La determinazione quantitativa dei dinitrofenil

La determinazione quantitativa dei dinitrofenil-derivati
degli amminoacidi mediante cromatografia automatica
su colonna di gel di silice
L. TENTORI
Laboratori di B iologia, Istituto S uperiore di S anità, Roma, Ttalia
f.ome è n oto i me todi a nalitici per la d et erminazione d ei residui NH .terminali delle proteine più usati sono quelli che prendono il nome rispettiva mente da Sanger ( 1) e da Edman ( 2 ).
In f!ntrambi i m etodi v ien f! sfruttata l'azion..: di agenti chimici capaci
di legare gli a mminoacidi NH 2 -terminali con un lt'game ch e a lla successiYa
idrolisi effettu ata con le t ecnich e usuali risulta più stabile d el legame peptidico presente nt>lle proteine.
Il metodo di Edman (2) sfrutta la r eazione fra il fenilisotiociana to c la
proteina o il peptide con la formazione di uu fPn iltiocarba mmil-derivato;
la su ccessiva idrolisi in condizioni controlla te !ibera il feniltioidantoindt>rivato del r esiduo NH 2-t erminale ; per la d eterminazione quantitati va di qu est ' ultimo è sta to messo a punto da Sioquist un m eto do di se pa razione er o·
matografico su carta con s uccf'ssiv a eluiilione e d et erminailione spettro fotom etrira n ell' u lt ravioletto.
Il m etodo di San ger ( 1 ) si b asa invt>ce sulla reazione fra l'l-fluoro-2,
4-dinitrobt>nzen c e l'amminoacido N H 2-terminale della proteina o d el p ep·
tid e in esame. La r eazione fr a il fluorodinitrob enzene ed il gruppo a mmin ico
terminale libero a vvien e secondo lo schema:
N02- o - F+ H2 N - CHR-C0 2H - + N0 2 - o - NH-CHR- C02H + HF
N0 2
N02
a t e mperatura a mbiente cd in presenza di un tampon e di bicarbon a to di
sodio. L a proteina cd il p eptide vengono su ccessivam ente idrolizzati ed il
rlinitrofe nil-deri vato d ell'amminoacido NH 2 -terminale viene estratto e quindi
~c parato e idt>ntifica to media nte di ffer enti tecni che ch e vanno dalla ero. l rm .
1 ~1 . ~~~J)~r . 1Sunil<i
( I!Hì6 ) 2 , 11\7 · 2 11' .
181\
~EMI NA RI
DI t; R OMAT OGRAF IA
matografia sn ca rta a ll a cromat og ra iÌa di ach-orbim f' nto su colonn e, alla
rromatografia su l' tratfl sottile. a lla ell'tt rofo rPsi !'U ca rta, alla distribuziotte'
in contror orrl'ntc. l'id caf'O particolare dellt· protein•· che "t a\'amo sturliando
ah hiu mo ritenuto opportuno !'cegliert' il metodo di Sange r (') per la Ùe lc•rminazion r rl egli ammi no acidi NH 2 -tt>rmina li .
F. intrres~antr ri r.ord a rt• come s i ~ "vihrppa to sto ri ca men te qu\'S lo
mt>todo. T DNP-dt'fi\ati degli amminoacidi non furono da prin ci pio usati
d a Sa n~er lH' r la d e terminazionf' dei rrsidui NH 2 -tt· rminali dei peptidi o
rldle prot eine. ma allo seo po di a\'t'n" a di sposizion e d r i prodo tti ch e, essendo colorati , fossno pii1 ick ntificabili fa cilm ente rlf'gli N -acPtil-amminoacidi
usati da Ma rtin t' Syng\' JWr l'analisi di misceJ .. di a mminoacidi. Co mi' ~
n oto al loro punto i!'oclettrico gli a mminoacidi f'S Ìstono comi' ioni dipolari
(' comi' tali la lor o solubilità in soh-rnti n on arquosi (· mrnima. Quando qu Psta ca ratteri stica di dipolarità viene modificata, co m(· per ''~e mpio JWr es t er ifìcaziont· rl el gruppo carbossilico () ver acilazionl' dd gruppo a mminico,
i rlerivati d egli amminoacidi divengon o in gene re più facilmentt' so lubili
in :,;olvf'nti non a cquosi a mP.no c he, per parti cola ri camtt\·ris tic hc della loro
stru t t ura , non con servino la loro d ipola rità .
Nello studio rlcgli N -ac.c til-amminoacidi si osser vò b en p rt>sto che n on
tutto l"azoto pre!'ente era estraibiJ,. dalla fasi' acq uosa n ella fase, ad f'Sf'm pio, cloroformica , c questo fatto fu inter pre t ato da Syngc co mf' do v uto a
difrer en:r.c dei coefficienti di parti zionc d ci ditlerenti a mminoacidi fra l'ar qua ed il cloroformio. Di con seguc n :r.a Martin e Syn ge proposero un m etodo
dr scpara:r.iont· df'gli N -acf'til-amminoacidi m Pd iante t:roma t ogra fìa di p arti:r.innP u sa nd o comi' supporto inr r tl' il gel di silicl'. comt• fast' sta:r.ionaria,
o\·viamPntf'. l' acqu a d!'l gel di silice l' comt> solvente una miscela di clorofm·mio t• butanolo; 1w r rivela rt' il mov imento dell e bande qu esti Autori
u savano m etil-ara n cio come indicatore. Sanger , a que"t o punto, sostitu ì
gli N-acetii-amminoacidi con i DNP-amminoacidi 1wr lavorare con d t>ll t·
sostanze n a turalmentc culoratf'.
Q uanrlo San ger sviluppè1 il suo rnPtodo per la d et ermin azion e d ci r t·sirlui NH 2-terminali u sò per la separazioni' dci DNP-derivati la cr omatografi a {li partizione su colonne di gel di silicf'; tuttavi a b en presto si ossen ·ò
ch e con quel'ta t ecnica n on si a\·c va un a ri soluzioni' m olto soddisfacen te
dcllt bande, probabilmente a causa d ell'adsorbimento sul gel di silice di
parte delle sostanze da se parart' ; questo dife tto ch e appariva particolarm ente accentuato n el caso degli idrolizza ti protei ci v1·ni\-a ~olo parzialIDI'llt<' alleviato dalla presenza nd cloroformi o di hass1· concentrazioni \a riabili di butanolo; per di più, a pa rt e il fat t o c he n on l'ra possibile separa rt'
l e rlu e leu cinro, la presenza n1·gli idroli zzati di a ltri so luti influenzava sensibilmentt' la distribu zione ~I elle b andf' d egli amminoa cidi monoammin o mon ocarhossilici che Ycn gono studiati con qu esto m Ptodo .
. 111 11. / .•1.
s uwr.
s rwiltì ( l!JIIG ) 2. l l! 7·2 1tl.
TEI'OTORI
'
189
o
Per questo motivo la srparazione su gel di silice è stata abbandonata
m favore rlegli altri metodi di separazione fino a quando, piuttosto recenteme nte, Kessn cr r coli. (3 ) h a nno descritto un metodo ch e permette la se parazion e di un gran num ero tli DNP-dcri,att . in 22 ort> merliantc cromatografia su colonne di gr( di silic::. Questi Autori h anno attribuito i primi ins uccessi che si erano ossen·ati con le colonne di gel di silice a difft>renti ca use : a lle variazioni nelle proprietà delle differenti partite di gel rli silice, alla
fr equf'nte rottura delle colonne, e alla necessità di usare più di una colonna
di piccola misura per ottent're con di,·e rsi solventi differenti tipi rl.i separazione, c quindi alla nect>ssità di cromatografare di 'olta in volta miscele
di standard su colonne equivalenti per identificare i DNP-amminoacidi.
