Analisi di possibili cofattori coinvolti nell`eziopatogenesi del sarcoma

Università di Sassari
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Istituto di Dermatologia
Dipartimento Struttura Specialità Microchirurgiche
Consorzio 21
Edificio 2- Polaris
Programma Master and Back
Loc. Piscina Manna
09010 Pula
Programma di Tirocinio Stage
Analisi di possibili cofattori coinvolti nell’eziopatogenesi
del sarcoma di Kaposi
1. Soggetto Proponente
Ragione Sociale: Istituto di Clinica Dermatologia, Dipartimento Strutture Specialità Microchirurgiche,
Università degli Studi di Sassari,
Indirizzo:
Viale San Pietro 43/b, 07100 Sassari
Telefono: 079228211
Fax:
079228211
E-mail:
Rappresentante Legale:
Prof. Alessandro Maida
Referente per il Programma:
Prof.ssa Francesca Cottoni
[email protected]
Tipologia: Università
Breve Presentazione del Soggetto Proponente Operante in Sardegna
L’attività dell’Istituto di Clinica Dermatologica è incentrata sulla diagnosi, sul trattamento e sulla prevenzione
di tutti i tipi di patologie che interessano la cute, le mucose e gli annessi cutanei, nonché sulla didattica e
ricerca. L’ attività assistenziale si svolge presso il reparto, l’ambulatorio divisionale e gli ambulatori
specialistici (Fototerapia, Malattie Sessualmente Trasmesse, Studio e Prevenzione dei tumori della pelle,
Dermatologia Allergologica). La struttura è centro di riferimento per la cura della psoriasi (PSOCARE) e per
lo studio e la cura del Sarcoma di Kaposi (SK) classico/mediterraneo. E’ presidio di rete per le Malattie rare
dermatologiche per la provincia di Sassari. Nell’Istituto di Clinica Dermatologica è presente il laboratorio di
Immunodermopatologia dove vengono svolte attività di ricerca e diagnosi delle malattie autoimmuni ad
interessamento cutaneo e sistemico. L’attività didattica dei docenti afferenti all’Istituto di Clinica
Dermatologia si svolge nel Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia, Corso di Laurea in Odontoiatria e
Protesi Dentaria, Corso di Diploma Universitario per infermieri, Scuola di Specializzazione in Dermatologia e
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Istituto di Dermatologia
Dipartimento Struttura Specialità Microchirurgiche
Venereologia e Master 1° livello in Medicina della Cooperazione. Nell’ambito della ricerca l’Istituto di Clinica
Dermatologica ha sviluppato numerose collaborazioni con Ospedali ed Enti di Ricerca in Italia e all’estero:
Istituto Superiore di Sanità-Roma, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia Università di Roma la
Sapienza, Dipartimento di Patologia Umana ed Ereditaria Sezione di Biologia Generale e Genetica Medica
Università di Pavia, Cattedra di Genetica Medicina Università di Cagliari, Departments of Dermatology and
Pathology Helsinki University Central Hospital, Department of Veterans Affairs Connecticut Healthcare
System West Haven Connecticut ecc. E’ stata coinvolta in numerosi progetti di ricerca Nazionali ed
Internazionali riguardanti lo studio del SK classico, la Sindrome di Werner, le Malattie Bollose a patogenesi
autoimmunitaria ed altre patologie ad interessamento cutaneo.
