Potenzialità dei P Sistemi
per la Modellazione
dell’Attività dei Canali
Meccanosensibili nei
Procarioti
Anna Anselmo
P Sistema
Modello di calcolo ispirato alla struttura
ed al funzionamento delle cellule.
Utilizzato come modello discreto per
processi cellulari
Componenti necessari per la descrizione
di un processo cellulare tramite P Sistema:
•
•
•
•
Struttura cellulare
Sostanze Biochimiche
Reazioni cellulari
Comunicazione di sostanze
CANALI MECCANOSENSIBILI (Msc)
Scoperti nel 1984 in cellule animali
Canali proteici regolati da forze meccaniche
In particolare da cambiamenti di pressione
esercitati contro la membrana in cui sono localizzati.
• Condizioni ambientali
• Esperimenti di patch clamping
Esperimenti di patch clamping (cattura di membrana)
Viene praticata una suzione che fa si che il vetro aderisca
strettamente al doppio strato lipidico.
La resistenza tra l'interno della pipetta e il liquido
extracellulare è così elevata da permettere la
registrazione delle piccolissime variazioni di resistenza
causate dall'apertura o chiusura di un singolo canale.
• Localizzazione
nella membrana cellulare
Protezione contro downshifts
osmotici
• Funzione principale: permette la rapida uscita di sostanze chimiche
e la diminuzione della pressione osmotica
all’interno della cellula
La pressione osmotica all’interno dalla cellula
avvicina i valori osmotici del mezzo extracellulare
CELLULA INTEGRA
In particolare ci occuperemo degli shock iposmotici =>
diminuzione della concentrazione dell’ambiente extracellulare
MODELLI
per la descrizione del funzionamento di Msc
in vitro
esperimenti
di patch clamping
in vivo
shock ipotonici
SISTEMA comprende:
• ambiente
• regione
• tensione di membrana
• probabilità associate a regole di evoluzione
In questo P sistema gli oggetti non vengono modificati dalle
regole di evoluzione, ma solo scambiati tra la regione interna
e l’ambiente extra-cellulare
CANALI MECCANOSENSIBILI IN E.COLI
Condizioni stazionarie
Shock iposmotici
La parete di peptoglicano nei batteri
bilancia il turgore cellulare che in
E.Coli è circa 4 atm.
Acqua entra rapidamente nella cellula
aumentando la pressione di turgore.
ASSENZA di meccanismi
che riducono turgore
Pressione di turgore di E.Coli
raggiunge 11atm (0,3 M)
ATTIVAZIONE dei canali
meccanosensibili
Nessun danno alla cellula
Il rilascio di soluti aumenta il potenziale osmotico
del citoplasma diminuendo quindi la driving force
per l’entrata dell’acqua
Struttura di MscL in E.Coli
Risponde a stimoli meccanici
(tensione di membrana: non richiede
componenti extramembrana x il gating).
Codificata da un gene singolo di 412 bp
136 aa
15 kDa
Struttura Secondaria:
2 domini di α-eliche transmembrana
(M1 e M2)
Loop divisibile in S1 e S2
N-terminale e C-terminale localizzati
nel citoplasma
Multimero con 5 subunità
Stretch meccanico
Aumento della tensione
di membrana
PROGRESSIONE
ATTRAVERSO LE
DIVERSE
CONFORMAZIONI
Conformazioni:
C,
conformazione chiusa
CE, conformazione chiusa espansa
SO1, conformazione semi-aperta in cui solo
SO2, conformazione semi-aperta in cui solo
SO3, conformazione semi-aperta in cui solo
SO4, conformazione semi-aperta in cui solo
aperte
O,
conformazione completamente aperta
una subunità è aperta
due subunità sono aperte
tre subunità sono aperte
quattro subunità sono
Modello di membrana per l’attività di MscL In Vitro
Qualche definizione….
Struttura di membrana:
membrana insieme di membrane gerarchicamente racchiuse in un’unica
membrana. Ogni coppia di parentesi quadrate = 1 membrana.
