EFFETTI TOSSICI DEL VERDE MALACHITE SU ALCUNI
PARAMETRI BIOCHIMICI DI TROTA IRIDEA
(ONCORHYNCHUS MYKISS, WALBAUM)
D. LANARI (1), G. LANG (2) & R. BALLESTRAZZI (1)
1 Dipartimento di Scienze della Produzione Animale Università degli Studi di Udine,
Via S. Mauro 2, 33010 Pagnacco, ltaly.
2 Bay Zoltan Foundation for Applied Research, Institute for Biotechnology, Szeged, Hungary.
Riassunto
Cento trote iridee (100 ± 20 g) vennero casualmente ripartite in 4 vasche di plastica (300 l) ed esposte a
4 concentrazioni (0.00; 0.05; 0.20; 0.40 ppm) di verde malachite (VM) per 24, 48, 72 e 96 ore. Alla fine
di ogni periodo di esposizione, 5 pesci per vasca vennero sottoposti a prelievo di sangue, per
determinare la glicemia e l'attività degli enzimi plasmatici (GOT, GPT, LDH ed AChE), e a prelievo del
fegato per determinare l'attività degli enzimi epatici microsomali (UDP-GT e GST). V M influì
scarsamente su AChE e GOT, mentre LDH, GPT e glicemia aumentarono dopo 48 ore di esposizione.
L'attività di UDP-GT non venne influenzata da VM, mentre GST venne inibita solo dopo 48 ore di
esposizione. I risultati dimostrano che V M non interferisce sul sistema nervoso ma causa danni al
fegato ed inoltre inibisce il processo di coniugazione.
Introduzione
Molti composti organici lipofilici vengono biotrasformati da una serie di vie metaboliche diverse in
prodotti più polari e facilmente eliminabili nei comuni processi di escrezione. Le reazioni di
biotrasformazione possono essere di due tipi: reazioni di fase I e/o di fase II. Gli enzimi di fase I
introducono un gruppo polare nella molecola xenobiotica, tramite processi ossidativi, riduttivi o
idrolitici. La reazione di fase II coinvolge la coniugazione di xenobiotici (o i loro metaboliti sintetizzati
nella fase I) con costituenti polari, endogeni, come l'acido glucuronico, glutatione-solfato o aminoacidi.
Queste reazioni vengono catalizzate da enzimi coniuganti, come UDP glucuronosil transferasi, solfato
transferasi e glutatione transferasi. Similmente ai mammiferi, anche nei pesci l'organo più coinvolto nel
metabolismo xenobiotico sembra essere il fegato. Tuttavia, alcuni studi hanno indicato che nel pesce
anche il rene può giocare un ruolo importante in queste biotrasformazioni (Pesonen et al., 1987). La
maggior parte delle specie ittiche rispondono agli inquinanti ambientali aumentando il loro
metabolismo generale per eliminare queste molecole, riconosciute come estranee. L'induzione del
sistema monoossigenasi, nel caso di determinati composti organici, può essere un indicatore sensibile
dell'esposizione a xenobiotici, o in termini generali, a inquinanti. Questo perché l'attività enzimatica
cambia rapidamente, di solito precedendo l'instaurarsi di patologie serie a livello cellulare o tissutale. E'
ben documentato che vari xenobiotici possono aumentare l'attività epatica microsomale
monoossigenasica (Elcombe e Lech, 1979; Pesonen e Andersson, 1990). Questa induzione del
citocromo P450, da esposizione a certi xenobiotici, è un processo usato dagli organismi per adattarsi a
modifiche nell'ambiente e può influenzare la biotrasformazione dei composti estranei sia
quantitativamente che qualitativamente. Nei pesci gli enzimi epatici del citocromo P450 sono indotti da
idrocarburi aromatici poli- ciclici (P AH), come il β-naftoflavone (BNF), 3- metilcolantrene (MC) e
2,3,7,8 -tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD), laddove i pesci, diversamente dai mammiferi, sembrano
essere refrattari agli induttori tipo-fenobarbital (Vodicnik et al., 1981). Sia BNF che TCDD
provocarono un aumento dell'attività della etossiresorufina-O- deetilasi (EROD) in colture cellulari
primarie di fegato di trota (Pesonen e Andersson, 1990). Le attività indotte in cellulle esposte a BNF
ritornarono a livelli basali entro 48 ore dalla fine dell'esposizione. L'esposizione di cellule a TCDD (100
ppm) per 48 ore indusse l'attività della EROD, che, diversamente dall'esposizione a BNF, continuò ad
aumentare anche dopo che il medium era stato sostituito con un medium privo di TCDD. Un altro
studio dimostrò che gli effluenti, sbiancati o non, delle cartiere contengono composti molto potenti
nell'indurre il citocromo P450 1A1 (Pesonen e Andersson, 1990). Anche l'etanolo è un potente
induttore dei citocromo P450 nei mammiferi, dando luogo ad una reazione di monoossigenasi, in
particolare aumentando l'attività dell'anilina idrossilasi.
