Diagnosi di infezione da Filovirus e
Da febbre emorragica di Crimea Congo
Concetta Castilletti
[email protected]
National Institute for Infectious Diseases, INMI “L. Spallanzani”, Rome, Italy
Il ruolo del laboratorio nella diagnosi delle zoonosi e delle malattie trasmesse da vettori. Corso teorico-pratico
Istituto Nazionale per le Malattie Infettive Lazzaro Spallanzani Roma 1-2 ottobre 2014
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1
La febbre emorragica di Congo-Crimea
(CCHF) è un’infezione virale endemica in
parte dell’Africa Africa, in Asia, nel sud est
europeo e in Medio Oriente.
L’agente eziologico, CCHFV, genere
Nairovirus, famiglia Bunyaviridae, è causa
di una zoonosi severa a rischio di
trasmissione nosocomiale.
L’infezione è direttamente correlata alla
presenza nel territorio del vettore, una
zecca appartenente nella maggior parte
dei casi al genere Hyalomma.
Il nome del virus e legato al luogo in cui
per la prima volta è stata descritta la
malattia, la Crimea nel 1944, ed al luogo
in cui per la prima volta è stato isolato il
virus, Congo nel 1956.
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Bunyaviridae
• Family: Bunyaviridae
•
Genus: Orthobunyavirus
Phlebovirus
Hantavirus
Tospovirus
Nairovirus
Genus Nairovirus (distinguished by L segment) has approximately
34 described tick-borne viruses that are grouped into seven
serogroups. Among these, only three members are known to cause
disease in humans and they are CCHF, Nairobi sheep disease virus,
and Dugbe virus.
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3
Schematic cross-section of a Bunyaviridae virion
RNA singolo filamento a, polarità 3 segmenti
- small (S, proteina nucleocapsidica)
- medium (M, glycoproteina)
- large (L, polimerasi virale)
Il segmento M codifica anche per la
proteina non-strutturale NSM di
recente individuazione nel genoma
del CCHFV
Il Nucleocapside e l’RNA polimerasi
RNA-dipendente sono contenute
all’interno di un envelope lipidico
che ancora le glicoproteine virali.
Il virione presenta una forma sferica con un diametro di circa 100 nm, ed è ricoperto da un
doppio strato lipidico acquisito durante il processo di gemmazione con uno spessore di circa
5-7 nm, al quale sono ancorate le glicoproteine virali di 8-10 nm di lunghezza.
5
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Ciclo replicativo
6
CCHFV comprende 6 clades geneticamente distinti
basati sulla sequenza parziale del segmento S
Bente DA et al Antiviral Res 2013
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How is CCHF virus spread and how do
human become infected ?
CCHF virus circulates in a silent enzootic tick-vertebratetick cycle, and there is no evidence that the virus causes
any disease in animals
Ticks from the Hyalomma genus are both reservoir and
the principal vectors of CCHF virus
Hyalomma marginatum is the main vector for CCHF in
southern Europe
Hares and hedgehogs act as amplifying hosts for the
immature stages of the ticks. Domestic animals (cattle,
goats, sheep, etc.) are the usual hosts for the adult ticks
Transmission to humans occurs following a tick bite or
through contact with infected blood and tissues
Many birds are resistant to infection, but ostriches are
susceptible and may show a high prevalence of
infection in endemic areas.
8
CDC CCHFV factsheet
Virus spreads from the initial infection site to
regional lymph nodes, liver and spleen,
infects tissue macrophages and dendritic
cells.
Soluble factors released from infected
monocytes and macrophages.
Appannanavar 2011
Haemodynamic and coagulation disorders
exacerbated by infection of hepatocytes
and adrenal cortical cells.
Reduced synthesis of albumin
results in a reduced plasma
osmotic pressure and edema.
Impaired secretion of steroidsynthesizing enzymes by
CCHFV−infected adrenal
cortical cells leads to
hypotension.
