. Incubare per 10 minuti a 37°C in bagnomaria. E’ importante che, dopo i primi 5 minuti di incubazione, le provette vengano agitate vigorosamente per 2-3 secondi; continuare quindi l’incubazione per il tempo previsto a 37oC. Quindi rimuovere le provette e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente.L’estratto è ora pronto per l’uso. 9. ESECUZIONE DEL TEST 9.1. Portare i reagenti al lattice a temperatura ambiente, eventualmente riscaldando i flaconi con le mani. Agitare vigorosamente le sospensioni al lattice per assicurare l’omogeneità delle sospensioni. Eliminare il lattice eventualmente trattenuto nel contagocce al fine di ottenere una miscelazione ottimale. 9.2. Distribuire una goccia di ognuno dei reagenti al lattice all’interno delle aree circolari predisposte sul cartoncino di reazione (DR 500). 9.3. Con una pipetta Pasteur aggiungere una goccia di estratto ad ognuna delle sei aree evidenziate sul cartoncino di reazione. 9.4. Servendosi dei bastoncini per la miscelazione, distribuire la miscela reattiva in tutta l’area di reazione. Utilizzare un bastoncino nuovo per ogni area di reazione. 9.5. Ruotare delicatamente il cartoncino. L’eventuale agglutinazione, in una o più aree di reazione, deve avvenire entro 30 secondi. Non ruotare il cartoncino per più di 1 minuto. Non utilizzare lenti di ingrandimento per la lettura. 9.6. Usare il controllo positivo secondo le istruzioni sopra riportate per assicurarsi dell’efficacia dei reagenti al lattice in uso. 9.7. Eliminare i cartoncini utilizzati in una soluzione disinfettante. 9.8. Qualora si debba eseguire un limitato numero di test, i cartoncini possono essere tagliati con le forbici. Conservare le porzioni non utilizzate per ulteriori determinazioni. 10. CONTROLLO DI QUALITÀ Le prove di controllo qualità dovrebbero essere eseguite su ogni spedizione e ogni nuovo numero di lotto dei kit ricevuti. Ogni laboratorio è tenuto a seguire le disposizioni locali e statali vigenti nel proprio Paese. Possono essere adottate le seguenti procedure per controllare le performance dei reagenti al lattice: a)Test per la reattività delle sospensioni di lattice (procedura di controllo positivo) Per un singolo test: Dispensare una goccia (40µl) di antigene di controllo positivo sulla carta di test e miscelare con la sospensione di lattice. Miscelare il contenuto del cerchio con una bacchetta di miscelazione nuova. Dopo una leggera oscillazione della carta per un minuto, dovrebbe apparire una distinta agglutinazione in tutti i reagenti al lattice di test. b)Test per la specificità dell’agglutinazione (procedura di controllo negativo) In caso di debolissima agglutinazione, è opportuno ripetere i test positivi in parallelo con una goccia di un estratto preparato (come descritto nella procedura di test su terreni di coltura solidi) con una bacchetta di miscelazione senza inoculo o con un’ansa da inoculo. La sospensione di lattice non dovrebbe mostrare una significativa agglutinazione e il risultato può servire da controllo per la comparazione diretta del test eseguito con estratto batterico. c)Attuare la procedura completa di test sulle colture di riferimento dei gruppi noti. Reazione negativa sul cartoncino ß-emolitico α o non emolitico Ripetere l’estrazione su un numero maggiore di colonie Saggiare con bile-esculina ed in brodo contenente il 6.5% di NaCl Ripetere il test +/+ +/- Gruppo D Gruppo D enterococcob non-enterococco Se negativo “Non gruppo A, B, C, D, F o G” -/Streptococchi viridanti Reazione positiva sul cartoncino ß-emolitico Non ß-emolitico Reagisce unicamente Reagisce con il Positivo con più di un con il reagente A, B, reagente D reagente C, F o G Riportare il gruppo Test in brodo contenente il 6.5% di NaCl Eseguire una sottocoltura quindi risaggiare Crescita (+) Gruppo D enterococco Crescita (–) Gruppo D non enterococco Se il problema non si risolve eseguire prove biochimiche di identificazionee Reagisce con il reagente B Reagisce con il reagente D Reagisce con il reagente A, C, F o G Gruppo B non emolitico Saggiare con bileesculina ed in brodo contenente il 6.5% di NaCl Eseguire prove biochimiche di identificazione +/+ Gruppo D enterococcob +/Gruppo D non enterococco -/Streptococchi viridanti 11. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Reazione positiva: presenza di agglutinazione evidente con uno dei sei reagenti o quando uno di questi mostra una reazione più forte rispetto agli altri. Reazione negativa: assenza di agglutinazione.Ignorare nella lettura le deboli granulazioniche possono, a volte, essere presenti. 