Orb t>ne, Kessncr e coli. (3 ), avendo l'tabilito che la rottura r la formazione
di ca nali nell'interno di una colonna possono t>SSere eliminati mediante
una accurata di'ae razione dei solventi usati per la eluzione, sono s tati in
grado di impaccar<> (park) colonne di gd di silice di l 00 cm senza mai osservare rottura o canalizzazione di esse e di ra ggiungere quindi con l' uso di
una sola colonna ri sultati sempre riproducibili. Con colo nne di 0,9 X 100 cm
di gel di silicc idratato con 65 mi di H.SO, 0,5 N per 100 g di gel di sili ce, t•htite alla temperatura di 3So, con un gradiente realizzato con duf' camere di m eseolamento e quattro camere di rifler va e composto di n-eptano,
di alcool amilico terziario (tAA) e di metiletilchetun e (MEK), ques ti
Autori hanno ottenuto in 22 ore la separazione di un:t miscela di 20 DNP-ammirwacidi sintetici.
ln qu es te condizioni DNP-isoleucina e DNP-I.eucina non vengono separate; il dinitrofenolo c la dinitroanilina, che suno s.-m pre presen ti negli
idmlizzatt di pr-oteine dinitrofenilate, non compaiuno nel gra fico poich è
si tratta di una es perienza eseguita con una miscela sintetica. I n rra ltà
gli Autori osse rvano ch e in queste cond izioni sprrimentali il ùinitrofe nolo
emcrgercbhe all'inì:~.io del cro matogramma e ben distinto dal primo picco
composto eia isoleucina-le u cina ; la dinitroanilina in vece cmer gt>r ebhe n ella
wna alanina-prolina compre ndendo i picchi di questi due dinitrofcnilderivati ; secondo gli Autori però è possibile, va riando le• condizioni di idratazione e di temperatura, allontanare la dinitroanilina da questa zona; alt{'rnativamente si potrebbe allontanare per sublim azione la dinitroanilina d all'idrolizzato della proteina dinitrofcnilata prima di adso rbire tale idroliz:t.ato sulla colonna; ~>i tratta tuttavia di un procedimento molto complicalo durante il qualr, ver di piÌI, si corre il ri schio di a lte rare g li altri DNPamminoacidi presenti n ella m:scda.
Sulla base del lavoro di Kessne r e coli. (3) è s tato rt'centemcnte rea uzzato t' messo in c-ommercio un apparecchio St'rniautomatico pt>r la d et erminazione quantitativa dei DNP-amminoacidi mediante c romatogr afia su
c-olonne rli g{'l di !"ilice. Schf'maticamt'nte l'apparecc hio è costituito da nn
l un. l s l. ·""''"'"· 8tllt ilci ( l !lfofi ) 2. 1Xi · 21tl.
.i
190
SEMINARI DI
CROMATOGRAFI~
dispositivo di tipo autograd a nove camere in " ctro p er la realizzazion e dd
gradiente di eluzione: l'eluente dopo esser e passa to attraverso un saturatore contenente H,SO, 0,1 N viene porcpato a flu sso costante da una rntcropompa dosatrice sulla colonna di 0,9 X 12 0 cm di gel di silice su cui è
stata adsorbita la miscela di DNP-amminoacidi in esame.
L'effluente della colonna passa a flusso continuo in un colorimetro chf'
ne legge a 340 m11- la densità ottica, in una cuvetta rla 2 mi con un ca mmino
ottico di lO mm ; la densità ottica viene registrata, anch'essa in modo continuo, rla un registratore. Vole ndo è possibile ra ccogli ere le varie frazioni
d ell'eluente mediante un collettore di frazioni .
Inizialmente abbiamo u sato l' apparecchio seguendo rigorosamente la
procedura consigliata in linea di massima dalla ditta fornitrice . Ci siamo
p erò ben presto resi conto che nelle condizioni sperimentali consigliate non
si otteneva una risoluzione soddisfacente. Pertanto abbiamo eseguito una
serie di esperimenti tenendo fisso il gradiente di eluizione e variando gli altri
parametri che influiscono in modo determinante nella separazione d elle
miscele di DNP-aruruinoacidi e precisamente l'idratazione dd gel di silice,
la velocità di flusso della soluzione elucnte e la t emp eratura della colonna .
Le condizioni sperimentali che ci hanno fornito i migliori risultati sono
schematicamente riportate nella Tab. l.
TABELLA
l (•)
Gradiente di eluizione nella separazione di miscele di DNP·amminoacidi, formula n. 1
Alcool amilico
terziario
n -Eptano
(tAA)
Metilctilchl'lonc
(MEK)
Camera l
3
97
-
~
2
3
97
-
~
3
3
97
-
>)
4
IO
90
-
>)
5
15
85
-
~
6
i5
8.5
-
»
7
84
"
-
-
8
-
84
9
-
-
84
~
(•) Ripresa da (').
Velocità di flusso: 120 mlf ora.
Pressione : circa 60 PSJ.
T emperatura: 470 C.
Idratazione del gel di silice: mi 54,38 H 2S0 4 0,5N per 100 g di gel di silice secco.
Auu. I sl. SUJJel'. &auilit ( 1966) 2, 18 7·2 10.
l
l
\
TENTORl
191
n gradiente di eluizione v ien e r ealizzato disponendo i solventi n elle n ove
ca m ere n ella manier a seguente: la prima camera, cioè quella dalla quale
il solvente vien e aspira to d alla micropompa dosatrice, conten eva 97 m1
di e pta n o e 3 mi d i tAA. È da n otare ch e è di estrema importanza ch e il
contenuto di questa camera sia p ortato e mantenuto alla temper atura d i
circa 60° allo sco po di dca e ra re completamente il solvente; come abbia mo
già detto è qu est a una rondi~ione det erminante p er evitare rotture o
can alizzazioni della colonna di gel di silice; in pra t1ca questo si realizza
di sponendo intorno alla cam era un riscaldatore elettrico a r et e. Le su ccessive ~amere numero due e tre contenevano le st esse qua ntità d egli st essi
solventi. Nella camera 4 la q ua ntità di epta no era ridotta a 90 ml e la qu a ntit à di t AA porta ta a l O ml. Le came re 5 e 6 conten evan o 85 mi di epta n o
e 15 di t AA. Infine le camer e 7-8 e 9 conten evano solo 84 mi di ME K .
Il flusso, assicurato con notevole precision e d a una micropompa d osatrice Milton-R oy, era di 120 ml per ora e produceva sulla colonna una pression e di circa 60 P SI. La temperatura della colonna veniva manten uta costa nteme nte a 470C per m ezzo di un ultra termostato. P er quanto riguarda
l'idra ta zion e del gel di silice, ch e veniv a ottenuta con 54,38 ml d i H 2 SO,
0 .5N per 100 g di gel di silice secca, è b en e sottolineare ch e occorre eseguirla
con particola r e cura perc hè l'idra tazion e è uno d ei punti più delicati p er
assicura re la riproducibilità dei risultati. Il gel di silice deve essere infat ti
p ortato a p eso cost ante, il ch e si ottien e dopo una p erma nen za in stu fa a
l l oo per cinque ore.
In queste con d izioni sp erimentali è stata o ttenuta la se parazione
riprodotta nella p a rte superiore della F ig. l . Il grafico si riferisce a d
una miscela d i 19 DN P-a mminoacid i sintetici con aggiunta di dinitrofe nolo e dinitroanilina, che viene risolta in 6 ore. Com e appar e evid ente sia il dinitrofenolo che la dinitroanilina non disturbano le zone del cr oma t ogramma che interessano i DN P-a mminoacidi ; è vero che il picco della
dinitroanilina coincide con q uello del t riptofa n o, tuttavia è da tener present e
che il triptofano v ien e distrutt o durante l 'id rolisi acida delle proteine.