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9
Symptoms of Crimean-Congo hemorrhagic fever - 1
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Symptoms of Crimean-Congo hemorrhagic fever - 2
The average mortality rate is often reported at 3050%
Rates as high as 72.7% and 80% have been
reported from United Arab Emirates and China,
respectively
Mortality rates of nosocomial infection are often
higher than those naturally acquired through tick
bite (probably related to viral dose)
For those who do not succumb to the disease, the
convalescence period begins 15-20 days after onset of illness
Sequelae (polyneuritis, headache, nausea, loss of
memory, loss of hearing) are rarely permanent,
but may persist for 1 year or more
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CCHF geographic distribution
Eastern and southern
Europe
Mediterranean area
northwestern China
central Asia
Africa
Middle East
Indian subcontinent.
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2009
2010
Reported human CCHF cases (A and B) and reported tick bites (C and D) in Southern Kazakhstan
Knust EID 2012
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Humans become infected through bites
of infected ticks or by contact with
infected blood or other tissues of
livestock.
Risk groups are farmers, veterinarians
and abattoir workers in endemic
areas.
Nosocomial transmission may occur
through direct contact with infected
blood or body fluids or contaminated
medical equipment or supply
Meat itself is not the source of infection
because the virus is inactivated by postslaughter acidification of the tissue; and
CCHFV does not survive cooking.
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Corso teorico-pratico
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Appannanavar 2011
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Prevention and control
Prevention and control of CCHF infection is achieved by avoiding or
minimising the exposure to infected ticks.
Insect repellents containing DEET are effective in protecting against ticks.
Wearing protective clothing and early and correct removal of
ticks are recommended.
Nosocomial cases of CCHF are quite common and often result in high
mortality, strict universal precautions, including barrier nursing, should be
taken with hospitalised cases, as with other haemorrhagic fevers.
A vaccine derived from inactivated mouse brain is used in Bulgaria, but it is
not widely available, and efficiency and safety have to be reevaluated, as
well as specific human immunoglobulin used for postexposure prophylaxis.
In endemic areas, a measure of tick control has been achieved by
environmental sanitation of underbrush habitats.
Acaricides may be useful on domestic animals to control CCHF virusinfected ticks if used 10–14 days prior to slaughter or to export of animals
from enzootic regions.
CDC CCHFV factsheet
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Ribavirin is the antiviral of choise
The goal of therapy is the prevention of fatality
Since there is no validated specific antiviral therapy for CCHF, treatment relies on
supportive care, including the administration of thrombocytes, fresh frozen
plasma, and erythrocyte preparations.
Oral or intravenous ribavirin has been used with reported success, although not
confirmed benefit for treatment has to be re-evaluated.
In clinical practice was found to be beneficial, especially at earlier phase of
infection
Ribavirin was shown to be effective against CCHFV in vitro, in suckling mice,
ribavirin treatment reduced CCHFV growth in the liver, significantly decreased
viremia, significantly reduced mortality and extended the geometric mean time
to death
Ribavirin is the only antiviral drug used to treat viral hemorragic fever
syndromes, including CCHF and Lassa fever
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Esiste un vaccino sviluppato
in Unione Sovietica nel
1970 , che è stato
dimostrato indurre la
produzione di anticorpi
neutralizzanti in vitro.
Un vaccino simile è tutt’ora
utilizzato in Bulgaria nei
soggetti a rischio.
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EID 2012
24
Conclusioni 1
Necessità di metodi standardizzati e della validazione dei test
utilizzati mediante EQA nei paesi di endemia.
Stretta correlazione tra il paese di origine del paziente e la sensibilità del test
utilizzaoto : qRT-PCR (p<0.001).
Infatti, la qRT-PCR è risultata essere meno sensibile nella diagnosi di infezione
da CCHFV nei pazienti provenienti soprattutto dalla Turchia e dall’Albania,
rispetto a Iran, Kosovo, Albania, Turchia, ed Africa sub-sahariana
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Conclusioni 2
The sensitivity of the selected molecular assays was found to be more
modest (79.6% for qRT-PCR and 83.3% for LCD array) than for serologic
methods and to be associated with the patient country of origin.
This result is consistent with the finding that the application of molecular
assays in different settings is hampered by the high diversity of the CCHFV
genomes, whereas serologic methods can have a broader use due to
cross-reactivities.
In particular, the qRT-PCR seems to be less sensitive for patients
originating from the Balkans region and Turkey than for patients from
other countries compared with in-house reference molecular methods.