Ciascuna membrana identifica una Regione.
Regione
Regole di evoluzione: regole di riscrittura con associato un target (determina la regione
dove l’oggetto sarà comunicato dopo l’applicazione della regola).
Configurazione: struttura di membrana con tutti i multinsiemi di oggetti
associati ad una regione
Computazione: sequenza di transizioni attraverso le configurazioni, ottenuta lasciando
evolvere gli oggetti in tutte le regioni in maniera non deterministica e
parallela.
Simulazione di un Ciclo: sequenza finita di transizioni che partendo dalla
configurazione iniziale Co finisce con una
configurazione finale Cf.
Modello di membrana per l’attività di MscL In Vitro
corrispondente ad esperimenti di Patch Clamping
Componente fondamentale:
•TENSIONE che può assumere valori reali dell’insieme finito
Tension =
{tC, tCE, tSO1, tSO2, tSO3, tSO4, tO, tL}
dove:
• tC = valore iniziale della tensione di membrana
• tCE = valore raggiunto durante l’espansione del canale MscL
• tSO1, tSO2, tSO3, tSO4 = valori di tensioni di membrana quando
il canale è parzialmente aperto
• tO = valore corrispondente all’apertura completa di MscL
• tL = valore corrispondente alla soglia litica di membrana
Da esperimenti in vitro si sono potuti osservare
i seguenti valori di tensione di membrana (dyne/cm):
1.
2.
3.
4.
5.
tC Є [0,10)
tCE = 10
tSO1, tSO2, tSO3, tSO4 Є (10,13)
tO = 13
tL ≥ 14
no aspirazione
applicata suzione
canale parzialmente aperto
completamente aperto
lisi membrana
Transizioni attraverso i valori di tensione sono dovuti
a cambiamenti nella pressione applicata alla membrana
(dipendenza lineare tra la tensione di membrana e la
pressione applicata)
Si considera un Ambiente Esterno (Env) ed una Regione Interna (Reg)
1. l’ambiente è fatto di soluti (simboli dell’alfabeto Vchem)
e molecole d’acqua (w ∉ Vchem );
2. la regione interna consiste di oggetti sullo stesso alfabeto
dell’ambiente e si assume che al suo interno non avvenga
nessun altro processo
La notazione Env [t Reg indica la membrana
(associata al parametro di tensione t) che separa
l’ambiente esterno da quello interno.
NB: in esperimenti in vitro l’attivazione di MscL è determinata dalla
pressione negativa applicata artificialmente alla membrana
Le soluzioni interne ed esterne non hanno nessun
ruolo nel meccanismo di apertura del canale
Regola dell’ambiente in vitro: cambiamento nel parametro di
pressione p dovuto ad azione esterna
‹p,apply› [t
prob
[t'
Per p Є R, t,t‘ Є Tension, prob Є [0,1]
R
Azione del parametro p ha
conseguenze sulla tensione di
membrana ed è applicata con
una probabilità associata
Transizioni delle tensioni
di membrana per il modello
in vitro
Insieme R di regole di evoluzione per il modello in vitro
14 sottoinsiemi
di regole
Transizione da un valore fissato di
tensione di membrana per un
determinato valore di aspirazione
Regole appartenenti allo stesso sottoinsieme hanno associati
valori di probabilità la cui somma è 1.