Analogamente a quanto osser vato da K essn er , non è possibile risolvere
la zona isoleu cina -leu cina sen za alterar e completamente la risoluzion e n elle
altre zon e del c ro matogramma . L a DNP-metionina-solfossido durante la
crom atografia v iene quantitativ amente t rasforma ta in DN P-metionina-solfo ne e v ien e quin d i eluita con il picco d i quest 'ultima : in p ratica comunq u e
qu.-st i d ue composti non sono presenti n elle prot ein e com e t ali ma derivan o
dalla meti oni!la ed il lor o ri cu pero d eve esser e sommato con qu ello di quest a
u ltima . Come a ppa re dal gr a fico dd cromatogramma, è a nche eviden te ch e
duran te le prime du e ore di esperimento n on si verifica l'eluizione d i nessun
D NP-derivato, se si fa eccezion e per il d ini t rofenolo ch e come è n oto è nn
p rod o tto di idrolisi d el d initrotJuor ob cn zene.
A1t>t. lsl. Suptr. Sanillt (196fl) 2, 18 7· 210.
o
00
...><,
,""
"'
C>
"~
~
~
§
~
~
:::
:...
..
75
75
90
1
105
DIN ITROPH[NOl
'
120
\
135
"\
" " '\
l[UC t N(
oSOl[U(IN[
\'Aoi,.t~E
fl
\
)
A
AL.AN tfrf[
_.ROl tN(
165
)
195
210
f
225
240
GlUfAMIC. ACID
255
Fig. l. -
600
300
285
300
600
315
345
360 (T' li'
330
345
720
360 m 1r
CI •· HtS l tOt N[
AsPAitAGIN [
ml eff luent 720
330
••·•/"D"<
mi el fl u e n t
GLU U.M tN(
M( l lolt0 H I N[ SUlf:O...(
285
315
.......,,.,
\l
ColUfAf'! IH€:
5ULf0H[
Separazion e dei DN P -amminoacidi sintetici etere-solubili su colonne di l X 120 cm . Idrata zione del gel
di silice 54,38 % - In alto: gradiente di eluizione formula n . l . In ba$$0: ~radi e nl t> di t'luizionr formula n . 2.
Riprodotta da ( 4 ) .
270
270
l
... ( l H I I)H IN{
48o
-- ------------- --
4lo lYSI N[
Il
GlVCIN[
1v•··'t"''"'
180
\
1
47 •c __
S · CUIOn... ( l H'f'l
flh'P fOPM.&N
360
OtNIHtOAIULI NE
A l'l "
150
\
l
M(THtOMIIII(
PH[H'f LALAN/N(
240
OINifltOANILIN(
120
240
360
480
- --- ---- - --- - -- --- ------ --- ---- ----- ----- .. ----- ------ - - - 41 •c -- ---------------Flow rate 120 m l/ hour - Back pressure 60 PS I
60
o1
0.2
0.3
o
Q.
<:
e
'O
c
...
120
,..
.;;
l
..--
60
01
0.2
03
o
Q.
~
'O
c
.
~
·
,;;
>O
>
>
..,
ç")
,.o
~
;!:
o
(l
,.
:!
o
>
7.
m
!'l
;!:
""
TENTORJ
193
Allo scopo di antrcrpare l 'inizio della cluizione della miscela d ei DNPd eri va ti abbiamo allora studiato la composizione del gradiente di eluizione
SPrvendoci del grafi co delle contribuzioni ildlf" nove ca mere ilell'aut ograd
JH·Ila composizionf' dt·l gradit>nte. (Fig. 2).
~
~
z
~
~.
o9
~
z
~ i~~
&
)(
~
w
•
o
~
z
ò
z
~
z
~
;;
i
~
•
\l ''
j'
1!
l
l
l
l
l
l
l
~ 0. 6
l
l
u
l
l
~
l
i:;; o 5
z
05-
l
l
l
O. 7
Q
~
~
Wvv
! i ;::
z "" • 1111:
w
l
l
l
l
l
o8
...o
io
-t
~~
·~
o
~i
.; i .,
z z
1
..
uv
!z
w w
w;<
z
~
o o
~
o4
.o
3
o
2
o
1
u
...a
o
o
01
30
02
60
04
0.3
90
120
150
05
180
06
210
0.7
240
0.8
270
300
0.9
•/v 1.0
330
360
T m1n
Fi ~o:.
2.
-
Contributo delle singole ca m ere in un sistl'ma n 9 cam l're. Gradil'nt e di elui zioru•
formula n. l. Riprodotta d n(~) .
Sulle ascisse è riporta ta la percentuale d el gradie nte risp etto al volume
totale del gradirnte ed in ques to caso anche il tt.:mpo corrispondentr, in
minuti, sull'ordinata invece sono disegnate le perct"ntuali di contribuzione;
lt> f' llr VI' rapprest"ntano quindi la percentuale ili contribuzione di ciasc:una
camera per ciascun a frazione df'l gradie nte.
u quest o gr afico abbiamo disf"gnato il punto di emergenza dall a colorma di ciascuno dei DNP-dcrivati della miscela. Abbiamo così potuto const a tart• ch e questi cominr.iano acl emergere dopo che è passato il 36 pt•r
t:Pnto circa del gradi ente, quando inizia la contribuzione de lla camera n. "i ,
t'ioè quando nt>l ;.:radientt> comincia ad int ervenire l'azioni' de l m ctilt·tildlt'tont'.
194
SEMINARI DI CROMATOGRAFIA
Sulla basf" <.h questa r.onstatazione abbiamo pensa to di anticipare la
contribuzione del metil e tilchl'tonc, pur essendo consa pe' oli c h e ques to
artifi cio t ecni co avrebhc potuto pro vocare un an·icinamcnto fra loro dci
primi picchi. Abbiamo quinrli stud iato il gradiente formula 2 (Tab. 2) nd
'luale il mctiletilchPtonr è presente fin dalla camPra 5. Il gradicnt<· è così
TAilF:LLA
2 ( *)
Gradiente di eluizione nella separazione di miscele di DNP-amminoacidi, formula n . 2
Alcool an1ilico
t c rzinr·io
n - 1-~ ptann
(t AA )
l\lctil<•tilch ct on<'
(MEl·')
-
Cam era l
5
95
~
2
6
94
l)
3
7
93
l)
4
lO
90
5
15
75
~
6
15
60
21
~
7
-
-
114
~
8
-
-
84
9
-
-
84
•
•
!
l
8,5
l
(4 ) .
(•) Ripresa dn
Velocità di flusso: 120 mlfora.
Pressiorte : circa 60 PSI.
Temperatura: 47° C.
Idrata zione del gel di silice : ml 54,38 H 2S0 4 0,5N per 100 g di gel di silice secro.
costitu ito: la camer a n. l contiene 95 ml di n-eptano r 5 m l di tAA,
la camera n. 2 94 ml di eptano e 6 mi di tAA, la camera n. 3 93 mi
di n-eptano P '7 ml di tAA, la camera n. 4 90 m] di n-eptano e 10 ml
di tAA, la camera n. 5 75 mi di eptano, 15 ml di tAA e 8,5 mi di MEK,
la camera n. 6 60 m l di n-eptano, 15 ml di t A A c 25 m l di MEK, c finalmente le camere n. 7, 8 e 9 come al solito, 84 mi di MEK. L e altre condizioni sperimentali non sono modificate. I risultati ottenuti sono r affigurati n ella parte inferiore della Fig. l. L 'eluizione d f'i 21 DNP-derivati et eresolubili ha inizio con circa mezz'ora di anticipo cd è cnmpleta in 5 ore e
m ezzo. La risoluzione è generalm ente altrettanto buon a di quella ottenuta
con il gradiente formula l : un n otevole miglioramen lo si osserva n ella risoluzione della zon a DNP-tri ptofa no-dinitroanilina-di DNP-tirosina; anch e
Allll. 1• 1. .Super. S anilà (lOGG) 2, 187·210 .
TENTORI
195
migliorata è la risolu zione nella zona acido aspa rtico-treonina c n ella zona
glutammina-asparagina . Nel cromatogramma appare n on b en e risolta la
DNP-S~ca rbossimetilcisteina; ma il problema della risolu?.ione della cistcina e dei suoi derivati sarà trattato più diffusamente in seguito.