2. Soggetto Ospitante
Ragione Sociale:
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica,
Università degli Studi di Roma "La Sapienza”
Indirizzo:
Viale Regina Elena, 324- 00161 Roma
Telefono:
064463542
Fax: 064454820
Rappresentante Legale:
E-mail:
[email protected]
Prof. Mario Piccoli
Referente per il Programma: Prof. Antonio Angeloni
Tipologia:
Università
Breve Presentazione del Soggetto Ospitante
Il Laboratorio di Virologia Oncologica, presso il quale saranno condotti gli studi descritti, è parte del
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell’Università degli Studi di Roma "La Sapienza”. Nel
Laboratorio e nei locali del Dipartimento sono disponibili le apparecchiature richieste per poter eseguire il
programma presentato. Inoltre afferiscono al Laboratorio di Virologia Oncologica oltre al Prof Angeloni,
Referente del presente progetto, numerosi laureati e personale tecnico con esperienza ormai pluriennale
sulle problematiche che verranno analizzate. La competenza scientifica del gruppo ospitante è testimoniata
dalle numerose pubblicazioni su riviste internazionali aventi come oggetto il virus HHV-8 e le patologie
umane ad esso associate.
3. Accordo/Programma di Collaborazione
Tipologia dell’Accordo/Programma di Collaborazione
•
Sviluppo della Ricerca Scientifica e Tecnologica.
•
Formazione del Capitale Umano.
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Dipartimento Struttura Specialità Microchirurgiche
Descrizione dell’Accordo/Programma di Collaborazione
Obiettivi
Il programma di collaborazione promosso dalla Clinica Dermatologica dell’Università di Sassari e il
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell’Università degli Studi di Roma "La Sapienza" e’
inserito nell’ambito di una serie di progetti riguardanti lo studio del virus erpetico Human Herpesvirus-8
(HHV-8) e la sua associazione con il sarcoma di Kaposi (SK).
La Sardegna rappresenta una delle aree geografiche a più alta prevalenza d’infezione da parte di HHV-8 ed
al contempo a più alta incidenza della variante classica del SK. Tuttavia i meccanismi che sottendono al
processo neoplastico che fa seguito all’infezione non sono noti e certamente altri cofattori sono implicati. Da
questo punto di vista, è senz’altro importante il complesso network di informazioni che si stabiliscono tra
cellule infettate e virus, nonché il ruolo della risposta immunitaria nel controllare l’andamento dell’infezione e
la proliferazione delle cellule infettate.
L’obiettivo del presente studio e’ quello di valutare le alterazioni nell’espressione dei fattori di crescita che si
verificano a livello locale nelle biopsie ottenute da pazienti affetti dalla forma classica del SK e le interazioni
virus-cellula che conseguono allo stabilirsi dell’infezione in vitro di colture primarie di cheratinociti, nonché
l’andamento della risposta immune cellula mediata nel controllo dell’infezione da parte di HHV-8.
Attività Realizzate e/o Previste
Il Sarcoma di Kaposi (SK) è una neoplasia vascolare multicentrica, caratterizzata da macule, noduli
e placche angiomatoidi a prevalente interessamento cutaneo. Si distinguono quattro varianti: forma classica
o Mediterranea, forma endemica o Africana, quella conseguente a trapianti renali o a terapie
immunosoppressive e infine la variante epidemica o AIDS-associata. Un ruolo fondamentale nello sviluppo
del SK è svolto dal virus Human Herpesvirus–8 (HHV-8), il quale è stato visto essere invariabilmente legato
a tutte le forme di SK. Uno studio epidemiologico, comprendente il periodo fra il 1977 e il 2003, condotto
nelle province di Sassari e Nuoro, con una popolazione di 718.487 (censimento 2001), ha evidenziato una
incidenza del SK classico pari a 4,06/100.000/abitanti/anno che rappresenta la più alta incidenza nell'ambito
di una popolazione altamente omogenea dal punto di vista genetico.
Dal 1977 presso la Clinica Dermatologica dell’Università di Sassari è stata raccolta un’ampia
casistica di pazienti affetti da SK e vengono condotti studi volti a valutare gli aspetti epidemiologici, genetici
ed ambientali del SK classico. Ormai da numerosi anni, alcuni di questi studi sono condotti in collaborazione
con il Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia dell’Università degli Studi di Roma "La Sapienza".
