Esemplare certificato conforme Zagabria, il 3 luglio 2009 Il

RISOLUZIONE OIV/ENO 351/2009
DETERMINAZIONE DELLA CAPACITÀ DI UN PREPARATO ENZIMATICO DI ROMPERE LE CATENE
PECTICHE TRAMITE LA MISURAZIONE DELLA VISCOSITÀ
L'ASSEMBLEA GENERALE
Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell’accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione
dell’organizzazione internazionale della vite e del vino,
Su proposta della Sotto-Commissione «Metodi di analisi» e del gruppo di esperti «Specifiche
dei prodotti enologici»,
DECIDE, su proposta della commissione II «Enologia» , di integrare il Capitolo II della
Farmacopea enologica internazionale con le seguenti tecniche analitiche e di controllo:
1. PRINCIPIO
Ci si propone in questa sede di misurare la quantità di enzima necessario per ridurre della
metà la viscosità di una soluzione standard, in condizioni determinate di pH, di temperatura e
di tempo.
E’ una misurazione puramente tecnologica destinata a provare l’efficacia chiarificante reale
dell’enzima. Rende conto essenzialmente dell’attività pectinasi che non può essere dedotta
direttamente dalla liberazione dell’acido galatturonico nel mezzo.
Nota
Per misurare l’attività dell’enzima, si possono adottare due approcci:
- Sia il tempo che impiega una data concentrazione di enzima affinché la viscosità della
soluzione di pectina diminuisca della metà,
- Sia la concentrazione necessaria di enzima affinché la viscosità della soluzione di
pectina diminuisca della metà in un determinato tempo.
Test dimostrano che, finché il substrato non è limitante:
- nel primo caso, il logaritmo della viscosità (tempo di scorrimento) è inversamente
proporzionale al tempo di reazione e,
- nel secondo caso, il logaritmo della viscosità è inversamente proporzionale alla
quantità di enzima nell’ambiente.
In un caso come nell’altro, è facile trovare sia il tempo, sia la quantità di enzima necessaria
per ridurre la viscosità della metà a partire da una curva oculatamente scelta.
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2. CONDIZIONI DELLA REAZIONE
Ambiente tampone fosfato 70 mmol/l e citrato 30 mmol/l
Substrato: Pectina di mela esterificata al 70-75 % (per es.: Sigma P 8471), diluita a 10 g/l
nel tampone.
pH = 3,5
Temperatura: 30 °C
Tempo di reazione: 15 minuti.
Pectinasi: gamma di concentrazioni che racchiudono circa 10 mg/l di peso secco di enzima nel
campione, per esempio 0,5 mg nei 50 ml di substrato. Questo corrisponde alla quantità di
enzima in grado di fare diminuire la viscosità del substrato della metà in 15 minuti nelle
condizioni descritte qui sopra.
3. APPARECCHIATURA
3.1 Termostato a bagno o a circolazione d’acqua a 30 °C ± 1°C
3.2 Viscosimetro a scorrimento (A.3.1: Fig. 2) con un valore d’acqua – vale a dire il tempo di
scorrimento dell’acqua tra i due contrassegni – da 18 a 20 secondi circa (ossia un
capillare del diametro compreso tra 0,5 e 0,6 mm circa)
3.3 Cronometro
3.4 Bilancia analitica (precisione 0,001 g)
3.5 pH-metro
3.6 Agitatore magnetico, vetreria tradizionale di laboratorio.
3.7 Filtri rapidi in carta
3.8 Micropipette o microsiringhe che permettono di iniettare volumi da 5 a 500 µl.
4. PRODOTTI PURI
4.1 Acido citrico puro (99,5 %)
4.2 Idrogenofosfato di sodio diidrato puro (Na2 HPO4·2H2O) (99,0 %)
4.3 Pectina di mela esterificata al 70-75 % di purezza superiore al 90 % (per es.: Sigma P
8471),
4.4 Acqua distillata o deionizzata
4.5 Idrossido di sodio puro (98 %)
4.6 Acido cloridrico puro (11,5 M) (33,5 %)
4.7 Pectinasi della quale occorre misurare l’attività.
5. SOLUZIONI
Ogni soluzione deve sempre sempre omogeneata prima dell’uso
5.1 Idrossido di sodio 2 M
Pesare 80 g di idrossido di sodio puro (4.5) in un matraccio graduato da 100 ml, sciogliere
nell’acqua deionizzata (4.4) e portare a volume dopo la dissoluzione completa e il
raffreddamento.