The in-house methods developed by reference laboratories are optimized
for detection of strains circulating in that area, which may result in a
lower detection limit when compared with methods that cover a broader
spectrum.
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Laboratory diagnosis:
viral isolation
Any attempts at isolating and culturing
the virus should only be performed in a
maximum biocontainment laboratory
(i.e., BSL-4)
The traditional method for CCHFV
isolation has been by intracranial (i.c.) or
intraperitoneal (i.p.) inoculation of a
sample (e.g., blood from an acute-phase
patient or ground tick pools) into
newborn mice
Isolation in cell culture: (easier, more rapid result, but less sensitive) virus can
be isolated from blood and organ suspensions in a wide variety of susceptible
cell lines including LLC-MK2,Vero, A549, HuH7, BHK-21, SW-13
At autopsy, virus is most likely to be found in the lung, liver, spleen, bone
marrow, kidney and brain
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Laboratory diagnosis: Electronic microscopy
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Laboratory diagnosis: molecular assays
CCHF Real-Time PCR
VHF/VARIOLA-PCR / Contract No SSPE-CT-2003-502567 (Modified)
Target: S segment, NP gene
Position ref (NC_005302): 1068-1248 (181bp)
Wölfel R, et al. Virus detection and monitoring of viral load in Crimean-Congo
hemorrhagic fever virus patients. EID 2007
Platform: LightCycler 2.0
Master Mix: SuperScript III one-step qRT-PCR
External Quality Assurance (EQA) for Crimean Congo Hemorrhagic Fever diagnostics
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2011
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Detection of CCHFV genome in saliva and urine
Bodun H et al. IJID 2010
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Laboratory diagnosis: serology
CCHF specific IgM and IgG IFA on home-made slides
Specific IgM persists for up to
4 months post-infection
IgG remains detectable for at
least 5 years.
Negative sample
IgM positive sample
IgG positive sample
Recent or current infection is confirmed by demonstrating using IgM antibody capture
(MAC)-ELISA in a single sample, or a fourfold or greater increase in antibody titer in
paired serum samples.
For confirmation is also possible to perform microneutralization assay
Recently, a recombinant nucleoprotein (rNP)-based IgG ELISA was developed for
serological diagnosis of CCHF virus infections; this was shown to be a valuable tool for
diagnosis and epidemiological investigations of CCHFV infections.
Similarly, CCHFV rNP-based IgM-capture ELISA has shown to be a useful method for
diagnosis of CCHFV infections.
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CCHF : viral/antibody kinetics
IgM
IgG
viremia
0
5
RT-PCR
10
16
Viral isolation
Antibodies
IgM duration: 2-3 months up to 6 months…
33
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Jabbari Anesthesia:2013
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Differential Diagnosis 1
Due to the extended CCHFV geographical distribution (Africa, southern
Europe, Middle East,Russia, India, and China), other viral etiologies have to
be considered according to the origin of the patient and the risks of potential
exposure:
Alkhurma fever and Rift Valley fever in the Middle East;
Omsk hemorrhagic fever in Russia;
Kyasanur Forest disease in India;
Hantaviruses in Europe and Asia;
Lassa, Ebola, Marburg, Rift Valley fever, yellow fever in Africa;
Dengue in various locations.
In tropical and subtropical countries, malaria is the most important alternative
diagnosis to be excluded in cases of suspected VHF.