La Clinica Dermatologica dell’Università di Sassari intende dare la possibilità ad un giovane ricercatore
sardo, di partecipare ad esperienze formative on the job di eccellenza nell’ambito del programma di
collaborazione per lo sviluppo della ricerca scientifica col Dipartimento di Medicina Sperimentale e
Patologica dell’Università degli Studi di Roma "La Sapienza".
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Dipartimento Struttura Specialità Microchirurgiche
Il presente programma di ricerca si propone di valutare le alterazioni nell’espressione dei fattori di
crescita che si verificano a livello locale nelle biopsie ottenute da pazienti affetti dalla forma classica del SK e
le interazioni virus-cellula che conseguono allo stabilirsi dell’infezione in vitro di colture primarie di
cheratinociti, nonché l’andamento della risposta immune cellulo-mediata nel controllo dell’infezione da parte
di HHV-8.
Risultati Attesi
Il presente progetto è finalizzato ad esaminare a livello molecolare le interazioni tra HHV-8 e cellule
infettate sia a seguito di infezione “de novo” in vitro sia mediante l’indagine condotta su prelievi bioptici
ottenuti da pazienti affetti da SK. I risultati attesi sono pertanto quelli di conseguire nuove informazioni sul
coinvolgimento di fattori di crescita, citochine e loro recettori nel processo che sottende allo sviluppo del
Sarcoma di Kaposi in soggetti infettati da HHV-8.
Un ulteriore aspetto che verrà preso in esame sarà lo studio del coinvolgimento del sistema immune
ed in particolare della risposta cellulo-mediata nell’eziopatogenesi del SK. I risultati attesi in questo ambito
saranno pertanto legati alla determinazione delle eventuali alterazioni del pattern di risposta cellulo-mediata
paragonando soggetti affetti da SK, individui sani sieropositivi o sieronegativi per HHV-8.
Piano di Lavoro
Con Il presente programma di collaborazione intendiamo valutare un duplice aspetto:
•
le interazioni virus-cellula che conseguono allo stabilirsi dell'infezione in vitro.
•
la risposta immunologica mediata da cellule T nei confronti del virus HHV-8.
Lo studio delle interazioni tra HHV-8 e cellule infettate in vitro sarà condotto seguendo l’andamento
dell’infezione “de novo” di colture primarie di cheratinociti, di cellule dendritiche isolate da sangue periferico e
di colture di cellule endoteliali microvascolari dermiche, già note per essere suscettibili all’infezione da parte
di HHV-8. In particolare, si valuterà se l’infezione da parte di HHV-8 sia in grado di indurre una variazione nel
pattern di citochine, di fattori di crescita e dei rispettivi recettori nelle colture di cellule esaminate. Ancora
oggi i modelli cellulari disponibili per lo studio in vitro di HHV-8 risultano ostici al momento di permettere il
rilascio di nuovo virus infettante. Recentemente il Laboratorio del Prof. Angeloni ha raggiunto risultati
soddisfacenti nella produzione di nuova progenie virale: ciò ci fa guardare con fiducia alla possibilità di poter
sviluppare dei modelli sperimentali consistenti d’infezione. Una volta che il virus sarà stato messo in contatto
con le colture cellulari sopra indicate, si verificherà l’avvenuta infezione sia cercando la presenza di DNA
virale, mediante PCR, che analizzando mediante immunofluorescenza acquisita l’espressione di antigeni
virali. Questi dati saranno messi in rapporto a quelli per l’espressione dei vari fattori di crescita, citochine e
loro recettori prendendo in particolare considerazione i prodotti genici appartenenti ai tessuti epiteliale e
connettivale, tessuti che risultano coinvolti nel processo patologico del SK. In caso di variazioni del pattern di
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espressione di geni cellulari, si passerà poi allo studio del ruolo di singoli geni di HHV-8 nella modulazione
dell’attività cellulare, procedendo a singole transfezioni geniche in luogo dell’infezione. Particolare riguardo
sarà posto nei confronti di quei geni virali che si è visto codificano proteine che presentano notevoli omologie
con citochine di nature cellulare, di fattori di crescita e di loro recettori. Inoltre sarà oggetto d’indagine
l’eventuale ruolo svolto sul ciclo biologico di HHV-8 dal trattamento di suddette colture cellulari infettate con
citochine e/o fattori di crescita secrete fisiologicamente o a seguito di uno stato infiammatorio dagli elementi
cellulari presenti in una lesione di sarcoma di Kaposi.