5.2 Acido Cloridrico 2 M
In una fiala graduata da 100 ml riempita a metà con acqua deionizzata mettere la quantità
sufficiente di acido cloridrico puro (4.6) per ottenere una soluzione finale 2 M, (dopo aver
portato a volume)
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5.3 Tampone fosfato 47 mmol/l, citrato 53 mmol/l, pH 3,5
5.3.1 Mettere 800 ml di acqua deionizzata (4.4) in un pallone graduato da 1000 ml
5.3.2 Pesare 11,22 g d'acido citrico (4.1)
5.3.3 Pesare 8,30 g di idrogenofosfato di sodio diidrato puro (Na2 HPO4·2H2O) (4.2)
5.3.4 Trasferire i prodotti chimici pesati quantitativamente nel pallone graduato da 1000 ml
sempre rimescolando
5.3.5 Mescolare fino all’intera dissoluzione
5.3.6 Aggiustare il pH a 3,50 ± 0,05, alla temperatura ambiente, con idrossido di sodio 2 M
(5.1), o acido cloridrico 2 M (5.2) secondo il pH iniziale
5.3.7 Portare a volume con acqua deionizzata (4.4). Mescolare
Stabilità: 8 giorni a temperatura ambiente.
5.4. Substrato: Pectina di mela (4.3),
5.4.1 Mettere un recipiente cilindrico da 400 ml in un bagno d’acqua regolato a 40 °C ± 3°C
su un agitatore rotante
5.4.2 Aggiungere 250 ml di tampone a pH 3,5 (5.3), esattamente misurato, nel recipiente
cilindrico
5.4.3 Agitare delicatamente a 40 °C
5.4.4 Pesare 2,500 g ± 0,01 g di pectina (4.3)
5.4.5 Aggiungere lentamente la pectina agitando energicamente
5.4.6 Poi agitare lentamente per 60 minuti mantenendo la temperatura a 40 °C
5.4.7 Smettere di rimescolare e raffreddare a 30 °C ± 3 °C
5.4.8 Filtrare su carta filtro rapida (3.8) se necessario (presenza di grumi)
Stabilità: 24 ore a temperatura ambiente.
5.5 Soluzione di pectinasi a 100 g/l di peso secco (4.7)
5.5.1 Pesare 2,50 g ±0,01 g di pectinasi in polvere o granulato
5.5.2 Trasferire in un pallone graduato da 25 ml
5.5.3 Portare a volume con iltampone a pH 3,5 (5.3)
5.5.4 Sciogliere per agitazione per 20 minuti su agitatore magnetico
Filtrare su carta filtro rapida se l’enzima è immobilizzato su un materiale insolubile con l’aiuto
di un filtro rapido
5.5.5 Nel caso di preparazione enzimatica liquida, utilizzare direttamente quest’ultima.
Stabilità: 4 ore a temperatura ambiente.
6. MISURE
6.1 Mettere il viscosimetro nel bagno d’acqua a 30°C o utilizzare qualsiasi dispositivo che
permetta di misurare la viscosità a 30°C.
6.2 Misurare la viscosità (in effetti il tempo di scorrimento tra i due tratti del viscosimetro)
della soluzione tampone a pH 3,5, ovvero to. Questo tempo deve essere vicino ai 20 secondi
per un capillare da 0,5 a 0,6 mm di diametro.
6.3 Misurare il tempo di scorrimento della soluzione di pectina a 10 g/l ossia Tp, questo tempo
deve essere dell’ordine di 200 secondi o più.
6.4 Preparare una serie di 4 palloni graduati contenenti 50 ml di pectina da 10 g/l, metterli in
un bagno d’acqua a 30°C.
6.5 Aggiungere nel primo pallone 5µl della soluzione di enzima avente concentrazione 100 g/l,
omogeneizzare. Poi, ogni 15 minuti circa, aggiungere successivamente negli altri palloni:
15 µl, 35 µl e infine 100 µl della soluzione di enzima avente concentrazione 100 g/l,
omogeneizzare.
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6.6 Cronometrare il tempo di scorrimemento delle differenti soluzioni tra i due tratti del
viscosimetro esattamente 15 minuti dopo l’aggiunta di enzima.
7. RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEI VALORI MISURATI
Detrarre dal tempo di scorrimento il valore to corrispondente al solo tampone con pH 3,5.
Tracciare il grafico rappresentante il logaritmo del tempo di scorrimento in funzione della
concentrazione dell’enzima.