Il verde malachite (VM) {bis [p- (dimetilammino) - fenil]- fenilmetil cloruro} (Fig. 1) è un colorante
organico sintetizzato più di 100 anni fa ed è così chiamato per la somiglianza del colore a quello del
minerale derivato dal rame. V M è stato usato come agente antifungino ed antiproto: zoario topico nelle
ittiocolture intensive per più di 50 anni (Foster e Woodbury, 1936). Attualmente ai fini acquaculturali
vengono impiegate forme diverse di VM: l'ossalato di VM, che, una volta in acqua libera l'acido
ossalico, di per sé già tossico, oppure la soluzione (50% di principio attivo) del sale ammonico misto
acetato cloruro, i cui acidi, in concentrazioni equimolari a quelle della forma cloruro (solida), possono
essere potenzialmente tossici. Il V M produce infiammazioni dell'epitelio del tubo digerente, delle
branchie e della pelle. Inoltre, si sa che questo composto blocca gli enzimi digestivi nell'intestino, e per
questo in molte specie, dopo il trattamento con il VM, si osserva una riduzione del livello di ingestione
(Reichenbach-Klinke, 1975). Il verde malachite aumenta anche il tenore di Mg nel plasma, tuttavia il
significato di questa azione resta sconosciuto.
La DL50 del V M per la trota iridea (a 12°C) è 0.50 ppm (24 h) e 0.39 ppm (48 h), secondo Willford
(1966); 0.36 ppm (24 h) e 0.25 ppm (48 h) per gli avannotti (fingerlings), secondo Bills et al. (1977). La
concentrazione comunemente usata nelle ittiocolture è di 1-1.5 ppm per 40-60 min nelle trote porzione
(a 15°C). Il presente lavoro ha studiato gli effetti sulla trota del verde malachite liquido (sale ammonico
misto acetato cloruro) per poter stabilire se tale composto attiva il sistema di biotrasformazione nella
specie e per valutare la risposta fisiologica del pesce dopo l'esposizione a tempi e concentrazioni
crescenti del composto.
Fig. 1: Formula di struttura del verde malachite.
Materiali e metodi
Animali
Per la prova si sono impiegate cento trote immature di allevamento (100 ± 20 g). I pesci vennero
ripartiti casualmente in 4 vasche in plastica (300 l), riceventi acqua dolce di pozzo (T = 13 ± 0.2°C),
aerata e corrente durante la fase di adattamento. In questa fase i pesci furono alimentati con mangime
commerciale, una volta al giorno, e poi mantenuti a digiuno nei 3 giorni precedenti l'inizio
dell'esperimento.
Trattamenti ai pesci e preparazione dei microsomi
Il verde malachite, sotto forma di sale ammonico misto acetato cloruro, venne solubilizzato
direttamente nelle vasche in modo tale da ottenere una concentrazione finale di principio attivo di 0.00;
0.05; 0.20 e 0.40 ppm. Durante la fase di trattamento il flusso dell'acqua venne fermato, mentre il
sistema di aerazione rimase in funzione per tutto l'arco di tempo del trattamento. I tempi di esposizione
furono 24, 48, 72 e 96 ore, per tutte le concentrazioni sperimentali. Alla fine di ogni intervallo di
esposizione 5 pesci/vasca vennero casualmente campionati, sottoposti a prelievo di sangue (via vena
caudalis) e quindi sacrificati per il prelievo del fegato.
Fig. 2: Effetti del tempo di esposizione e della dose di verde malachite sulle attività di GOT e GPT in plasma di
trota iridea.