Un secondo aspetto che sarà preso in esame è il ruolo del sistema immune nel controllare
l’andamento dell’infezione in vivo. In particolare, per quanto attiene lo studio del coinvolgimento della
risposta immune T-mediata nello sviluppo del C-KS, lo studio procederà attraverso le seguenti fasi:
a. Frazionamento di linfociti di sangue periferico (PBL) di pazienti affetti da C-KS in 2 popolazioni: cellule
aderenti (monociti/macrofagi) e cellule non aderenti ed esame della presenza di HHV-8 nelle due
popolazioni mediante PCR nonché di trascritti latenti e litici virali mediante RT-PCR. I risultati ottenuti
saranno paragonati con quelli delle stesse cellule prelevate da soggetti sieropositivi per HHV-8 ma sani, così
come da individui sieronegativi;
b. Coltivare i monociti/macrofagi di soggetti affetti da C-KS e di controlli sani HHV-8+ e HHV-8- con GM-CSF
e IL-4 allo scopo di valutare la capacità di differenziazione in cellule dendritiche (DC). Valutare le eventuali
differenze tra le cellule dendritiche dei malati e dei gruppi di controllo in termini funzionali (processazione e
presentazione dell’antigene) e in termini fenotipici (analisi al citofluorimetro dell’espressione di molecole
implicate nella presentazione dell’antigene e di molecole co-stimolatorie). Verrà anche analizzata la
produzione di citochine che promuovono una risposta Th1 o Th2 da parte delle DC dei pazienti affetti da CKS (IL-12 o IL-10) per correlare poi la produzione di citochine da parte delle DC ad un’eventuale alterazione
del rapporto Th1/Th2 e Tc1/Tc2 nel sangue periferico dei pazienti stessi o dei controlli sani. Peraltro è stato
riportato che le DC dei pazienti affetti da C-KS sono ridotte nel numero e presentano una diminuita
produzione di IL-12.
c. Valutare l’efficienza della risposta T-specifica nei confronti di HHV-8 analizzando contemporaneamente la
risposta T nei confronti di antigeni di richiamo comuni. In particolare sarà determinata sia la funzione di
stimolo delle DC dei pazienti C-KS che quella di risposta da parte dei linfociti T in presenza di HHV-8
purificato o di peptidi sintetici derivati da proteine virali ad alta affinità per l’HLA dei donatori. Infine sarà
interessante correlare la risposta immune cellulare alla risposta immune umorale e al viral load di HHV-8
valutato mediante real time PCR, soprattutto nelle fasi di remissione e riacutizzazione di malattia. E’ stato
riportato che il titolo sierologico sia direttamente correlato al viral load e inversamente correlato all’efficienza
della risposta immune cellulare. Altro aspetto che verrà preso in esame sarà il tentativo di misurare le
citochine, quali ad esempio la IL-6 e il VEGF, prodotte localmente così come il livello di quelle circolanti in
rapporto alle varie fasi della malattia. Ciò potrebbe essere interessante in rapporto al fatto che il C-KS
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sembra dipendere per il suo sviluppo ed accrescimento dalla presenza di alcune citochine prodotte dalle
stesse cellule tumorali o da altre cellule infiltranti il tumore.
Risorse Professionali Impegnate
Per l’attuazione del piano di lavoro, inserito nel programma di collaborazione, è prevista la partecipazione di
un ricercatore con esperienza di laboratorio in ambito dermatologico.