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Differential Diagnosis 2
The differential diagnosis list should also include:
hepatitis viruses,
toxic shock syndrome,
influenza,
salmonellosis
neisseria meningitidis,
shigellosis,
leptospirosis,
psittacosis,
borreliosis,
trypanosomiasis,
typhoid,
septicemic plague,
rickettsiosis,
rubella,
Q fever (Coxiella burnetii)
measles,
staphylococcal or gram-negative sepsis,
hemorrhagic smallpox
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Filovirus:
diagnostica di laboratorio
National Institute for Infectious Diseases, INMI “L. Spallanzani”, Rome, Italy
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Divergenza genetica
• Particella pleiomorfa, allungata, 80nm di
diametro x 130-14,000nm di lunghezza
dotata di envelope
• Genome: singolo filamento di RNA a polarità
negativa, lineare, non-frammentato
• Codifica per 7 proteine
Divergenza genetica
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Le proteine virali
Gene NP: proteina NP strutturale di 83.3 Kd
Gene L: RNA-polimerasi RNA dipendente
Gene GP: glicoproteina GP (2 forme: trans-membrana e secretoria)
Geni VP:
VP40: proteina di matrice per la sua carica positiva facilita la gemmazione
VP30: proteina fosforilata con funzione di attivazione e modulazione della trascrizione (incapsidamento
RNA)
VP35: proteina coinvolta in eventi trascrizionali; inibisce l’attivazione del sistema IFN contribuendo alla
patogenicità dei filovirus
VP24: proteina associata alla matrice; la funzione rimane ambigua
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Outbreaks of Ebola Virus Diseases: the past
22 outbreaks, since 1976
•2322 cases, about 1700 deaths
•Case fatality rate around 60-70%
(up to 90%)
•The oldest outbreak: Jul-Nov 1976
South Sudan 284 (deaths 151)
•The biggest outbreak: Oct 2000Feb 2001 Uganda 425 (deaths 224)
•Countries with previous
outbreaks: South Sudan, Gabon,
Ivory Coast, Uganda, Republic of
Congo
Pigott et al., Life 2014
Outbreaks of Ebola Virus Diseases: present
West
Africa
>6000
Pigott et al., Life 2014
Origine della Epidemia in
Africa Occidentale
• Caso indice: bambino di due anni
in Guinea, deceduto il 6 dicembre
• 5 membri della sua famiglia si
ammalano
• Una ostetrica aiuta la famiglia, si
ammala e trasmette ad altri 6 in
un altro villaggio
• Operatori sanitari dell’ospedale
della vicina cittadina prestano
assistenza ai malati e contraggono
il virus
• Con la partecipazione ai funerali
si infettano altre 20 persone, che
introducono il virus in altri
distretti
• L’epidemia è ormai innescata.
Baize et al., NEJM 2014
I numeri di Ebola 2014
WHO roadmap update 26 settembre 2014
Country
Total Cases
Total Deaths
Liberia
3,458
1,830
Sierra Leone
2,021
605
Guinea
1,074
648
Nigeria
20
8
Senegal
1
0
Total
6,574
3,091
DR Congo
70
42
I numeri dell’epidemia in corso, rispetto alle epidemie
precedenti, sono incredibilmente più alti
Distribuzione geografica attuale
MVE dinamica delle epidemie
Olival, Viruses 2014
Bat species found filovirus positive by serology or PCR
Bats: a Pandora’s box
for emerging viruses
Bats are an ancient
mammals group (65
millions years ago)
Geographic range for potential bat host
Reston
ebolavirus
Marburgvirus
Lloviu virus
Zaire ebolavirus
Olival, Viruses 2014
Predicted geographical distribution of the three species of
Megachiroptera suspected to reservoir Ebola virus
hammer-headed bat
(Hypsignathus monstrosus)
Franquet's epauletted fruit bat
(Epomops franqueti)
little collared fruit bat
(Myonycteris torquata)
MVE dinamica delle epidemie
Pigott et al., Life 2014
Bushmeat on sale
Filovirus pathogenesis
GP media l’ingresso del
virus nella cellula ospite e
favorisce i meccanismi di
escape.
Il virus si diffonde
attraverso il torrente
circolatorio e si replica
attivamente in:
• macrofagi/monociti
• cellule dendritiche
• cellule endoteliali
• organi (fegato, rene,
milza, ovaio, testicoli ed
organi linfatici)
le lesioni principali
sembrano essere a carico
dell’endotelio vascolare.
Feldmann, Lancet 2011
The standard treatment for Ebola remains supportive therapy.
This includes the following measures:
• balancing the patients' fluids and electrolytes;
• maintaining their oxygen status and blood pressure; and
• treating them for any complicating infections.
The most effective way to stop the current Ebola outbreak in West
Africa is meticulous work in finding Ebola cases, isolating and
caring for those patients, and tracing contacts to stop the chains of
transmission
It means educating people about safe burial practices and having
health care workers strictly
follow infection control
in hospitals
This is how all previous Ebola
outbreaks have been stopped
Perché
una così grande epidemia?