Anche in questo caso abbiamo riportato sul grafico delle contribuzioni
(Fig. 3) i punti di emergenza dei vari DNP-derivati. L "eluizione dei primi
composti comincia dopo l'inizio d ella contribuzione delle ca mer e 5 c 6 che
w
z
w
~~
w
::;g
z
~
w
!2~
~~
z
~i
~&~
~o
1.0
0.9
0.8
-'
0.7
u
i
06
...o
z
e
0.5
\\
''
''
''
''
'
...
g
<>
~
i~
ci
w
ii
~
~ "'
<!)
o(
"~
i'
z
....y~
~
~
wz
~~
~
:!~
~
l
\
,•
,,
'
,{
l
l
\
\
\
l
l
l
l
11\
\
\
\
0.4
l
a:
;'
v
,2- ,
/ \
\
l
0.3
'v "
l
\
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
o
o
l
l
/
"
/
""
0.1
lO
/
l l
,,
'
, ""
\
l
l
l
0.1
'
l
l
...
'
,~--':..
1\
l
0.2
Fig. 3. -
%~
w
z
z
\
:::;
~
z
'<'
l
'
'
;'
"
" ...
"
0.2
60
>,"
,
-O.
90
0.4
l
120
0.6 .
0.5
150
1&0
210
0.7
240
o.a
270
iv 10
0.9
300
330
T m in
Contributo delle singole camere in nn sist ema a 9 camere. Gradiente di eluizione
formula n, 2. Riprodotta da ( 4 ).
con tengono MEK: questo fatto ci ha co n vinto della inutilità di anticipa re
ancora l't>nt·r a ta n el sist ema di questo solve nte che avrebbe probabilmente
avuto come unica conseguenza un ulteriore avvicinamento d elle zone d ei
primi DNP-dcrivati.
Con qu es te co ndizioni sperimentali era <>tato praticamente risolto il
problem a di una ra pida Sf'parazion.--, sempre riproducibile, dei DNP-ammi. 11111. l sl . Su11er. Sani!?. (1966) 2 , 1 ~ 7 · 2111.
19(•
S EMII\ARI DI C ROMATO G RAFIA
noacidi t•tpre-solubili. Tuttavia rimann a il problema di tro\ an• l·· condizioni speriml'ntali pt'r la separazioni' dci D l'iP-amDiinoacidi idrosolubili.
Questi composti sono anche essi importanti pPr lo studio di'i resid ui NH1 ·tcrminali d ci pe ptidi e delle proteine poich è fra essi come è noto sono co mpresi la DNP-arginina, l'acido DNP-ciFteico, la di DN P-istidina, la qu al!'
ultima pur essendo classificata fra i DNP-amminoacidi eteresolubili è piuttosto difficile rla estrarre complt'tamente dallt' soluzioni acquose di DNPamminoacidi. Pt•rtanto il nostro obbit'ttivo era di ottener!' la separazione.
in un solo e!'perimento, di tutti i DNP-amminoacidi sia t>tere- cht• idro-solubili, allo Fcopo di evitar!' il passo della es trazione et erea degli idroliz:r.ati
proteici per avert• un quadro cornplt'to di'i DNP-amminoaeidi . presenti in
questi idrolizza ti.
Avevamo già osservato eh•· alla fin e di ogni esperimento t>ra possibile
duire complctaml:'nte i composti colorati rimasti sulla colonna scmplil'l'ment<' facendo passare &ulla r.olonna d el m t>tiletilchetune puro; questo fatto
faceva presumt:r e che esiste un coefficiente di partizion e per i DNP-amminoacidi idrosolubili fra il MEK e l'acqua , ed era altrettanto presumibilt·
ch e qu esto coefficienti' di partizione fosse difl'erent,. per i divf'rsi DNP-amminoacidi idrosolubili.
Il proble ma quindi doveva consistere esclusivamente nel d a r e il t empo
al MEK di eluire dalla colonna i DNP-amminoacidi idrosolubili. D ' altra
parte non era possibile anticipare ancora la contribuzione del MEK introducendo questo solvente nelle camere 3 " 4 senza aver e la conseguenza indesiderabile di avvicinare troppo fra di loro l e zone dei primi DNP-amminoacidi: a nostro parer e la soluzione del problema con sisteva n ell'aumentare
il tempo di cromatografia lasciando invariata la forma del gradiente e lasciando anche invariata la velocità di flu sso ch e come sappiamo è d et erminante per una buona eluizione. Abbiamo pertanto aumentato il contenuto
di ciascuna camera d el 50 % lasciando invariata la composizione p ercentuali'
d el solvente contenuto in ciascuna di esse otten endo il gradiente formula 3
(Tab. 3) . La prima camera contien e 7,5 ml di tAA e 142,5 mi di n-eptano,
la seconda contiene 9 ml di tAA e 141 ml di n-eptano, la t erza 10,5 mi
di tAA e 139,5 di n -eptano, la quarta 15 ·mi di tAA e 135 di n-eptano,
la quinta 22,5 di tAA, 112 ,5 di n-eptano e 12,75 di MEK, la sesta lO ml
di tAA, 70 ml di n-eptano e 61 ml di MEK, le ultime tre contengono 126
mi di MEK . Le altre condizioni sperimentali, flusso, pressione, idratazione,
venivano mantenute costanti; per quello che riguarda la t emperatura l'esp erienza ci ha dimostrato che per ottenere una migliore risoluzione n ella
prima zona del cromatogramma e la eluizionc completa di DNP-ammino·
acidi idrosolubili, è n ecessario iniziare l'esperimento alla temperatura, come
al solito, di 4 7° e portare successivamente la te mperatura a 28o - 30°
dopo 90 minuti dall'inizio dell'esp erimento .
• 11111 . 1st. :Stlpcr. 8ouilrì (1966)
z. 187 · 210.
TENTORI
197
TABELr.A
3 (•)
Gradiente di eluizlone nella separazione di miscele dl DNP-ammlnoacldi, formula n. 3
.\lcool a ru lllco
t e rziario
(l.\ A)
C11mera l
2
~
»
3
>)
4
•
••
•
>)
•
5
6
7
8
9
7,5
9
10,5
15
22,5
lO
-
-
l
n·l-.;ptnno
142 ,5
141
139,5
135
112, 5
70
-
-
l
l
) letile tllchotonc
(MEK)
-
-
l
l
12, 75
61
126
i26
126
(•) Ripresa da ( 4 ) .
Velocità di flusso : 120 mi/ ora.
Pressione: circa 60 PSI.
Temperatura: 470 - 300 C.
Idrata zione del gel di silice : mi 54,38 H2 50~ 0,5N per 100 g di gel di silice secco.
La separazione di una miscela di 24 DNP-amminoacidi (Fig. 4) et er e- solubili ed idrosolubili si ottiene in lO ore e, come è evidente dal grafico
della cromatografia, la risoluzione è in genere molto soddisfacente. C'è da
osservare p erò ch e la di DNP-cistina e la di DNP-cist eina emergono con
la DNP-treonina.
È quindi necessario, quando nell' analisi dei r esidui N H 2 -terminali si
trova un DNP-derivato ch e emerge neJla p osizione della DNP-treonina,
assicurarsi c h e si tratti veramente di treonina sottoponendo la proteina o
il p eptide alla ossidazione con acido p erformico ; questo trattamento ossida
quantitativamente la cistina e la cisteina con forma zione di acido cist eico
che emer ge come acido DNP-cist eico, ben separ a to, n ella zona degli idrosolubili. Per distinguere un eventuale residuo N H 2-terminale cistina da un
residuo N H 2-terminale cist eina è necessario invece sottoporre preventivamente l a proteina o il p eptide ad alchilazione con iodoacetammide; dopo
dinitrofe nilazione avremo ch e nel caso della cisteina NH.-terminale si otterrà DNP-S-carbossimetilcisteina che, co me è evidente n el cromatogramma,
emer ge come picco isolato fra l'acido DNP-glutammico e l'acido DNP-aspartico. Dura nte la dinitrofenilazione n el caso di proteine o peptidi contenenti
residui cist einili non terminali, il gruppo SH libero di questi r esidui va incontro a dinitro fenilazion e, dando luogo a mono DNP-S-cisteina che emerge
insieme con l'acido D NP-glutammico. An ch e in questo caso, quando n el
Ann. / si. Super. S a n i(ti (1966) 2, l ~ i-2 1 0 .
o
t<>
~
-
00
"'
....
e"'
co
§:
~
~
.E
(l)
::..