Il sangue venne immediatamente centrifugato ed il surnatante miscelato con un pari volume di
glicerolo. La miscela venne congelata e conservata a -20°C, fino alla determinazione analitica. I fegati,
invece, sciacquati 3 volte in KCI 0.15 M, vennero omogeneizzati con 4 volumi di soluzione tampone A
raffreddata (tampone tris HCL 0.1 M, p H 7.4, contenente: glucosio 0.25 M, KCI 0.15 M, EDTA 1
mM). L'omogenato fu centrifugato per 15 min a 12.000 9 ed il sumatante a sua volta centrifugato a
100.000 9 per 60 min. La frazione microsomale successivamente fu sospesa in 2 ml di tampone B
raffreddato (0.1 M Tris H CI, p H 7.4, contenenti 20% di glicerolo, KCI 0.15 M). Infine questa
soluzione venne congelata con azoto liquido ed i campioni conservati a -80°C fino ad analisi (Omura e
Sato, 1964).
Saggi enzimatici
Si sono misurate le seguenti attività enzimatiche adottando i metodi di seguito riportati:
Le attività delle transaminasi (GOT: glutammico ossalacetico transaminasi; GPT: glutammico piruvico
transaminasi) vennero determinate secondo Tonhazy et al. (1950); Karmen (1955); Reitman e Frankel
(1957); Amador et al. (1966).
Miscele di reazione; GOT : I ml DL-aspartato (0.2 M), L-chetoglutarato (1.8 mM) in tampone fosfato p
H 7.5 e 0.2 ml siero; GPT: DL-alanina (0.2 M), acido L-chetoglutarico (1.8 mM) e 0.2 ml siero. Tempi
di incubazione: 60 min per GOT; 30 min per GPT, a 37 °C. Successivamente 1 ml di 2,4
dinitrofenilidrazina (1 mM) veniva aggiunto in ogni campione. Dopo ulteriori 20 min di incubazione a
temperatura ambiente la reazione veniva bloccata con 10 ml di NaOH (0.4 N) e si passava alla lettura
spettrofotometrica.
L'attività della lattato deidrogenasi venne determinata secondo la metodica Bergmayer e Bernt (1974).
La miscela di reazione era così composta: 2 ml di tampone fosfato 52 mM (p H 7.2, contenente
piruvato 0.62 mM), 0.05 ml NaDH2 (11 mM) e 0.1 ml di campione. La reazione veniva determinata
spettrofotometricamente dall'aumento di assorbanza a 340 nm.
L'attività della acetilcolinesterasi venne misurata sul plasma ematico col metodo di Ellman e Courtney
(1961). Questo enzima scinde l'acetiltiocoliniodide in tiocolina ed acido acetico. Il gruppo -SH della
tiocolina dà una reazione colorata con ditio-bis-benzoato. La miscela di reazione era così composta: 2
ml di tampone fosfato 52 mM (p H 7.2), contenente DTNB 0.26 mM, 0.05 ml di acetiltiocoliniodide
82.4 mM e 0.1 ml di plasma. La diminuzione di assorbanza a 412 n m veniva misurata entro 3 min.
La glicemia venne misurata in accordo con la metodica di Henry (1947), successivamente modificata
(Keilin e Hartree, 1948; M c Comb et al., 1952; Keston, 1956). Miscela di reazione: 5 ml di soluzione
reagente (contenente l'enzima gluco-ossidasi, l'enzima perossidasi e o-dianisidina) e 0.2 ml di campione
diluito (20 volte). L'assorbanza venne letta a 562 nm.
L'attività della glutatione-S-transferasi (GST) venne determinata spettrofotometricamente (340 nm)
misurando la formazione del coniugato di glutatione ridotto (GSH) e 1 cloro- 2,4 dinitrobenzene
(CDNB). Miscela di reazione: 2 ml di tampone fosfato (0.22 M, p H 6.6), 0.05 ml CDNB (20 mM) in
etanolo 95 %, 0.05 ml GSH (20 mM) e 10 µI di campione.
L'attività della UDP glucuronosil transferasi (UDP-GT) venne determinata tramite 4 nitrofenolo, come
descritto da Isselbacher (1956) e Hanninen (1968). La miscela standard di incubazione conteneva: 0.2
ml di 4-nitrofenolo 1 mM in Tris maleato (0.5 M, p H 7.4), contenente MgCb 10 mM, 0.1 ml UDP
glucuronato (10 mM, corretto a p H 7.4 con NaOH) e 200 µl di microsomi epatici. L'assorbanza venne
misurata a 405 nm.