12. LIMITAZIONI DEL TEST Utilizzando una inadeguata quantità di coltura il test può dare risultati falsamente negativi. Quasi tutti gli streptococchi beta-emolitici isolati nel corso di infezioni umane possiedono carboidrati con caratteristiche antigeniche specifiche che permettono il loro riconoscimento mediante reazionisierologiche. I tentativi per estendere queste procedure agli streptococchi non beta-emolitici sono stati infruttuosi, fatta eccezione per gli streptococchi di gruppo B,D ed N. Gli streptococchi di gruppo N non sono stati mai riconosciuti quali responsabili di infezioni umane.5 E’ da notare che il reagente al lattice di gruppo D può non reagire con alcuni ceppi di S. bovis: per l’dentificazione di tali ceppi possono rendersi necessari ulteriori test. Il seguente schema riassume la procedura raccomandata per I’dentificazione degli streptococchi mediante l’impiego del test di agglutinazione al lattice Oxoid. Se negativo “Non gruppo A, B, C, D, F o G” Nell’identificazione sierologica degli streptococchi è necessario, inizialmente, eseguire le seguenti osservazioni: (i) presenza di emolisi;a,c (ii) morfologia cellulare;b,c (iii) valutazione della crescita delle colonie per quanto concerne la purezza e la quantità.d (a) Escludere Strep. pneumoniae. Questo streptococco è α-emolitico, solubile ai sali biliari e sensibile all’optochina. Gli altri streptococchi non sono solubili ai sali biliari e sono resistenti all’optochina.5 (b) Gli aerococchi non sono ß-emolitici, crescono in brodo contenente il 6.5% di NaCl e danno reazione variabile con il test bile-esculina. Possono essere differenziati dagli enterococchi poichè si dispongono in tetradi o in cellule isolate, mentre gli enterococchi assumono configurazione a diplococco o a corta catena.5 (c) Gli stafilococchi e Listeria monocytogenes sono ß-emolitici: si distinguono dagli streptococchi per la morfologia delle colonie e per la reazione alla catalasi.6,7 (d) Eseguire una sottocoltura se il microrganismo sospetto evidenzia una sovracrescita o si è sviluppato in modo insufficiente. (e) Sono stati rilevati ceppi che possiedono entrambi gli antigeni D e G.4 Caratteristiche del metodo Di recente è stata migliorata la formulazione del reagente dell’enzima di estrazione. Le prestazioni di Oxoid Streptococcal Grouping Kit con il nuovo enzima sono state valutate presso un centro clinico nell’ Australia del Sud. La tabella sotto riportata riassume i risultati ottenuti. Sensibilità e specificità dei Streptococcal Grouping Kit Sensitivity and specificity of Streptococcal Grouping Kits * All strains were tested with each of the six grouping reagents 1 A number of Lancefield Group D organisms yielded a D/G reaction. These results have been included in the calculations as true positive Group Ds and false positive Group Gs. It is acknowledged in literature that Group D strains exist which also yield G antigens upon enzymatic extraction. 13. REFERENCES 1. Lancefield R.C. (1938) Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 38, 473. 2. Facklam R.R. (1980) in ‘Manual of Clinical Microbiology’, 3rd Edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 88-110. 3. McIllmurray M.B. (1984) Lancet, I, 1353. 4. Birch B.R., Keaney M.G.L. and Ganguli L.A. (1984) Lancet, I, 856-857. 5. Facklam R.R. and Carey R.B. (1985) in ‘Manual of Clinical Microbiology’, 4th Edition. Eds. Lennette E.H., Balows A., Hausler W.J., Shadomy H.J., Amer. Soc. for Microbiol., Washington, D.C., pp. 154-175. 6. Kloos W.E. and Jorgensen J.H. (1985) in ‘Manual of Clinical Microbiology’, 4th Edition, pp. 143-153. 7. Bortolussi R., Schlech W.F. and Albritton W.L. (1985) in ‘Manual of Clinical Microbiology’, 4th Edition, pp. 205-208. 14. SIMBOLO LEGGENDA Numero catalogo Dispositivo medico per la diagnostica in vitro Fare riferimento alle Istruzioni per l’uso Limiti di temperatura (temp. di conservazione) N Contenuto sufficiente per "n" saggi Numero lotto Data di scadenza Prodotto da Oxoid Ltd, Wade Road, Basingstoke Hants RG24 8PW, UK IFU X3981F, Revisione Maggio 2016 Per l’assistenza tecnica rivolgersi al distributore locale Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Oxoid Dryspot Streptococcal Grouping Kit e reagente per estrazione Kit e reagente per estrazione enzimatica ORIGINALE enzimatica MIGLIORATO Ceppi testati* Kit competitore gruppo Lancefield No. SENSITIVITY % SPECIFICITY % SENSITIVITY % SPECIFICITY % SENSITIVITY % SPECIFICITY % Nessuno 56 Non Disponibile 99.4 Non Disponibile 99.1 Non Disponibile 99.4 A 30 100 100 100 100 100 100 B 29 100 100 100 100 100 100 C 30 96.6 99.5 96.6 99.5 96.6 99.5 83.7 100 92 99.7 63.3 100 92 99.4 92 99.4 92 99.4 D (Streptococchi) 2 D (NonStreptococchi) 47 F 25 1 1 G 32 100 94.7 100 95.2 100 96 TOTALE 251 94.3 98.9 96.4 98.9 89.2 99.2 * Tutti i ceppi sono stati testati con ciascuno dei sei reagenti di gruppo. 1 Una serie di organismi di gruppo D di Lancefield ha fornito una reazione D/G. Tali risultati sono stati inclusi nei calcoli come veri positivi di gruppo D e falsi positivi di gruppo G. In letteratura è nota l’esistenza di ceppi del gruppo D che producono antigeni di gruppo G quando utilizzati con la tecnica di estrazione enzimatica.