"'
Il
90
105
120
135
150
165
190
TA"t'PTOPHAN
195
210
225
CYSTEIH E
5-C ArHtOIY~ETWYL
240
255
270
295
720
360
375
l
390
ASPAIUGI N (
405
l
435
450
465
490
495
l
CYST[I( A(tO
510
525
960
-- -- ------ 29•C - ---- - ----- -Flow rate 120 ml/hour - Back pressure 60 PSI
940
4 20
d ;- HISTIOINf
300
1090
540
555
0 -TYAOSINE
315
330
X
595
E -t. V5 1NE
600
mm
120 cm . Idratazion e
ml etfluent 1200
570
ARGI NI N(
Separazione dei DNP-amminoacidi sintetici etere • ed idro-solubili su colonne di l
d el gel di silice 54.38 °{,. Gradic.-nte di eluizione formula n. :1. Riprodotta rla ( 4 ).
345
,._[ Tw iQN IN(
SUtF'ONE
F ig. -l. -
330
0.1
0.2
o
0.3
a.
u
75
ALANIHE
120
240
360
490
600
.. -- 41•c- - -.+< - ---------- - ------------ - - --- --- - ---- -- -- ----29 •c---- -------- ------------------------------------
60
0.1
0.2
o
0.3
a.
-
.~
'O
·;;;
c
,...
-..
.....
~
::0
">
"'
>
o
>
...
o
:::"'
'"'
l:l
::0
>
:.!
"'3:
:x>
""
'I'E:'>TORI
199
co rso di una analisi per i residui NH2·tcrminali si trova un DNP-deriva to
ch e emerge n ella zona d ell'acido DNP-glutammico, occorre ossidare la proteina con acido pe rformico, per escludere che in realtà non si tratti di mono
DNP-S-cist eina cd inoltre per essere in grado di calcolare con esattezza
l'effetti vo ricupero dell'acido DNP-glutammico. Nella Fig. 5 è rappresen-
l
l
0.9
l
l
l
l
0.8
..J
l
l
l
0.7
'
l
l
l
l
u
l
l
i::::; 0.6
...o 0.5
l
l
l
l
l
z
l
Q
~ 0 .4
...a:
0.3
0.2
0.1
o
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
o
60
120
180
240
300
360
410
480
540
"/v 10
600
Tm 1n
F ig. 5 . - Contributo delle singole camere in un sistema
zione formula n. 3. Riprodotta da ( 4 ).
!l
9 ca mere. Gr adiente di e lui-
tata come al solito la co ntribuzione d elle cam ere d ell' autograd n ella formazione del gr adie nte n. 3 ed i punti di e mergenza dalla colonna d ei vari DNPamminoacidi.
A questo punto ci è sembrato ch e poteva avere un inter esse pratico rea·
lizzare d elle condizioni sperimentali ch e consentissero a n ch e una separazione rapida, n ecessaria in particolari condizioni, dei soli DNP-amminoacidi idrosolubili. Abbiamo p erta nto studiato la formula di gradien te n. 4
ch e è rappresentata n ella Tab. 4, n ella quale la contribuzione d el MEK h a
inizio n ella came ra n. 3 c quindi in pratica fin d all' inizio d ell'esperimento.
Le ca mere n . l e 2 co nten gono 15 mi di tAA e 85 ml di n -eptano, le
.11111. /si. Super. SaMtù ( IUG6) 2. 18 7-Z I O.
2Ull
Sl::)ll i\ Alli ()l CIIOM ATOG RA FIA
'I'AII ELI,A
4 ( *)
Gradiente di eluizione nella separazione d i miscele di DNP-amminoacidi, formula n . 4
.\lrool Htllilkn
h ·t·zittt·ln
n - Eptano
(t.\ .\ )
] :;
2
w t otH"
()11-:K )
115
115
!.'i
Cuuwra
~lt-till"l il d
4·6
:l
. ~(l
5
()
7
Il
9
• Ripr.. sa da (4).
J'elocità d i flu sso: 15() mi/ora.
Prcs.~ion e : circa 25 PS l .
T emperatura : 28" C.
ldrata:ion J d••l gel di siliu: ml 54,3!1 H 2SU 1 0,5 N per IUU lo( di gt'l eli siliee sccc·o.
caml're n. 3 c 4 contengono 46 mi. di n- eptano e 46 mi di MEK, nelle
cam en· 5-6-7-8 c 9 sono contl'nuti 84 ml di MEK. Con questo gradientt'
abbiamo usato gel di silicc sempre idratato con 54,38 mi di H 2S0 4 0,5 N
per 100 g di gel di silicc e sempre equilibrato con eptano, in colonne di
l x 50 cm . Il flusso è st a to a umenta to a 150 ml per ora, co n una pressione
di circa 25 PSI e con una t emperatura di 28o. La ri soluzione che si ottiene,
riportata n ella Fig. 6, è eccellente ed è completa in 225 minuti .
~
..
;;.
c
";;;
v,..
o.
o
J3
J2
~1
45
o
60
150
75
90
ml offluont 600
300
,. ________ ____ •• - - - - --- .-- -- - - - - --- ------ 2a •c --------- -- ------ ------ -- -- - -- -- - •.,
Flow rate 150 m l f hour - Bat k pressure 25 PSI
Fig. 6. -
Scparazioue dei D ' P-amminoacidi sintetic i idro-solubili su colonn e di l >-. 50 e m.
I dratazion e de l gel di silice 54,38 ~o· Gradient e eli eluizione formu lo n . 4. Riprod otta du ( 4 ).
.tnn. 1• 1.
s .. ,.,.,..
l:;anilti (1966 ) 2 .
1 ~7 -2 1 0 .
201
T E!"iT ORI
Chiunque usi p er lungo te mpo c in modo continuativo d elle apparecchiature di tipo automatico è indotto dall'esperienza alla ricerca di modificazioni che possa no essere vantaggiose per un miglioramento d elle loro
prestazioni. P ertanto anch e l'apparecchio originale p er l'analisi d ei DNP-derivati degli amminoacidi è stato da noi modificato nel cor so del n ostro
lavoro e i miglioramenti apportati sono sch e maticamente rappresentati nella
Fig. 7.
~ ·~
Fig. 7. -
v
.. .......
, , ,
Apparecchiatura T echnicon per l'ana lisi automatica dei DNP- clerivati. Riprodotta d u ( 4 ).
Nell'apparecchio originale il g radiente a partire dalla camera n . l d ell 'autograd, riscaldato per deaerare il solvente con un riscaldatore elettrico
a ret e, passa attraverso un saturatore conten ente una soluzion e diluita di
acido solforico e vien e pompato a flusso costante da una micropompa dosatrice sulla colonna di l X 120 cm di gel di silice: l'efflu ente della colonna
passa attraverso un colorimetro ch e n e legge continuamente la densità
ottica a 340 m[J..
La lettura avveniva inizialmente in una cuvetta avente la capacità
di 2 mi ed un cammino ottico di lO mm; p er migliorare la sensibilità e per
. 11w. / st. Super. S w>ilà ( 1!166) 2, 187 ·2 1U.
202
S t~ MI:"'ARI
!li C KO\I ATOGRA F IA
diminuire la possibilità di rimescolamento d ell'efHuente dovuta al volumt·
relativamente ele vato della c uvetta questa è stata sostituita con una nuova
cuvetta d ella capacità di 100 fLI, avente un cammino ottico di 15 mm.
