DISS. ETH NO. 22122
The role of germline residues and redundant somatic mutations in the
development of broadly influenza neutralizing antibodies
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
Presented by
LEONTIOS PAPPAS
MSc, University of Oxford
Born on 18.02.1987
Citizen of Greece
Accepted on the recommendation of
Professor Dr. Antonio Lanzavecchia, examiner
Dr. Federica Sallusto, co-examiner
Professor Dr. Annette Oxenius, co-examiner
Professor Dr. Antonius Rolink, co-examiner
2014
1.1 English Summary
Influenza virus is responsible for 3.5-5 million cases of severe disease and
300,000-500,000 deaths annually[1, 2]. The neutralizing antibody response to
influenza is dominated by antibodies that bind to the globular head of the
hemagglutinin (HA), which undergoes a continuous antigenic drift, necessitating the
re-formulation of influenza vaccines on a yearly basis. Recently, several laboratories
have described a new class of rare influenza-neutralizing antibodies that target a
conserved site in the HA stem[3-8]. Although such broadly neutralizing antibodies
have the capacity for effectively neutralizing multiple different strains of the virus, to
date there is little knowledge on how these antibodies develop. This study has
attempted to address this issue by dissecting the evolutionary pathways broadly
influenza neutralizing antibodies follow as a result of affinity maturation.
Most anti-HA stem antibodies use the heavy chain variable region VH1-69
gene, and structural data demonstrate that they bind through conserved heavy chain
complementarity determining region (HCDR) residues. However, the VH1-69
antibodies are highly mutated and are produced by several but not all individuals[8,
9], suggesting that multiple somatic mutations may be required for their
development[10]. By analyzing 197 anti-stem antibodies from a single donor, the
developmental pathways of several VH1-69 clones were reconstructed and two key
elements that are required for the initial development of most VH1-69 antibodies
were identified: a polymorphic germline-encoded F at position 54 and a conserved Y
at position 98 in the HCDR3. Strikingly, in most cases a single P52aA mutation in the
HCDR2 was sufficient to confer high affinity binding to the selecting H1 antigen,
consistent with rapid affinity maturation. Surprisingly, additional favorable mutations
continued to accumulate, increasing the breadth of reactivity and making the initial
mutations, and even F54, redundant. These results define VH allele polymorphism,
the VDJ rearrangement and single somatic mutations as the three requirements for the
generation of broadly neutralizing VH1-69 antibodies, and reveal an unexpected
redundancy in the affinity maturation process.
By reconstructing the genealogy trees of several influenza-specific human B
cell clones, two distinct evolutionary pathways leading to broadly VH1-69 influenza
neutralizing antibodies were identified. Those bearing Y98 in their HCDR3
preferentially accumulate a P52aA/G mutation in the HCDR2. In contrast, antibodies
without Y98 do not mutate the germline P52a residue and follow maturation
7
pathways via distinct substitutions in the HCDR1. Finally, this study elucidates the
definitive role of the HCDR3 in determining whether different amino acid
substitutions have a positive or neutral role in antigen binding on a particular antibody
scaffold. This finding is especially relevant for identifying substitutions that may
confer broad binding reactivity. The broadly neutralizing CR9114 antibody requires 8
amino acid substitutions in order to bind to Influenza A group 1 and 2 and Influenza
B strains, which do not necessarily confer the same breadth of binding on different
HCDR3 scaffolds. Taken together, these results demonstrate that the HCDR3 is
important not only for defining the antigenic reactivity of naïve B cells, but it also
constrains the maturation pathways a clone may follow to achieve broad, high affinity
binding.
This work has significantly advanced our understanding of how antibodies
target the HA stem, by identifying the substitutions which have been selected to
confer binding as the result of antigen-driven affinity maturation in the human
antibody response. Such knowledge is critical for informing the design of HA stembased immunogens capable of eliciting antibodies of similar breadth and potency.
Potent, broadly neutralizing antibodies play a key role for informing structurallyguided vaccine design, an approach that was recently applied for determining a
promising vaccine candidate for Respiratory Syncytial Virus[11]. We hope that the
novel findings on the maturation process of broadly neutralizing anti-stem antibodies
presented in this study may eventually assist in the development of a universal
influenza vaccine.
1.2 Riassunto in Italiano
Il virus dell’influenza è responsabile di 3,5-5 milioni di casi di gravi malattie
e di 300.000-500.000 morti ogni anno [1, 2]. La risposta anticorpale neutralizzante nei
confronti del virus dell’influenza è costituita prevalentemente da anticorpi diretti
contro la testa globulare dell’emagglutinina (HA), la quale va incontro a continue
mutazioni antigeniche, per cui è necessario riformulare i vaccini annualmente.