I dati furono sottoposti a test di Bartlett dell'omogenità della varianza prima di sottoporli a t-test per
valutare le differenze tra le medie. Considerate pari a 100 % le attività dei vari enzimi per il controllo,
risultate peraltro entro valori normali per la specie, a queste si sono raffrontate le attività enzimatiche
dei pesci trattati, come si può osservare nelle tabelle e figure di seguito riportate.
Risultati
L'attività della GOT non venne influenzata dal verde malachite, mentre si osservò un aumento
significativo dell'attività della GPT (Fig. 2). I cambiamenti nell'attività della GPT risultarono
proporzionali alla concentrazione del prodotto (furono influenzati dal tempo di esposizione. Dopo 48
ore di esposizione l'attività enzimatica cominciò a decrescere, tornando a valori normali dopo 72 ore.
Dopo trattamento con VM si osservarono modi. fiche anche nell'attività dell'LDH che risultarono
significative dopo 48, 72 e 96 ore, ma non dipesero dalla concentrazione del prodotto. Il valore più alto
si osservò dopo 72 ore di esposizione a 0.4 ppm di V M (Tab. 1).
Tab. 1: Effetti del tempo e della dose di verde malachite sull'attività di LDH nel plasma di trota iridea.
Attività di LDH
0.05 ppm a
0.2 ppm a
0.4 ppm a
24 h
72.98 ± 10-64 b 88.55 ± 57.47 123.63 ± 40.76
48 h
140.93 ± 48.90 168.75 ± 32.03 146.01 ± 58.89
72 h
112:99 ± 40.27 106.74 ± 19.22 244.48 ± 55.33
96 h
191.23 ± 54.27 110.39 ± 38.12 173.16± 66.27
Controllo
1102.75 ± 439.06 c
a Concentrazione di induttore solubilizzato in acqua.
b Valori espressi come % del controllo (media ± ds 5 campioni),
c Valori espressi come U/l
Tab. 2: Effetti del tempo e della dose di verde malachite sull'attività di AChE nel plasma di trota iridea.
Attività di AChE
0.05 ppm a
0.2 ppm a
24 h
117.27± 15.62 87.59 ± 20.81
48 h
156.26± 39.00 112.05 ± 22.54
72 h
96.79 ± 24.28 101.98 ± 39.51
96 h
117.70 ± 43.80 127.38 ± 50.37
Controllo
99.15 ± 38.82
0.4 ppm a
96.93 ± 20.21
118.68 ± 19.18
128.15 ± 22.99
93.28 ± 26.05
a Concentrazione di induttore solubilizzato in acqua.
b Valori espressi come % del controllo (media ± ds 5 campioni),
c Valori espressi come U/l
Tab. 3: Effetti del tempo e della dose di verde malachite sulla glicemia della trota iridea.
Tasso di glucosio
0.05 ppm a
0.2 ppm a
24 h
70.90 ± 12.07 109.82 ± 8.84
48 h
171.58 ± 28.75 172.76 ± 17.49
72 h
168.76 ± 15.19 80.07 ± 14.32
96 h
102.91± 13.92 110.77 ± 21.23
Controllo
85.43 ± 24.16
0.4 ppm a
145.00 ± 19.04
171.11 ± 24.32
104.51 ± 23.70
106.63 ± 23.24
a Concentrazione di induttore solubilizzato in acqua.
b Valori espressi come % del controllo (media ± ds 5 campioni),
c Valori espressi come mg/dl
Nessun effetto di VM si poté notare sull'attività di AChE (Tab. 2). L'unico cambiamento significativo
fu l'aumento, dopo 48 ore di esposizione, alla concentrazione di 0,05 ppm. La glicemia aumentò,
durante il trattamento con verde malachite, mostrando un forte effetto di stress generale. Dopo 48 ore
di esposizione questa variabile tornò ai valori normali (Tab. 3).
L'attività microsomale epatica dell'UDP-GT non mostrò nessuna modifica significativa durante il
trattamento (Fig. 3), mentre il V M inibì l'attività della GST dopo 48 ore. In seguito i valori tornarono a
normalità (Fig. 3).
Fig. 3: Effetti del tempo di esposizione e della dose di verde malachite sulle attività di UDP-GT e GST in
microsomi epatici di trota iridea.
Discussione
L'effetto tossico del verde malachite sulla trota è noto e recentemente è stato riesaminato (Gerundo et
al., 1991; Aldermann e Clifton-Hadley, 1993). Il suo effetto sugli organismi acquatici dipende dalla
temperatura dell'acqua, dalla sua concentrazione e, ovviamente, dai tempi di esposizione (Bills et al.,
1977). Nella presente prova il trattamento con V M causò significativi incrementi nelle attività di GPT,
che erano presumibilmente dovute a danni epatici, ma il rene o altri organi non furono probabilmente
influenzati, dal momento che la GOT non aumentò significativamente. L'attività della LDH invece
risultò significativamente accresciuta durante l'intera fase di esposizione, e ciò fu probabilmente dovuto
ad un cambio nel catabolismo del glucosio verso acido lattico, che risulta essere pericoloso e tossico per
i pesci.
Gli alti valori di glicemia osservati indicano la presenza di un effetto stressante generale, come già
riportato da Nemcsok et al. (1982) per carpe comuni esposte a 1 ppm di VM. L'elevata quantità di
glucosio nel sangue non può venir metabolizzata utilizzando le normali vie metaboliche (Asztalos et al.,
1985). Ciò spiegherebbe tra l'altro gli alti livelli di LDH riscontrati nei pesci trattati con VM.
Il verde malachite è un veleno degli enzimi respiratori che agisce a livello mitocondriale, il riflesso
"boccheggiante" nei pesci riflettendo il blocco della catena respiratoria. Anche se, come spesso
suggerito, si aumenta l'ossigeno nella vasca del trattamento, i pesci sono comunque incapaci di
utilizzarlo. Il danno ai sistemi enzimatici intramitocondriali è osservabile, a livello ultrastrutturale, nelle
cellule, sia fungine che dei pesci, raggiunte dal verde malachite (Alderman, 1991).
In questo studio VM inibì entrambi gli enzimi di coniugazione considerati (GST, UDP-GT). Ciò
significa che questo composto non può essere eliminato, via glucuronidazione e/o per coniugazione
con il glutatione ridotto. La presenza di VM, riportata da Allen (1987) in muscolo di salmone atlantico
(Salmo salar) o chinook (Oncorhynchus tschawytscha) dopo che il pesce era stato trattato periodicamente fin
dalla fase di avannotto (10-47 volte, 1 ppm per 1 ora), pur con tempi di sospensione finale di 18-41
giorni, conferma che questa sostanza viene eliminata molto lentamente dal pesce. L'inibizione delle
attività enzimatiche può essere indiretta (inibizione dell'enzima sintetizzato), perché V M può ridurre i
livelli ematici di Mg2+, o diretta (inibizione delle sintesi di entrambi gli enzimi). Ciò può essere spiegato
dal fatto che VM ha un'elevata affinità per il DNA e le sua molecola piatta può interferire sulla
replicazione del DNA, dando al V M la potenzialità di indurre effetti mutagenici o teratogeni. A tal
riguardo Meyer e Jorgenson (1983) riportarono che V M indusse significativi effetti teratologici, quando
venne somministrato, per via orale, a conigli di razza Nuova Zelanda, a dosi di 5 mg/kg peso vivo. Gli
stessi autori hanno osservato anormalità spinali, alla testa, alle pinne o alla coda in avannotti di trota nati
da uova esposte a trattamenti standard, ripetuti di VM.
Dai dati della presente prova non si può concludere che il V M sia induttore dei sistemi enzimatici
dipendenti dal citocromo P450 nella trota, tuttavia il prodotto ha dimostrato effetti tossici sulla specie.
Dal momento che i parametri dell'acqua erano costanti, si può concludere che la tossicità in questo caso
è dipesa unicamente dalla concentrazione e dal tempo di esposizione. Il VM ha inibito il processo di
coniugazione e la trota non è stata in grado di biotrasformare il composto. Impiegando il plasma ed i
microsomi epatici dei pesci sarebbe possibile monitorare rapidamente, ed in modo sensibile, composti
potenzialmente rischiosi sia tra quelli aventi impiego terapeutico che sostanze di uso non comune in
acquacoltura.
Ringraziamenti
Progetto CNR-RAISA: Interazione tra tecnologie di allevamento e l'organizzazione della produzione
animale (Pubbl. n° 1359). La dott.ssa Lang ha usufruito del supporto finanziario dato da una borsa di
studio dell'Università di Udine (legge n. 19/1991).
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