• Una epidemia da virus Ebola sarebbe,
in teoria, relativamente facile da
contenere
• Il periodo di incubazione è abbastanza lungo (circa 7 giorni in
media) e quindi consente una ricerca dei contatti;
• La patologia non sembra essere trasmissibile in assenza di sintomi,
e quindi basterebbe isolare i malati in fase sintomatica;
• Le precauzioni standard e da contatto si sono dimostrate efficaci
nel prevenire la maggioranza delle trasmissioni
Perché
una così grande epidemia?
• Povertà
• Situazione drammatica dei sistemi sanitari assistenziali;
• Inesistenza/inefficienza di strutture di sanità pubblica;
• Frontiere molto facili da attraversare;
• Scarsa collaborazione (ed evidente ostilità delle popolazioni
locali);
• Paura, credenze locali, stigma;
• Sottostima del problema e lentezza degli interventi di aiuto
internazionale.
Perché una così grande epidemia?
Povertà e scarsità di risorse
sanitarie
• Secondo l’Indice di Sviluppo Umano
(HDI) 2014, su 187 paesi i tre paesi
colpiti (Liberia, Guinea, Sierra Leone) sono rispettivamente
in posizione 175, 179, 183;
– Norvegia 1, Italia 26, Niger 187
• Due tra questi paesi escono da una lunga guerra civile;
• In Liberia, ogni 100.000 persone, sono presenti 1 medico e circa 17
tra infermieri e ostetriche;
• Le strutture di sanità pubblica deputate al monitoraggio delle
epidemie sono inefficaci;
• Le procedure di Infection Control all’interno degli ospedali sono
sostanzialmente inesistenti.
Perché una così grande epidemia?
Frontiere molto “porose”
• La ricerca di lavoro porta molte persone a spostarsi
quotidianamente tra i diversi paesi nelle zone di frontiera;
• Spesso le frontiere dividono popoli della stessa etnia, o dello
stesso gruppo familiare;
• La partecipazione ai funerali di membri della propria famiglia ha
costituito la modalità di ingresso del virus in Sierra Leone.
Chan M, NEJM 2014
Kucharski J, Eurosurv
2014
Guinea
Sierra Leone
Liberia
Parametri epidemiologici della epidemia di EVD in corso in Africa
Occidentale
(WHO Ebola Response Team, NEJM, Sept 2014)
61
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Diagnostica differenziale
• Malaria
• Dengue
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Febbre tifoide
Shigellosi
Colera
Leptospirosi
Peste
Rickettsiosi
Febbre ricorrente
Borreliosi da pidocchi
Meningiti e sepsi
• Epatiti
• Altre febbri emorragiche virali
Algoritmo di laboratorio
Blood specimens sent to
BSL3/4 VHF national
reference laboratory
Ricerca del virus mediante test di
biologia molecolare
Rilevazione di una sequenza genica
Conferma dei positivi con un metodo basato su un
target diverso, ed esecuzione di una PCR classica
Caratterizzazione mediante sequenziamento della
regione amplificata con PCR classica
Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio
clinico
68
Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000)
L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi;
la sensibilità dei test non è un problema rilevante
Towner, J Virol 2004
Available molecular methods; In house
Target(s)
Source
Technique
EBOV, VP24
EBOV, NP
SUDV, NP
EBOV, NP
PanFiloviridae, L
PanFiloviridae, L
Pan-Ebolavirus, NP
EBOV, NP
EBOV, GP
SUDV, NP
SUDV, GP
TAFV, GP 1
TAFV, GP 2
BDBV, NP
REST, VP40
REST, GP
Pan-Ebolavirus*, L
EBOV, NP
EBOV, 5' trailer region
Pan-Filovirus*, L
EBOV, NP
SUDV, NP
EBOV, SUDV, NP
Pan-Ebolavirus, L
Pan-Ebolavirus, GP
Pan-Filovirus*, L
Pan-Ebolavirus8, GP
EBOV, NP
RESTV, NP
EBOV, GP 1
EBOV Gabon, L
Gire
Euler
Euler
Huang
Grard
Grard 2011
Ogawa
Trombley
Trombley
Trombley
Trombley
Trombley
Trombley
Trombley
Trombley
Trombley
Zhai
Towner 2007
Kurosaki
Panning
Weidmann
Weidmann
Towner 2004
Drosten
Gibb
Sanchez
Sanchez
Sanchez
Sanchez
Morvan
Morvan
conventional
RPA
RPA
hydrolysis probe
conventional
conventional
conventional
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
hydrolysis probe
conventional
hydrolysis probe
RT-LAMP
hydrolysis probe
hydrolysis probe
Hydrolysis probe
conventional (nested)
SYBR green (based (62))
hydrolysis probe
conventional
conventional
conventional
conventional
Conventional (nested)
Conventional (nested)
EQA restricted to VHF reference BSL4 laboratories
have been carried out all the known ebolavirus
species (Euronetp4 network unpublished data,
GHSAG-LN)
All other PCR tests are primarily targeting EBOV,
sometimes in combination with SUDV.