Recentemente, diversi laboratori hanno descritto una nuova classe di rari anticorpi
neutralizzanti il virus dell’influenza che sono diretti contro un sito conservato nello
stelo dell’HA[3-8]. Nonostante questi anticorpi siano dotati di un ampio spettro
neutralizzante nei confronti di una larga varietà di ceppi virali, attualmente la loro
modalità di sviluppo è poco conosciuta. Questo studio si prefigge di analizzare questo
8
aspetto attraverso la dissezione delle modalità di evoluzione seguite dagli anticorpi ad
ampio spettro di neutralizzazione come risultato della maturazione dell’affinità.
La maggior parte degli anticorpi contro lo stelo dell’HA utilizzano il gene
VH1-69 della regione variabile della catena pesante e dati strutturali mostrano che si
servono di residui conservati della “heavy chain complementarity determining region”
(HCDR) per il legame con l’HA. Comunque, gli anticorpi VH1-69 sono altamente
mutati e sono prodotti da molti ma non da tutti gli individui[8, 9], il che suggerisce
che diverse mutazioni somatiche possano essere necessarie per il loro sviluppo[10].
Attraverso l’analisi di 197 anticorpi contro lo stelo dell’HA da un singolo donator, le
vie di sviluppo di molti cloni VH1-69 sono state ricostruiti e due elementi chiave per
lo sviluppo iniziale della maggior parte degli anticorpi VH1-69 sono stati identificati:
un residuo F polimorfico codificato dalla linea germinale in posizione 54 ed un
residuo Y conservato in posizione 98 nell’ HCDR3. E’ notevole il fatto che, nella
maggioranza dei casi, una singola mutazione P52aA nell’HCDR2 era sufficiente per
conferire un’alta affinità di legame al tipo di antigene H1 dal quale gli anticorpi sono
stati
selezionati,
Sorprendentemente,
in
accordo
mutazioni
con
una
favorevoli
rapida
maturazione
aggiuntive
hanno
dell’affinità.
continuato
ad
accumularsi, ampliando lo spettro di reattività e rendendo le mutazioni iniziali
ridondanti, compresa la F54. Questi risultati definiscono il polimorfismo dell’allele
VH, il ri-arrangiamento VDJ e singole mutazioni somatiche come i tre elementi
necessari per la generazione di anticorpi VH1-69 ad ampio spettro di neutralizzazione
e rivelano un’inaspettata ridondanza nel processo di maturazione dell’affinità.
Attraverso la ricostruzione dell’albero genealogico di diversi cloni di linfociti
B specifici per il virus dell’influenza, due distinte vie evolutive che conducono alla
generazione di anticorpi VH1-69 ad ampio spettro di neutralizzazione sono state
identificate. Gli anticorpi che contengono Y98 nel loro HCDR3 accumulano
preferenzialmente una mutazione P52aA/G nell’HCDR2. Al contrario, gli anticorpi
senza Y98 non mutano il residuo P52a della linea germinale e seguono vie di
maturazione attraverso distinte sostituzioni aminoacidiche nell’HCDR1. Infine,
questo studio chiarisce il ruolo fondamentale di HCDR3 nel determinare il ruolo
positivo o neutro di differenti sostituzioni aminoacidiche nel legame all’antigene di
particolari strutture anticorpali. Questa scoperta è di particolare rilevanza per
l’identificazione di sostituzioni che possono conferire una reattività di legame ad
ampio spettro. L’anticorpo ad ampio spettro di neutralizzazione CR9114, per legarsi a
9
ceppi di virus dell’influenza di tipo A di gruppo 1 e 2 e virus dell’influenza di tipo B,
necessita di 8 sostituzioni aminoacidiche, le quali non necessariamente conferiscono
lo stesso spettro di legame a differenti strutture di HCDR3. Nel complesso, questi
risultati dimostrano che HCDR3 è importante non solo per definire la reattività
antigenica di linfociti B naïve, ma anche nel regolare le vie maturative che un clone
può seguire per raggiungere un legame ad ampio spettro e ad alta affinità.
Attraverso l’identificazione dei residui che sono stati selezionati come
risultato della maturazione antigene-guidata della risposta anticorpale umana, questo
lavoro accresce significativamente la nostra conoscenza di come gli anticorpi
bersagliano lo stelo dell’HA. Potenti anticorpi ad ampio spettro di neutralizzazione
giocano un ruolo chiave nel disegno di vaccini basati sulla struttura antigenica, un
approccio che è stato recentemente applicato nella definizione di un promettente
candidato vaccino contro il virus Respiratorio Sinciziale[11]. Speriamo che le
innovative scoperte sul processo maturativo degli anticorpi ad ampio spettro di
neutralizzazione anti-stelo dell’HA presentate in questo studio possano essere di aiuto
nello sviluppo di un vaccino anti-influenza universale.
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