Inoltre per avere la possibilità di impaccare una seconda colonna senza
essere costretti ad usare come riserva di n-eptano l'autograd, e quindi contemporaneamente allo svolgersi nell'altra colonna di una corsa analitica, abbiamo introdotto una riserva di n-eptano, ch e viene preventivamente acidificato con la solita soluzione diluita di H 2 S0 4 , riscaldata da un riscaldator('
ele ttrico sempre allo scopo di deacrare il solvente prima ch e ques to venga
convogliato verso la colonna n. 2 p er mezzo di una seconda micropompa
dosatrice (pompa di impaccaggio): una serie di rubinetti a tre vie, collegati
con la riserva di e ptano, p ermette di d eviare il flusso d el solvente dalla p ompa di impaccaggio a quella di eluzione, attraverso il saturatorr ed il flu ssom etro, allo scopo sia di controllarr la regolarità del flusso e d ella pressione
all'inizio di un nuovo esperimento, sia di lavare il sistema di tubi dal MEK
residuo alla fine di un esperimento.
Un'altra modificazione riguarda il sistema di impaccaggio della colonna;
il riempimento e l'impaccaggio d ella colonna vengono eseguiti, nel sistema
originale, per semplice gravità mettendo la parte superiore d ella colonna che
si intende impaccare in comunicazione con un vaso in cui è contenuta la
sospensione di gel di silice in eptano continuamente agitata mediante un
agitatore: quando il gel di silice è tutto sedimentato nella colonna, con la
pompa dosatrice di eluizione viene applicata una pressione che provoca la
riduzione in altezza dell'adsorbente : n e deriva la n ecessità di rifornire di
nuovo la colonna di una ulteriore quantità di gel di silice p er riportarla
all'altezza voluta e di applicare di nuovo la pressione p er m ezzo della micropompa e cosi via; praticamente è quindi impossibile otten ere un impaccaggio uniforme della colonna e di conseguenza una p erfetta riproducibilità dei risultati da una esperienza all'altra.
Allo scopo di ovviare a qu esti inconvenienti è stato studiato e r ealizzato in Istituto, con la collaborazione d ell'Ing. Scaccia-Scarafoni, il sistema
riprodotto n ella Fig. 8. Quest o consiste in un recipiente di acciaio inossidabile con un coperchio che vien e avvitato a perfetta t enuta . Nel r ecipiente
è contenuta una lamina sagomata di acciaio inossidabile, collegata, m ediante
uno stelo ch e attraversa il coperchio a p erfetta tenuta, con un motorino ele ttrico. Il recipiente è collegato in uscita con una connessione in t eflon che
permette di adattarlo alla colonna di vetro; il coperchio è anche esso attraversato da un tubo in entrata p erfettamente adattabile alla connessione
in t eflon collegata alla tubatura proveniente dalla pompa di impaccaggio .
Dopo aver collegato il recipiente alla colorma, il sistema viene riempito
con la quantità di sospension.e di gel di silice in epta n o n ecessaria p er otten er<' un riempimento della colonna fino all' altezza voluta; si avvita quindi
Ann. l sl . .SIIper. Sa11itil (1 966) 2, 187·2 10.
TENTORI
203
il coperchio, si mette in moto l'agitatore, si connette l' apertura di entrata
con la pompa di impaccaggio e si immette nel sistema un flusso costante
di eptano uguale a quello che verrà usato durante l'esperimento fino a quando la colonna non è pronta.
Fig. 8. -
Apparecchiatura p er la preparazione
delle colonne. Riprodotta da ( 4 ).
fHlO M 1U8Utl
Tutte le esp erienze d elle quali abbiamo parlato fino ad ora sono state
eseguite con miscele di vari DNP-amminoacidi sintetici dapprima costituite da prodotti cromatograficamente puri della ditta Mann e su ccessivam ente da prodotti cromatografìcamente puri della ditta Gallard-Schlesinger. Naturalmente per ciascun tipo di separazione sono stati eseguiti diversi
esperimenti per verifìcarne la riproducibilità che si è dimostrata in ogni
caso p erfetta: tuttavia il problema principale era quello di s tabilire la riproducibilità in senso quantitativo di questo tipo di analisi croma tografica e di v erifìcarne la precisione stabilendone i limiti di errore. P er la calibrazione abbiamo usato miscele contenenti cuca 0,1 micromoli di DNPamminoacidi accuratamente misurati.
L'integrazione d ei picchi ottenuti con queste miscele è stata eseguita
con il metodo dell'altezza-larghezza, moltiplicando l 'altezza dei picchi,
dopo averla ovviamente corretta per gli spostamenti della linea di base,
per la larghezza misurata a metà altezza di essi anche questa dopo correzione per gli spostamenti dalla linea di base. I risultati di quest e operazioni
l
. 1>111. /.~/ • .Super. Sani/ti ( ltiGf.) 2, 18 7 ·21 0.
204
S EMINARI D I CR OMATOGRAFIA
sono d t>i num eri eh!· sono proporzi ona li all 'ar ('a dei picchi cui si riferiscono;
quando qu esti numeri ven gono riportati a picchi ottenuti con 0,1 micromoli d ei DNP-amminoacidi, pre ndono il n ome di costanti di integrazion1•
HW del DNP-amminoacido c ui si riferi scono e son o n ecessa ri pe r il calcolo
del r ecupcro di ciascun DNP-amminoacido . Nella Tab. 5 sono riportatt'
le costanti di integrazio ne di ciascuno dei DNP-amminoacidi usati n egli
esperimenti ottenuti sia usando la cu vetta con cammino ottico di lO mm
(colonna l) sia usando la cuvetta con ca mmino ottico di 15 mm (colonna 2).
È ovvio ch e i ri sultati riportati n ella Tab. 5 sono la media d ei dati ot t enuti in diversi esperimenti, è a ltrettanto ovvio ch e usand o uno qualsiasi
dei sistemi di eluizione cht> sono stati d escritti si ottiene sempre la stessa
costante di integrazione; una riprova d ella riproducibilità qua n t itativa dei
d a ti ottt•n uti è rappresentata dal fatto ch e l<' cost a nti di integrazione otte-
Costanti di Integrazione (CH\\') del DNP-ammlnoacldl
l
l
l
l
C'u w
( 'u\·cttn
D l\ l '· A llllllÌilOII('Ìd i
U,l f.LM
m l 'l
('nnuulno
otti<'o
nuu lO
eHw
(~ t
('uw
vetta
! 'nvl'tt.n.
l l!\ P ·AilliiiÌilOII{'Ìili
!1. 1 f.L)I
f.l.l 10!1
Cu.nuuino
mi 2
('umntiuo
ottico
ottico
1011\
15
01111
l
lO
l
l
Ca w
l
('uvottu
f.l.l 100
('H.tnnlino
ottil'u
111111
l ...
l
l
I soleucinu
l
l
l
l ' 75
2,60
l
Acido aspart icu
l ,80
3,07
Lt>ucina
l ' 74
2,68
Treonina
2,24
3,36
Valina
2,39
3,64
Serina
l ,80
2,85
Fenilalanina
l' 96
3,02
Me t ionina So lfont'
2,28
3,42
Metionina
l ' 14
l ' 71
Glutammin a
2,55
3,63
3,84
Alnninu
2, 19
3,4 1
Aspnragina
2,54
Pro lin n
2,59
3,84
di- Istidina
2,S2
3,28
1,71
3,03
l
l , 66
2,49
di- Tirosinn
l ' 21
l , 90
o- Tir os iua
0,27
0,3S
Glicina
0,94
l ,55
Arginina
2,46
3,29
di- Lisina
2,81
4, 73
t - Listino
2,59
3,64
Acido glutammico
2, 16
3,74
a- Ist idinu
1,64
2,46
S - Cnrb os8i
ste iun
l ,03
l ,54
Triptofano
Acido cist eico
l
mt'tiJri-
0
)
Ripresa da (').
D ensitit ott icn 340 lllf.l.·
Rt>ll'Ì~ traturt•: vl'luc ità d Pila cnr t n 2S crn/ orn .
(
• 1 1111.
J s l • ."111/Wr. S1111ilà ( 19GG) 2 , 187·2 10.