1. [tC
prob=1 [tC
(no suction applied)
Valori scelti arbitrariamente,
ma con stretta attinenza al
fenomeno
biologico
2. ‹p,apply›[t
C
prob=0.01 [tCE for some p « 40
3. ‹p,apply›[tC
prob=0.99 [tC
for some p « 40
Tensione di membrana = tC e la pressione applicata è <<40mmHg
la conformazione di MscL diventa CE con una probabilità
molto bassa perché la suzione applicata è insufficiente
per l’attivazione del canale
4. ‹p,apply›[tC
5. ‹p,apply›[tC
6. ‹p,apply›[tCE
7. ‹p,apply›[tCE
8. ‹p,apply›[tCE
9. ‹p,apply›[tCE
10. ‹p,apply›[tCE
11. ‹p,apply›[tCE
prob=0.8 [tCE for some 0< p ≤40
prob=0.2 [tC for some 0< p ≤40
prob=0.05 [tC
prob=0.5 [tSO1
prob=0.20 [tSO2
prob=0.15 [tSO3
prob=0.07 [tSO4
prob=0.03 [tO
12. ‹p,apply›[tSO1 (x,out)
13. ‹p,apply›[tSO1 (x,out)
14. ‹p,apply›[tSO1 (x,out)
15. ‹p,apply›[tSO1 (x,out)
16. ‹p,apply›[tSO1 (x,out)
17. ‹p,apply›[tSO1 (x,out)
(x,out)
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
prob=0.05 [tCE
prob=0.5 [tSO1
prob=0.2 [tSO2
prob=0.15 [tSO3
prob=0.07 [tSO4
prob=0.03 [tO
Transizione dalla CE
alle altre
conformazioni in
risposta ad
un’aspirazione
di 40 mmHg
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
Flusso di sostanze chimiche ed acqua
quando il canale è aperto
18. ‹p,apply›[tSO2 (x,out)
19. ‹p,apply›[tSO2 (x,out)
20. ‹p,apply›[tSO2 (x,out)
21. ‹p,apply›[tSO2 (x,out)
22. ‹p,apply›[tSO2 (x,out)
prob=0.1 [tSO1
for some p ≈ 40
prob=0.02 [tSO2 for some p ≈ 40
prob=0.5 [tSO3
for some p ≈ 40
prob=0.3 [tSO4
for some p ≈ 40
prob=0.08 [tO
for some p ≈ 40
23. ‹p,apply›[tSO3 (x,out)
24. ‹p,apply›[tSO3 (x,out)
25. ‹p,apply›[tSO3 (x,out)
26. ‹p,apply›[tSO3 (x,out)
27. ‹p,apply›[tSO3 (x,out)
prob=0.02 [tSO1
prob=0.3 [tSO2
prob=0.08 [tSO3
prob=0.5 [tSO4
prob=0.1 [tO
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
28. ‹p,apply›[tSO4 (x,out)
29. ‹p,apply›[tSO4 (x,out)
30. ‹p,apply›[tSO4 (x,out)
31. ‹p,apply›[tSO4 (x,out)
32. ‹p,apply›[tSO4 (x,out)
prob=0.02 [tSO1
prob=0.08 [tSO2
prob=0.3 [tSO3
prob=0.1 [tSO4
prob=0.5 [tO
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
for some p ≈ 40
33. ‹p,apply›[tO (x,out)
34. ‹p,apply›[tO (x,out)
35. ‹p,apply›[tO (x,out)
prob=0.9 [tC for some p ≈ 40, x ⊆ Mreg
prob=0.01 [to for some p ≈ 40, x ⊆ Mreg
prob=0.09 [tSO4 for some p ≈ 40, x ⊆ Mreg
36. [tO (x,out)
37. ‹p,apply›[tO (x,out)
38. ‹p,apply›[tO (x,out)
Comunicazione
di oggetti dalla
regione interna
prob=P (o l) [tL
for some p > 40, x ⊆ Mreg
all’ambiente
prob=1-P (o l) [to for some p > 40, x ⊆ Mreg
39. ‹p,apply›[tC (x,out)
40. ‹p,apply›[tC (x,out)
prob=0.99 [tL
prob=0.01 [tCE
prob=1 [tC
41. ‹p,apply›[tCE (x,out)
42. ‹p,apply›[tCE (x,out)
43. ‹p,apply›[tL
prob=1
(no suction applied)
prob=0.9 [tL
prob=0.1 [tSO1
for some p >> 40
for some p >> 40
for some p >> 40
for some p >> 40
for all p ≥0
Distruzione membrana
Multiset interni ed esterni mischiati nell’ambiente
Definizione formale del modello in vitro per l’attività MscL
π
invitro
= (V, µ, Tension, Menv, Mreg, R)
Dove:
• V = Vchem U {w}