An alignment of EBOV sequences available in
GenBank, including all available strains from the
current outbreak (n=101) was made for the
assessment of the in-house developed primer
sets. This demonstrated that in most primer sets
some mismatches with EBOV exist.
Based on the alignment it can be concluded there
is a 100% match for the primer sets described by
Grard , Ogawa and Gibb , BUT the primer sets by
Grard and Ogawa show a relatively great number
of degenerative nucleotides which might
decrease sensitivity.
Primer sets by Gire , Zhai , Panning , Weidmann ,
Drosten , Sanchez EBOV-GP and Morvan do have
1 or 2 mismatches but the position in the primers
is such (>5 nucleotides from 3’-end) that a loss of
sensitivity is not expected.
Available molecular methods; commercially available
Filovirus
Altona Real Star®Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0;
Ebola
Genekam Ebola (Common) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Reston) PCR
kit, (Zaire) PCR kit, (Sudan) PCR kit
Liferiver (Vacunek) (EBOV) Real Time RT-PCR kit
Lipsdiag LIPSGENE® SEBOV Kit (Sudan) / ZEBOV Kit (Zaire)
Sacace Ebola Zaire Real Time PCR kit
Genesig Ebola Real Time PCR kit, Path-EBOV (Zaire) / Path-SUDV
(Sudan)
Tib Molbiol Ebola (Zaire) Real Time PCR kit
Marburg
Liferiver (Vacunek) (MBV) Real Time RT-PCR kit
Genekam Marburg PCR kit
There is no information in literature on
performance commercial tests
Rivelazione della risposta umorale e
cellulare specifica
•Risposta umorale: eseguita mediante metodi
appositamente allestiti in laboratorio
(immunofluorescenza indiretta e test di
sieroneutralizzazione.
•Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di
linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la
rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate
viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica
delle citochine intracitoplasmatiche.
72
Anticorpi
La ricerca degli anticorpi in genere ha valore di
documentazione retrospettiva
•Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci
(< 3 settimane)
•Le IgG persistono a lungo e sembrano essere
protettive
Cinetica della comparsa di IgG e IgM
EBOV (Kikwit, DCR 1995)
IgM
IgG
Ksiazek, JID 1999
Immunofluorescenza indiretta
Negative control
IgM positive sample
IgG positive sample
Identificazione del virus
•Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4)
e successiva caratterizzazione degli isolati con
metodi immunologici o molecolari.
•In casi particolari è previsto anche lo studio
morfologico in Microscopia Elettronica, sia
sull’isolato che sul campione biologico iniziale.
78
79
Senova's prototype rapid
diagnostic for Ebola virus is being
tested in Guinea.
G Vogel Science 2014;345:1549-1550
26.03.14
First team and EMLab leave Munich ang go to Guinea
(final destination Gueckedoù)
Technology and equipment: Outline of Lab
min. 10 m²
min. 9 m²
6
5
1
1
6
2
3
5
3
2
4
Trasporto dei campioni
(ipoclorito 0,5%)
Organizzazione del lavoro
Accettazione
Inattivazione
Estrazione / Master mix
Real Time RT-PCR
Refertazione
Avvicendamento…….
05.09.14
First team and third EMLab
leave Rome and go to Liberia
(final destination Foya)
26.03.14
from Munich to Guéckédou, 05.09.14
Guinea
from Rome to Foya,
Liberia