TENTORI
205
nute usando la c u vetta con cammmo ottico di lO mm sono inferiori d el
50 % a quelle ottenute usando la cuvetta con cammino ottico di 15 m m.
Na t uralmente le costanti di integrazion e p er i D N P-amminoacidi idrosolubili sep a r a ti con la colonna corta non sono confrontabili con quelle degli
stessi composti sep a ra ti con la colonna normale poichè nel primo caso il
flusso d ella soluzion e r lucnte è superio re.
I limiti di errore ch e abbia mo osservato, anche n ei casi m en o fa vorevoli
non hanno mai superat o il 4 %· Quant ità di DN P-amminoacidi fino a 0,05
micromoli se si usa la cu vetta con cammino ottico di lO mm e fino a 0,025
micromoli se si usa la cu vetta da 15 mm emergon o in picchi b en d efi n iti
e riproducibili che p ossono esser e usati sia per l'identificazion e ch e per la
calibrazione. C'è ancora, n aturalmente, da osserv are che ques te cost a nti
di integrazione sono strettamente dipendenti d alle condizioni sp erimentali
ed in p a rticolare d al flusso d el gradiente e d alla velocità della carta n el registratore; è quindi consigliabile ed opportuno ch e venga no stabilite per
ciascun a pparecchio a seconda d elle n ecessità sperimentali . L 'esposizion e
dell'argomento più strettamente connesso con il titolo di questo semina rio
sar ebbe qui t erminata. Tutta via, poich è effettiva mente qu esto me todo è
stato d a n oi a pplica to alla determinazione d ei residui N H 2-terminali di alcune e moglobine di anfibi, non sembra fuori di luogo esporre alcune considerazioni relative alla risoluzione d el problema della det erminazione dei
residui N H 2-terminali delle proteine.
Rhinesmith e coli. (5 ) hanno eseguito nel 1957 la de terminazione dci
residui NH2 -terminali d ella emoglobina uma na con il m etodo d i San ger (').
In q uest o lavoro ven gono discussi in m odo m olto esauriente i fattori che influiscono in maniera det ermina nte sulla a pplicazion e qua ntita tiva del metodo di Sanger (') a lla det erminazione d egli a mminoacidi N H 2-termin ali
d elle proteine. In breve questi fattori sono : l) la dinitrofenilazion e q u antitativa d ella proteina; 2) l' idrolisi qua ntitativa d ella proteina; 3) l'equivalenza tra la p rotein a libera e la prot eina dinitrofenilata; 4) la distribuzione
d ei DNP-a mminoacid i t erminali durante l'idrolisi d ella D N P-pro tcina, c
finalmente 5) la perdita dei D N P -amminoacidi dura nte l'estrazion e e le operazioni di cromatografia.
Mi sembra opportuno discutere brevem ente ciascuno di q uesti punti.
l) P er q uello ch e riguarda la dini t ro fenilazione delle emoproteine,
Rhinesmit h e coli. (•) con siglia n o il me tod o di Levy e Li (6 ) , eseguito in mezzo acquoso ad evita re la possibilità di una iniziale de naturazione d ella p roteina. Con questa tecnica gli Autori suddetti otten gono una dinitrofe nilazion e comple ta in l ora. Noi abbiamo seguito il m et odo di Levy e Li (6 ),
in mezzo acquoso ta mponato, usando un pH-stato per far e in modo ch e la
rrazione avvf'n ga co mpleta mente nelle st esse condizioni ottimali di pH
. 11111. 1.<1.•'òuper. S a ni/li ( I!Wil) 2 , I Si · t lll .
20fi
S EMINARI DI CROMAT OGRAF IA
cw e a pH 8,5 - 9. Registrando il grafico d el pH-stato, cioè le aggiunte
di NaOH che il pH-stato fa automaticam ente alla miscela per manten ere
costante il pH, contro il t empo di reazion e, si può esprimere un giudizio
sull'andamento della dinitrofenilazione (Fig. 9). Come si vede, la curva
comincia a salire piuttosto rapidame nte al momento d ell'aggiunta d t<l di -
Fijr. 9. -
16'
32'
48'
64'
Consumo di "aOH durante la d initrofenilazione. Riprod otta dn ( 4 ).
80'
96'
T1m P ,.... l.
nitrofluorobenzene, p er la produzione di acido fiuoridrico dovuta, come ab biamo d etto, alla reazione del DNFB con la prot eina ; dopo un certo periodo la curva t ende ad assumere un anda m ento costante dovuto esclusivamente alla presenza di
n el sist em a .
A questo punto la reazione vien e considerata completa ed estrapolando
al tempo O questa seconda parte d ella curv a è possibile calcolare l'idrato
sodico effettivamente consumato p er n eutralizzare l'acido fluoridrico e quindi la quantità di DNFB ch e effettivamente ha reagito con la proteina ed
ovviamente i r esidui di amminoacidi ch e sono stati dinitrofenilati. Secondo
la nostra esperienza la dinitrofenilazione è completa con questo m etodo
dopo 90-120 minuti dall'inizio della reazione .
co2
2) L 'idrolisi della proteina dinitrofenilata n on costituisce pm oggi il
problema che costituiva n el passato. Esist e infatti un procedimento ormai
standardizzato ch e assicura una completa idrolisi d ei legami p eptidici e la
minore possibile distruzione d ei pro dotti di idrolisi. Si tratta di una idrolisi
acida eseguita in fiale chiuse sotto un vuoto spinto .
3) P er quello che riguarda il calcolo d ella equi valenza ponderale fra
la proteina, diciamo così, nativa e la prot eina dinitrofenilata, esso è attualmente molto semplificato ~ia dalla conoscenza della quantità d i dinitrofluorobenzen e consumato n ella r eazion e di dinitrofenilazione, ch e, come ab. 11111. Jsl . 811 /H'r. S u n ilti (l9GG) 2 . 18 7·2 111 .
T ENT ORI
207
biamo vis to si può dedurre dalla curva del pH-stato, sia d alla conoscenza
della composizione in a mminoacidi d ella proteina, ch e può essere de terminata sperimentalmente.
A questo proposito è d a ricord a re ch e quando il dinitrofluorobenzen e
rea gisce con una proteina o peptide, oltre ov via mente a ma rcare, mediante
dinitro fenilazione, il gruppo ex-a mminico d ell'a mminoacido N -terminale, r eagisce a n ch e con alcuni gruppi laterali di altri amminoacidi presenti n ella
catena polipeptidica . Precisamente t ali gruppi laterali sono l'ossidrile del
gruppo fen olico della tirosina c he d à luogo alla 0-DN P-tirosina, il gruppo
a mminico libero da l legame p eptidico, ch e è contenuto n ella lisina che dà
luogo alla E-DN P-lisina, il gruppo imminico d ell'anello imidazolico della
istidina ch e dà luogo alla N -imidazol-DNP-istidina, e infine il gruppo tiolico d ella cis teina, ch e dà luogo alla mono DNP-S-cisteina. Naturalment e
qua lora uno di ques ti amminoacidi fosse N -terminale di una proteina, quest o r esiduo N-terminale v errebbe marcato a nch e nel gruppo ex-ammini co,
ch e in quest o caso sarebbe liber o ; si tro verebbe, d opo l' idrolisi della pr oteina, un residuo di-dinitrofenilderi vato cioè con due residui dinitro feni lici :
in pra tica possiamo trova r e di-DNP-lisina, di -D N P -istidina, di-DNP-tirosina e di -D N P-cist eina. Appunto p er liberarsi dei m ono-DNP -amminoacidi che ven gono comunque dinitrofenilati durante la dinitrofenilazion e di
una prot eina o di un peptide, si fa seguire alla dinitrofenilazione cd alla idrolisi l'estrazion e et erea poich è questi m ono D N P-amminoacidi, conservando
il lo ro ca ra ttere di dipolarità, restano n ella fase acquosa ; l' uni co d ei DNP·amminoacidi deriv ati dalla dinitrofenilazione del residuo NH2 -terminale
ch e r esta anch e esso n ella fase acquosa , p oichè conserv a la dipola rità, è
l a D N P-a rginina insiem e all'acido D NP-cist eico ch e è comunque u n prodotto di ossidazione. Del res to, come abbiamo già v isto, è ora p ossibile separa re con una sola colonna tutti i D N P-amminoacidi et er e-solubili ed idrosolubili ch e p ossono essere liberati dalla idrolisi di una prot eina dinitrofenilata .