Il tirocinante collaborerà con i ricercatori e dottorandi afferenti al Dipartimento Ospitante ed avrà il supporto
da parte del Referente per il Programma Prof. Antonio Angeloni.
Risorse Finanziarie Impegnate
Le risorse finanziarie necessarie per lo svolgimento delle attività previste dal programma di stage saranno
rese disponibili dal Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologica dell’ Università di Roma "La
Sapienza”. Il Dipartimento Ospitante fornirà supporto logistico mettendo a disposizione la strumentazione da
laboratorio e i materiali di consumo necessari per la realizzazione del programma di ricerca. I costi previsti
per il materiale di consumo che sarà utilizzato in questo progetto sono valutabili in 25.000 Euro.
Modalità di Formalizzazione dell’Accordo/Programma di Collaborazione
La collaborazione fra le due Istituzioni Scientifiche Universitarie è stata formalizzata mediante un “Accordo di
Collaborazione” firmato dalle due parti.
4. Piano del Tirocinio/Stage
Obiettivi Formativi
La partecipazione al programma di Tirocini/Stage darà al soggetto beneficiario la possibilità di approfondire
la propria formazione scientifico-metodologica:
•
acquisendo competenze utili per l’allestimento di sistemi di colture primarie, per la produzione di
virus infettante e per l’impiego di quest’ultimo nell’infezione delle colture suddette.
•
acquisendo competenze necessarie per individuare eventuali modifiche nell’espressione dei geni
cellulari, con particolare riguardo per quelli codificanti fattori di crescita, citochine e loro recettori.
•
acquisendo esperienza sull’isolamento, arricchimento e caratterizzazione funzionale delle cellule
coinvolte nella risposta immune cellulo-mediata.
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Istituto di Dermatologia
Dipartimento Struttura Specialità Microchirurgiche
Obiettivi Professionali
•
Acquisizione di competenze nel campo della biologia cellulare e molecolare da spendere in
ambiente accademico o nell’industria biotecnologia, in particolare nello studio di malattie virali ad
alta incidenza.
•
Raggiungimento di una certa autonomia nell’analisi ed interpretazione dei risultati scientifici, nel
proporre, scrivere e condurre progetti di ricerca.
Con le competenze acquisite il tirocinante potrà arricchire il proprio curriculum professionale in modo da
proporsi sul mercato partendo da una posizione sicuramente vantaggiosa rispetto a quella attuale.
Piano Analitico delle Attività Formative e Professionali
Periodo compreso fra il 1° e 6° mese di Stage
•
Isolamento di colture primarie umane di cheratinociti ricavati da prepuzio, di cellule dendritiche da
sangue periferico e di cellule endoteliali microvascolari dermiche isolate da capillari;
•
Produzione di HHV-8 infettante ottenuto da linee cellulari disponibili nel Laboratorio del Prof.
Angeloni, in grado di rilasciare virus nel sovranatante;
•
Infezione “de novo” delle colture suddette.
Periodo compreso fra il 7° e 12° mese di Stage
•
Analisi mediante tecniche di Western Blot, Immunoistochimica e Northern Blot delle eventuali
modifiche nell’espressione di fattori di crescita, citochine e loro recettori conseguenti all’infezione;
•
Analisi dell’espressione delle stesse proteine mediante tecniche di Immunoistochimica in campioni
ottenuti da pazienti affetti da SK paragonando tali dati con quelli ottenuti da cute sana;
•
Analisi dell’espressione di specifiche proteine virali nelle cellule infettate in vitro. Tale studio sarà
condotto mediante tecniche di Immunofluorescenza e Western Blot;
Periodo compreso fra il 13° e 18° mese di Stage
•
Isolamento di monociti/macrofagi da sangue periferico e studio delle loro capacità di
differenziamento in cellule dendritiche. A tale scopo ci si avvarrà di tecniche di separazione
mediante FACS e analisi dell’espressione proteica tramite Immunofluorescenza e Western Blot;
Periodo compreso fra il 19° e 24° mese di Stage
•
Analisi delle capacità funzionali delle cellule dendritiche ottenute da individui affetti da SK, sani HHV8 positivi o negativi nel presentare l’antigene ai linfociti T e nell’evocare la risposta T mediata nei
confronti di HHV-8. In questo ambito saranno utilizzate tecniche per la valutazione della
proliferazione cellulare mediante test di incorporazione della Timidina.