Devono esserci almeno tre punti allineati corrispondenti alle diluizioni più forti. Se questo non
avviene, utilizzare una soluzione di enzima più diluita, per esempio a 50 g/l o anche a 10 g/l.
8. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Ricercare l’equazione della retta di regressione passante per i tre punti allineati:
T = ax + b
Da essa dedurre la concentrazione di enzima C necessaria perché la viscosità della soluzione
di pectina diminuisca della metà (Tp - to)/2 ovvero T0,5.
9. ESEMPI
9.1 Determinazione della concentrazione di enzima necessaria perché la viscosità della
soluzione di pectina diminuisca della metà. (Tabella 1)
Tempo di scorrimento del solo tampone to = 19,3 s
Tabella 1:
Concentrazione
Tempo di
Vol (µl) di enzima
(g/l)
scorrimento (s)
con 100g/l /50 ml di
pectina
Tempo corretto
(s)
Log Tempo
corretto
0
0
230 (Tp)
210,7 (Tp - to)
5
0,01
190
170,7
25
0,05
107
87,7
100
0,2
32,8
13,5
500
1
23,8
4,5
Tempo corretto = tempo di scorrimento – tempo di scorrimento del tampone
* valore non considerato
equazione della retta di regressione (fig. 1) y = -5,8366 +2,2844
2,32
2,23
1,94
1,13
0,65*
con pH 3,5
(Tp - to) /2 = 105 s.
Log 105 = 2,02 → C = (2,28-2,02)/5,84 = 0,044
Occorrono quindi 0,044 g/l di enzima per diminuire della metà la viscosità di una soluzione di
pectina di mela con concentrazione 10 g/l a 30°C per 15 minuti.
Si constata che 1 g/l di enzima ha permesso di ridurre praticamente del tutto la viscosità della
soluzione di pectina in 15 minuti.
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Log tempo di scorrimento
2,4
2,2
2
1,8
1,6
1,4
y = -5,8366x + 2,2844
1,2
1
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Enzim a (g/l)
Fig.1 Diminuzione della viscosità di una soluzione di
pectina in funzione della concentrazione in enzima
9.2 Riduzione della viscosità di una soluzione di pectina alla concentrazione di 10 g/l in
funzione del tempo di reazione a 30°C di un enzima alla concentrazione di 0,1 g/l. (fig. 2) –
A titolo di informazione
Il tempo di scorrimento del tampone è di 19,6 s.
Tabella 2:
Tempo di
reazione
(mn)
Tempo di
scorrimento
(s)
Tempo di
scorrimento
corretto*
(s)
150,7 (Tp - to)
82,1
66,7
53,5
40,53
29,49
20,78
12,95
6,95
Log del tempo
di scorrimento
0
170 (Tp)
2,18
11,5
101,4
1,91
15,6
86
1,82
21,08
72,8
1,73
29
59,83
1,61
40,31
48,79
1,47
57
40,08
1,32
90
32,25**
1,11
167
26,25**
0,84
* Tempo di scorrimento corretto
**valori non presi in considerazione, in quanto la quantità di pectina
rimanente limita la reazione
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2,2
140
2,1
120
2
Log tempo d i sco rrimento
Tem po di scorrimento
160
100
80
60
40
20
0
0
50
100
150
1,9
1,8
1,7
y = -0,0197x + 2,1546
1,6
1,5
0
Tempo d i reazione (min )
Fig. 2. Evoluzione della viscosità di una
soluzione di pectina da 10 g/l in funzione del
tempo di reazione di un enzima a 0,1 g/l a
30 °C
10
20
30
Temp o di reazione (min)
Fig.3. Evoluzione della viscosità di una
soluzione di pectina da 10 g/l in funzione del
logaritmo tempo di reazione di un enzima a
0,1 g/l a 30 °C.
Interpretazione dei risultati
I valori della tabella 2 dimostrano che occorre una durata di reazione T/2 di 13,3 minuti per
ridurre della metà la viscosità della soluzione di pectina da 10 g/l a 30°C.
Con il calcolo, a partire dalla retta di regressione della fig. 3:
Log75,35 = 1,877
da cui T0/2 = (2,1545 - 1,877 )/0,0197 =14,1 minuti.
10. BIBLIOGRAFIA
Bertrand A. détermination de la capacité d'une préparation enzymatique de type
polygalacturonase a couper les chaines pectiques par la mesure de la viscosité. OIV FV 1260.
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