P er torna re al calcolo del ra pporto pondera le fra una proteina n ativa
e la st essa p rotein a d initrofenìlata, è ovvio ch e l' introduzione dei radicali
dinitrofenilici n ei suddetti a mminoacidi compresi n ella catena p olipeptidi ca
spost a quest o ra pporto in favo re della prot eina dinitrofenilata; è tuttavia
p ossibile, conoscendo il nume ro d ei residui lisile, istidile, tirosile e cist einile contenuti in una molecola proteica, calcolare con esattezza l' incr emento
pondera te di quest a p ro teina do vuto alla introduzion e d ei corrispon den ti
r adicali dinitrofc nilici ed introdurre quindi questo dato n el calcolo d el ri cup er o d el r esiduo NH2 -terminale.
In questo calcolo v a n a turalmente tenuto conto anch e dell'au mento
ponderale d ella D N P-proteina dov uto alla umidità : la n ostra esp eri enza
ha conferma to il d ato d i Rhinesmith e coli. ( ~) secondo i quali la D N P-pro. I 1W.
/ s i.
S~tper.
Stwilù ( I VI iH) 2.
1 8 i·~ I H.
208
SEMINARI DI CROMATO GRA F I A
t eina, dopo una permane n za di tre giorm m essiccator e su acido solforico
a tt>mperatura ambi ente p erd e circa il 5 % dt>l suo peso .
4) È n oto da t empo ch e la distruzione d ei D N P-amminoacidi durante
la idrolisi a cida di una proteina dinitrofenilata è estremame n te variabile a
seconda d ei vari amminoacidi, delle prot eine e d el te m po di i drolisi ; è quindi
assolutamente n ecessario s tabilire per ogni proteina e p er ogni amminoacido
il t empo ottimale di idrolisi ch e assicuri il massi mo di comple tezza della
idrolisi ed il minimo di di struzi on e del DN P-amminoacido .
N on è p ossibile stabilire sperimentalmen te questi d a ti calcola ndo i ricuperi di una miscela di D N P-a mminoacidi sintetici prima e dopo ch e questa miscela si a stata sottopost a alle stesse condizioni sp erimentali in cui
si esegu e l'idrolisi d ella D N P-proteina, dato ch e n ella distru zion e dci DN P·amminoacidi durante l 'idrolisi acida gi u oca fra l'altro un ruolo importa nte
anch e la loro posizione n ella molecola proteica.
•
Noi operiamo n el m odo seguente : sottoponi a m o la p roteina dinitrofenilata a quattro differ enti tempi di idrolisi e calcoliamo il ri cupero d ei
D N P -amminoacidi estra p ola nd o al t em po O le cu rve così ottenute, com t>
è dimostrato n ella Fig. l O nella quale sono r a ppresentati i risulta ti d egli
~Mr-------------------------------,
DN P-Glycine
F ijr. l O. -
12
• Unfril ct lonil ted F"rog Hemoglobin
o Component l
16
ftm~
t hours J
2L
Estrapolazione a zero dei ricuperi d ella glicina N H 2-t erminale della emoglobin a t ot ale di
r a na e dei tre compon enti di
essa, il t empi different i. SuiJe
or dinate sono rip orta t i i ricup eri della DN P-glicinll, e sulle
ascisse i t empi di idrolisi. Riprodotta d a (4 ) .
o Component Il
o Componont Ili
esp eri menti eseguiti p er la determinazione dci ricuperi d ella glicina N H 2·terminale sia d ella em oglobina totale di rana ch e d ei tre componenti d i essa.
Sulle ordinate sono riportati i ric uperi della D N P-glicina e sull'ascissa i
t empi di idrolisi .
5) La p erdita d ei DN P-derivati durante i procedimenti di estrazi on e
è praticamente nulla; infatti i ricuperi di una miscela di sta ndard prima e
dopo l'estrazione eterea sono identici .
Anch e il procedimento croma tografico non compor ta alcuna p erdita di
materiale, come è dimostrato dalla inv aria bilit à delle costanti di integrazione.
A1111. l xi . Stt]rrr. Swril<i (19GGl 2, 18 7· 2 10.
TENTORI
209
Nelle condizioni sperimentali fissate in base a quest e considerazioni abbiamo ottenuto nel caso della emoglobina umana un ricupero della valina
NH 1-terminale pari al 93 % del teorico calcolato sulla base del peso molecolare di 64500. Abbiamo inoltre riesaminato il ricupero ottenuto da Rhinesmith e coli. (6 ) introducendo nel calcolo il peso molecolare reale della
emoglobina umana calcolato dalla sua composizione in amminoacidi, cioè
64500, alquanto differ ente da quello usato da questi Autori nel loro calcolo,
che era stato det erminato m ediante ultracentrifugazione: il recupero così
corretto risulta essere dell'87 %·
Nel caso delle varie emoproteine di anfibi che abbiamo studiato, i ricuperi degli amminoacidi NH 1 -terminali sono compresi tra il 90 ed il 98 %
rispetto ai teorici calcolati sulla base dei pesi molecolari det erminati mediante ultracentrifugazione ed osmometria.
Un esempio è raffigurato nella Tab. 6 in cui sono riportati i ricuperi
della glicina N-terminale delle emoglobine di rana. Tenendo conto del fatto
TABELLA 6 (•)
Recuperl della glicina N·termlnale della emoglobina dl rana. Peso molecolare 68.000
DNP·Ollolna
(M/.llHb)
Hb di r ana, non frazionata
I
3,6
Componente
3,9
Il Componente
3,4
III Comp onent e
3 ,6
(•) Ripresa eia (4).
che il peso molecolare usato per il calcolo, cioè 68000, è alquanto pm alto
di quello risultante da calcoli compiuti sulla base della composizione in amminoacidi di queste emoproteine, questi ricuperi possono esser e considerati
davvero eccellenti.
BIBLIOGRAFIA
(l) F. SANGER. The Free Amino Groups of lnsulin. Biochem. J ., 39, 507 (1945).
P. Eo!KAN. Method for Det ermination of the Amino Acid Sequence in Peptides. Acta
Chem. Scand., 4, 283 (1950).
( 3) L. K ESSNER, E. MuNTWYLER, G. E. GRIFFIN & I. AuRAMS. Automatic Column Chromatography of E ther-aud W ater-Soluble 2, 4-Dinitrophenyl-Derivatives of Amino Acids,
Peptides, nnd Amines. Anal. Chem., 35, 83 (1963).
2
( )
A"''· ! st . SuJ>er. Suu'ilà (l !Hill) 2 , l ~ 7 · 2111.
210
SEMIN.4.RI DI CROMATOGMFU
(•) L. TENTORI, G. VlvALDI , S. CARTA, S. VELAI'il & l. MAND.4.RA. Thc uutomntic sepn-
( 6)
(6)
rution b y column c hromatography of ether and water soluble 2. 4-DNP-derivatives
of aminoacids. Proc. 1965 Technicon S_ymp. 011 Anal_ytical Chemisrry, New York, M<"diad lnc. 1966, p. 659.
H. S. RHINESMITII , W. A. SCHROEDER & L. PAULING. The -terminud Amino Acid
Residues of Nor ma! Adult Hrmoglobin A. Quantitative Study of Certain Aspects of
Sanger's D P - Method. ) . Am. Chem. Soc., 79. 609 {1957).
A. L. LEVY & C. H . LI. Kinetic studies on the r eaction of N-t ermina i p:roup r eagents
with a -corticotropin, and - terminai g roup analysis. J . Bio/. Chem .. 213 . 487 (1955).
Ann. J sl.
Sttpcr. Sunilù (1066) 2, 187·2 10.