• µ Є {[t ]t, }
Alfabeto del sistema dove
Vchem= {a1,…,an} è l’insieme finito
di simboli corrispondenti ai soluti
Struttura di membrana: membrana etichettata
con il parametro variabile t. Se la membrana non è
più presente nel sistema (lisi) si usa la notazione
• Tension = {tC, tCE, tSO1, tSO2, tSO3, tSO4, tO, tL}
• Menv, Mreg
•R
Insieme di valori per la
tensione t di membrana
Multinsiemi presenti nell’ambiente e nella regione
(all’inizio Menv = Mreg)
Insieme di regole
Valori tipici per buffers simmetrici usati in esperimenti in vitro:
• 200 mM KCl
• 40 mM MgCl2
Quindi si può definire:
Menv = Mreg = a1200 a240 wN
dove a1 = KCl, a2 = MgCl2, N = valore intero » soluti
Il P sistema definito per la modellazione dei MscL durante
esperimenti di patch clamping con buffers simmetrici può
essere utilizzato anche per modellare esperimenti con buffers
non simmetrici (Mreg ≠ Menv).
CONFIGURAZIONI:
C ( [ ], t, Menv, Mreg)
C è una 4-tupla ( [ ], t, Menv, Mreg) oppure
2-tupla ( , Menv)
Configurazione iniziale: Co = ([ ], tc, Menv, Mreg) con Menv = Mreg
Configurazione finale: Cf = { ( [ ], tc, M’env, M’reg), ( , M’’env)}, con M’env, M’reg,
M’’env tale che M’env U M’reg = Menv U Mreg e
M’’env = Menv U Mreg
Transizione da una configurazione all’altra può essere descritta come:
זP : ({ [ ] } x Tension x Env x Reg) U ({ } x Env)
({ [ ] } x Tension x Env x Reg) U ({ } x Env)
Con ( [ ], t, Menv, Mreg) → {([ ], t’, M’env, M’reg), ( , M’’env)}
( , Menv) → {( , Menv )}
Modello per esperimenti In Vivo
• Viene considerato un numero minore
di conformazioni
• Non vengono associati valori di probabilità
alle regole di evoluzione
• Aggiunto un nuovo valore di tensione di
membrana raggiungibile dopo un ciclo
• Ulteriori possibili transizioni attraverso
valori di tensione di membrana in risposta
a differenti condizioni ambientali
Alcune considerazioni
Nei modelli in vivo
Configurazione iniziale del sistema
corrisponde all’equilibrio biologico
(situazione in cui non c’è attivazione di MscL)
Possibili combinazioni di multinsiemi e concentrazioni:
1. Composizione e concentrazione dei multinsiemi diverse
Menv
≠ Mreg, Conc(env) ≠ Conc(reg)
⇨ Corrisponde all’habitat naturale di E.Coli
2. Composizione dei multinsiemi diversa, ma concentrazioni uguali
Menv ≠ Mreg, Conc(env) = Conc(reg)
⇨ Corrisponde all’habitat naturale di Halobacter salinarum
3. Composizione e concentrazione dei multinsiemi uguali
Menv = Mreg, Conc(env) = Conc(reg)
⇨ Corrisponde agli esperimenti di patch clamping considerati nel
modello in vitro
Batteri Archea Alofili (Halobacter salinarum, Haloferax volcanii)
Possono vivere in ambienti ipersalini (Mar Morto)
No pressione di turgore
• Strategia non
dispendiosa
La concentrazione di soluti
all’interno della cellula è
praticamente uguale alla
concentrazione all’esterno
La quantità di ciascun
soluto però è molto differente
all’interno rispetto all’esterno.
• Richiede adattamenti del
macchinario enzimatico
per l’alta concentrazione
intracellulare.