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Requisiti Professionali Richiesti
Il candidato ideale deve essere in possesso dei seguenti titoli
Punteggio
e requisiti professionali:
Laurea in Scienze Biologiche, con votazione non inferiore a
110/110 e lode
Dottorato di ricerca in Dermatologia Oncologica
Votazione pari a 110/110 e lode: punti 5
Votazione inferiore 110/110 e lode: punti 0
Titolo acquisito: punti 25
Titolo non acquisito: punti 0
Esperienza di laboratorio in ambito dermatologico per un
periodo minimo di tre anni (certificata da parte del
3 anni o piu’ : punti 10
Meno di 3 anni: punti 0
responsabile dell’Istituto/del laboratorio)
Costi del Tirocinio/Stage
1000 Euro mensili per un periodo di 24 mesi (600 Euro mensili in caso di beneficiari con reddito annuo
superiore a 7747,00 Euro) per un totale di 24.000 Euro più 2.000 Euro di spese viaggio.
Partecipazione Finanziaria degli Organismi Proponenti
Il Dipartimento ospitante fornirà supporto logistico mettendo a disposizione strumentazione da laboratorio,
compatibilmente con le proprie attività di ricerca e fornirà inoltre i materiali di consumo necessari per la
realizzazione del programma di ricerca. I costi previsti per il materiale di consumo che sarà utilizzato in
questo progetto sono valutabili in 25.000 Euro.
Piano di Valorizzazione Professionale del Tirocinante/Stagista
L’Istituto di Clinica Dermatologica dell’Università di Sassari si impegna ad attivare contratti di collaborazione
a progetto da stipulare con il ricercatore beneficiario per i 12 mesi successivi alla conclusione dal
tirocinio/stage, in modo da valorizzare le competenze acquisite. I contratti di collaborazione verteranno su
progetti di ricerca volti a studiare patologie virali ad alta incidenza, sia a livello umano che animale, con
quindi importanti risvolti positivi sul piano socio-economico.
L’esperienza acquisita nel periodo trascorso presso il Dipartimento di Medicina Sperimentale e
Patologica dell’Università degli Studi di Roma "La Sapienza” sarà fondamentale per la futura carriera
professionale del tirocinante. Allo scopo di offrire opportunità d’inserimento nel mondo del lavoro alcune
delle attività programmate saranno svolte anche in collaborazione con imprese sarde del settore
biotecnologico (Nurex e Proteomics).
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Istituto di Dermatologia
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Data di Presentazione delle Candidature per il Tirocinio/Stage
Le candidature per la partecipazione al tirocinio dovranno essere presentate entro 15 Luglio 2006
Data di Inizio del Tirocinio/Stage
01 Agosto 2006
Data di Conclusione del Tirocinio Stage
31 Luglio 2008
Durata del Tirocinio/Stage (mesi)
24 mesi
Data,_________
_________________________
(Firma Legale Rappresentante del Soggetto Proponente)
Si autorizza la Regione Autonoma della Sardegna, anche attraverso i Soggetti Attuatori del Programma Master and Back
a:
- pubblicizzare sul sito internet del Programma Master and Back e su altra documentazione specifica la presente scheda
relativa al Programma di Tirocinio/Stage per il quale si richiede l’erogazione del voucher;
- fornire i propri riferimenti di posta elettronica ai Soggetti interessati a partecipare al Programma di Tirocini/Stage
presentato nella presente scheda.
Data,_________
_________________________
(Firma Legale Rappresentante del Soggetto Proponente)
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