• Limitata adattabilità
delle cellule
Un’altra strategia…
Escherichia Coli
Presenza all’interno della cellula di
alti livelli di molecole organiche
(glutammato, zuccheri, ecc.)
Aumentano la pressione osmotica
Diminuisce l’entrata di ioni sodio
all’interno della cellula
• Strategia dispendiosa
(dipende dal soluto
organico sintetizzato)
• Nessuna modificazione del
macchinario intracellulare
• Velocità di adattamento
delle cellule a cambiamenti
della salinità esterna
Occorrenza multipla dei MscL
Per descrivere tutte le reazioni possibili è sufficiente
considerare differenti probabilità per ciascun canale.
Esempio:
Membrana con due canali
‹p, apply› [tc
‹p, apply› [tc
‹p’, apply› [tCE
‹p’, apply› [tCE
e così via…
prob=0.8 [tCE
prob=0.3 [tC
per il canale 1
per il canale 2
[tSO1
prob=0.5 [tCE
prob=0.7
per il canale 1
per il canale 2
p Є (0,40]
p’ ≈ 40
Considerazioni Finali ed Estensioni Future
Studio del parallelismo in Biologia e nei P sistemi
Relazioni tra modelli In Vitro e In Vivo
Occorrenza multipla di MscL
Effetti di Inibitori ed Attivatori
Risposte a breve e lungo termine alla Pressione Osmotica
• Descrizione del funzionamento di altri canali
meccanosensibili con diverse conduttività (MscS, MscM in E.Coli)
• Descrizione di altre strutture coinvolte nell’ osmoregolazione
in cellule procariotiche
Relazioni tra modelli In Vitro e In Vivo
per l’integrazione di informazioni note sui MscL nei procarioti
Il potere intrinseco dei P sistemi per l’elaborazione di modelli sia
in vivo che in vitro di processi biologici ha due ragioni:
1. P sistemi sono stati costituiti sull’assunzione che un
progetto formale di computazione può essere astratto
dal funzionamento delle cellule
2. La matematica discreta potrebbe essere più appropriata
che la matematica continua per descrivere eventi molecolari
discontinui come l’apertura e la chiusura dei MscL.
Occorrenza multipla dei MscL
Modelli (in vitro ed in vivo) simulano l’attività di un singolo canale
ma in una singola cellula batterica se ne possono trovare 50-100.
Modelli in vitro possono facilmente essere estesi per considerare
l’occorrenza multipla di MscL.
Condizioni ambientali fissate
non tutti i MscL sono nella stessa conformazione.
Applicazione aspirazione:
CANALI
completamente aperti,
stati di semi-conduttività
completamente chiusi
Effetti di Inibitori ed Attivatori
Inibitori: ione gadolinium, amiloride antibiotici aminoglicosidici
Attivatori: molecole anfipatiche, molecole con gruppi idrofilici ed idrofobici
per descrivere cambiamenti nell’attivazione dei MscL
ed il funzionamento della cellula
Esempi:
Gadolinium
inibisce il flusso osmotico di soluti da E.Coli e altri
microrganismi durante shock iposmotico
Gramicidina
forma canali nel bilayer: quando aumenta la tensione
nel doppio strato, due molecole di gramicidina si
legano e il dimero formato è responsabile della
formazione del canale
Vantaggio:
P sistema adatto alla predizione dell’azione di attivatori ed
inibitori (non molto utilizzati in esperimenti biologici)
Bibliografia
• D. Besozzi, I.I. Ardelean, G.Mauri, The Potential of P Systems
for Modelling the Activity of Mechanosensitive Channels in Prokaryotes
• S. Sukharev, Mechanosensitive channels in bacteria as membrane
tension reporters
• S. Sukharev, M. Betanzos, C. Chiang, R. Guy, The gating mechanism
of the large mechanosensitive channel MscL
• M. Betanzos, C. Chiang, R. Guy, S. Sukharev, A large iris-like expansion
of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension
