lezione2

BIOFILM
• I biofilm sono un concetto recente in Batteriologia
• E’ attualmente accettato che in natura le cellule
batteriche sono in stretta associazione con le superfici e
le interfacce in forme di aggregazione “multicellulare”
che sono appunto i biofilm
• Questo rende le cellule batteriche simili a molti altri tipi di
cellule viventi: capaci di esistenza UNICELLULARE, ma
generalmente residenti in comunità PLURICELLULARI
• La formazione e il mantenimento di comunità
multicellulari dipende dalla produzione di SOSTANZE
EXTRACELLULARI che insieme vanno a costituire una
vera e propria MATRICE EXTRACELLULARE ricca in
carboidrati
• Queste matrici sono estremamente variabili e
contribuiscono all’organizzazione della comunità
batterica che le ha prodotte
QUORUM SENSING
Studi recenti hanno portato alla scoperta
che il “quorum sensing” è un meccanismo
che consente ai batteri di lanciare risposte
unitarie e coordinate in una maniera che
dipende direttamente dalla densità di
popolazione
MBT508 Topics in Molecular Biology
Quorum Sensing
Quorum Sensing
• Tomasz (1965) – Gram-positive Streptococcus pneumoniae produce
a “competence factor” that controlled factors for uptake of DNA
(natural transformation)
• Nealson et al. (1970) – luminescence in the marine Gram-negative
bacterium Vibrio fischeri controlled by self-produced chemical signal
termed autoinducer
• Eberhard et al. (1981) identified the V. fischeri autoinducer signal to
be N-3-oxo-hexanoyl-L-homoserine lactone
• Engebrecht et al. (1983) cloned the genes for the signal generating
enzyme, the signal receptor and the lux genes
Quorum Sensing
• In V. fisheri, bioluminsecence only occurs when V. fischeri is at high
cell density
N-3-oxo-hexanoyl-L-homoserine
lactone
Quorum Sensing
• Fuqua et al. (1994) introduced the term “quorum sensing” to
describe cell-cell signaling in bacteria
• Early 1990’s – homologs of LuxI were discovered in different
bacterial species
• V. fischeri LuxI-LuxR signaling system becomes the paradigm for
bacterial cell-cell communication
Quorum Sensing
• Vast array of molecules are used as chemical signals – enabling
bacteria to talk to each other, and in many cases, to be multilingual
Gram-negative
bacteria
Gram-positive
bacteria
universal
language
Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa
• P. aeruginosa uses a hierarchical quorum sensing circuit to regulate
expression of virulence factors and biofilm formation
Quorum Sensing in Gram-Positive Bacteria
• Gram-positive bacteria utilizes modified oligopeptides as signaling
molecules – secreted via an ATP-binding cassette (ABC) transporter
complex
• Detectors for these signals are two-component signal transduction
systems
sensor kinase
- binding of autoinducer leads to
autophosphorylation at conserved
histidine residue
response regulator
- phosphorylation at conserved
aspartate by sensor kinase
leads to binding of regulator to
specific target promoters
BIOFILM
• Il biofilm fornisce protezione omeostatica e
stabilità di fronte ai cambiamenti ambientali ai
singoli batteri che lo compongono
• Sono comunità strutturate e specializzate
• Rappresentano una forma di sopravvivenza dei
batteri all’ambiente
• E’ un’importante forma di sopravvivenza e
diffusione anche per una serie di batteri
PATOGENI
ADESIONE ALLA SUPERFICIE
• Aderire alla superficie è per i microrganismi una
situazione favorevole dal punto di vista metabolico
• Sulle superfici che sono state a contatto con gli alimenti
le molecole organiche ed inorganiche si concentrano
formando un film con elevata presenza di nutrienti che
vengono rapidamente assimilati
• Una volta adese le cellule microbiche possono iniziare a
degradare i nutrienti e a produrre le strutture che
favoriscono l’adesione nonché la loro moltiplicazione: si
forma una dinamica rete tridimensionale
COLONIZZAZIONE DELLE
SUPERFICI
• Il biofilm è nel settore alimentare una matrice
biologicamente attiva, formata dalle cellule microbiche e
da sostanze extracellulari adese ad una superficie solida
• Può essere MONO o PLURIspecie
• Lo sviluppo di biofilm avviene in ambienti umidi e non
sterili su quasi tutti i tipi di superfici
• Sono estremamente resistenti agli agenti antimicrobici
• L’adesione dei batteri e la produzione di sostanze
diverse causano numerosi problemi all’industria
alimentare
danneggiamento degli impianti,
pericolo per la salute (Lysteria monocytogenes)
SUPERFICI DI CONTATTO
• Tutti i materiali utilizzati nel settore alimentare sono
suscettibili di formazione di biofilm
• La presenza di irregolarità nelle superfici favorisce la
formazione di biofilm
• La prima fase è rappresentata dall’adsorbimento
(processo fisico-chimico di interazione fra il
microrganismo e le superfici)
• Seguono due stadi della fase irreversibile
• Fissazione, che avviene a seguito della liberazione di
polisaccaridi extracellulari prodotti dai microrganismi
(glicocalice) o tramite l’azione di pili e fimbrie
• Colonizzazione durante la quale le microcolonie dei
batteri fissati confluiscono formando il biofilm
RESISTENZA NEI BIOFILM
• Le cellule batteriche che colonizzano la superficie
all’interno di un biofilm sono estremamente resistenti ai
trattamenti antimicrobici
• Una delle ragioni è la minore velocità di diffusione dei
biocidi attraverso la matrice del film
• A questo è legata anche la maggiore resistenza agli
antibiotici dei batteri patogeni in biofilm rispetto al
batterio isolato
• Si è inoltre osservato che anche alterazioni fisiologiche
legate ad una minore disponibilità di O2 hanno un ruolo
importante
• Più il biofilm è spesso, più microrganismi sono in fase
quiescente e quindi sono meno sensibili, ad esempio,
all’azione di disinfettanti
DERMINANTI
DELL’ADESIVITA’
• Sono implicate nell’adesione una serie di
strutture e molecole superficiali quali pili, fimbrie,
glicocalice, strato mucoso, capsula.
• L’idrofobicità e la presenza di strutture
“lanuginose” (ad esempio nelle spore) aumenta
la capacità di adesione, cui segue la
germinazione con produzione delle sostanze
extracellulari che favoriscono il consolidamento
del biofilm
• Il pH e la temperatura della superficie di contatto
influiscono sull’adesività
CEPPI IMPORTANTI
• Nell’industria lattiero-casearia e dei prodotti carnei
predominano i generi Pseudomonas e Staphylococcus
• Anche Campylobacter jejuni e Escherichia coli O157:H7
sono in grado di colonizzare le superfici
• I biofilm possono essere costituiti da più specie e le
interazioni iniziali hanno una notevole influenza sulla
struttura successiva
• I microrganismi inizialmente presenti possono favorire la
colonizzazione da parte di microrganismi
fisiologicamente “compatibili” e inibire l’adesione di altri.
• I biofilm costituiti da più specie sono più resistenti di
quelli formati da un’unica specie, perché matrici
costituite da polisaccaridi prodotti da batteri differenti
sembrano conferire maggiore stabilità
Listeria monocytogenes
• E’ un classico esempio di patogeno
“foodborne”
• Una delle difficoltà maggiori nel
controllarne la diffusione è la sua natura
UBQUITARIA
• E’ comunemente ritrovato nell’ambiente
• Forma biofilm che sono molto più
resistenti a condizioni ambientali avverse
del batterio isolato
Batteri acido lattici non starter
• La fonte di questi batteri è soprattutto una
contaminazione successiva alla pastorizzazione
del latte
• Numerosi studi hanno dimostrato che anche
questi batteri possono formare biofilm
• Anche presenti in piccole quantità sulla
superficie dei macchinari per la produzione dei
prodotti caseari hanno effetti deleteri sulla
qualità del prodotto
BIOFILM NELL’INDUSTRIA
ALIMENTARE
• I biofilm sono quindi un problema importante
nell’industria alimentare e la ricerca in questo
campo è importante per disegnare strategie atte
a eliminarli il più efficientemente possibile o a
porre un limite alla loro formazione
• L’adesione dei batteri alle superfici e lo sviluppo
dei biofilm è una fonte di contaminazioni che
possono comportare sia il deterioramento del
cibo (vedi batteri acido lattici non starter), sia la
trasmissione di malattie (vedi Listeria
monocytogenes)
COME RIMUOVERE UN BIOFILM
• Pulizia efficace ed accurata delle superfici
mediante
– metodi fisici (spazzole, getti di soluzioni ad alta
pressione per rimuovere i biofilm e i microrganismi
adesi)
– metodi chimici che comportano la distruzione dei
microrganismi (antimicrobici ad effetto ossidante;
recentemente è stato proposto l’utilizzo di oli
alimentari di oliva, mais, cocco, soia)
– metodi biologici mediante l’utilizzo di batteriocine (es
nisina), batteri lattici, estratti cellulari, miscela di
proteasi, amilasi e glucanasi, enzimi deglicosilanti,
enzimi prodotti da un ceppo di Streptomyces che
demolisce gli esopolisaccaridi
PREVENIRE la formazione del biofilm
• Modificare la chimica delle superfici:
– scegliere polimeri idrofilici,
– trattare le superfici con composti passivanti come
albumina
• Trattare con antimicrobici:
– applicare vernici che rilascino biocidi in modo
continuo,
– assorbire sostanze ad azione antimicrobica quali
nisina
• Ottimizzare la progettazione degli impianti:
– modificare le caratteristiche fisiche delle superfici
(disegno igienico),
– progettare superfici con maggiore resistenza ai
sanificanti
SE AVVIENE LA
CONTAMINAZIONE….
• Effetti sulla conservabilità e qualità del
cibo
• Infezioni e tossinfezioni alimentari
Altri fattori che condizionano la crescita dei
microrganismi negli alimenti
POTENZIALE DI OSSIDORIDUZIONE
• Capacità di un substrato di cedere (riduzione) o
acquisire (ossidazione) e• Nel passaggio di e- si crea una d.d.p. (può
essere misurata ed espressa in mV)
• Tanto più ossidato è un substrato tanto più
POSITIVO è il suo potenziale redox
• Alcuni microrganismi richiedono valori redox
(Eh) positivi (ossidati) (aerobi), o negativi (ridotti)
(anaeorobi).
• Altri sviluppano indifferentemente in entrambe le
condizioni (anaerobi facoltativi)
Eh NEGLI ALIMENTI
• Prodotti di origine vegetale hanno Eh
positivi
• Prodotti di origine animale tendono ad
assumere valori sempre più negativi
• Alcune sostanze contribuiscono a
mantenere condizioni riducenti, quali
gruppi SH, l’acido ascorbico, gli zuccheri
riducenti
GAS
• I gas possono influenzare il potenziale
redox selezionando popolazioni
microbiche
• Alcuni (OZONO, OSSIDO DI ETILENE, DI
PROPILENE) hanno una spiccata azione
battericida; altri (ANIDRIDE CARBONICA,
ANIDRIDE SOLFOROSA) sono più
selettivi
IMBALLAGGI: atmosfera
dell’ambiente di conservazione
• La presenza di un gas in una confezione
influenza in maniera considerevole la microflora
dell’alimento
• L’atmosfera dipende dai gas somministrati e
dalla permeabilità dell’involucro.
– Pellicole permeabili ai gas selezionano aerobi.
– Pellicole non permeabili ai gas per effetto della respirazione
selezionano anaerobi
• Confezionamento sotto vuoto o con atmosfera
modificata. Atmosfera costituita da miscele di
gas in proporzioni diverse (O2, N2, CO2).
– I microrganismi rimangono vivi, ma sono ostacolati anche in
funzione delle t utilizzate
PATOGENI DIVERSI SI COMPORTANO IN
MANIERA DIFFERENTE IN ATMOSFERA
MODIFICATA
IL COMPORTAMENTO DIPENDENTE ANCHE
DALLA TEMPERATURA UTILIZZATA
La conservazione in atmosfera protettiva è
attualmente autorizzata in Italia per tutti i prodotti
alimentari
ADDITIVI
Vengono definiti additivi quelle sostanze che, PRIVE di potere
nutritivo o impiegate NON a scopo nutritivo, si aggiungono in
qualsiasi momento della lavorazione ad un alimento allo scopo
di
– conservarne nel tempo le caratteristiche chimiche, fisiche, chimicofisiche
– evitarne l’alterazione spontanea
– impartire ad esso o esaltarne particolari caratteristiche di aspetto,
sapore, odore o consistenza
DEVONO ESSERE DICHIARATI IN ETICHETTA
Una serie di additivi hanno azione antimicrobica e possono essere
addizionati a precise concentrazioni in determinati alimenti,
secondo una normativa ben precisa
ANTIMICROBICI NATURALI
CONTENUTI NEI CIBI
• Lisozima
• Batteriocine
• Oli essenziali in numerose spezie
• Polifenoli e tannini in piante e frutta edibile
B. ANTIMICROBICI NATURALI
CONTENUTI NEI CIBI
• Lisozima
• Batteriocine
• Oli essenziali in numerose spezie
• Polifenoli e tannini in piante e frutta edibile
LISOZIMA
• E’ un enzima con proprietà battericide
• E’ 1,4-β-N-acetilmuramidasi che rompe i
legami β1,4-glicosidici presenti nel
peptidoglicano della parete cellulare
• La sua azione si esplica solo sui G+
• Non ha effetto sui lieviti
• Viene particolarmente utilizzato nella
vinificazione per l’inibizione o il controllo
della fermentazione malolattonica
B. ANTIMICROBICI NATURALI
CONTENUTI NEI CIBI
• Lisozima
• Batteriocine
• Oli essenziali in numerose spezie
• Polifenoli e tannini in piante e frutta edibile
LE BATTERIOCINE
Le batteriocine vengono definite come PEPTIDI TERMOSTABILI
biologicamente attivi in grado di esercitare attività battericida nei
confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo
produttore
Ceppi di batteri lattici e stafilococchi sono i principali produttori di
batteriocine
Questi batteri possono essere facilmente isolati dalla microflora
normale di sistemi alimentari diversi
Le batteriocine possono agire verso batteri della stesse specie
produttrice (narrow spectrum) o verso batteri di specie diverse
(broad spectrum)
L’immunità del batterio produttore è mediata da specifiche “proteine
dell’immunità”
MESSA IN EVIDENZA DI CEPPI
PRODUTTORI DI BATTERIOCINE
Per l’individuazione di un ceppo
produttore di batteriocine si possono
spottare i potenziali batteri produttori
su un terreno adatto agarizzato,
preferibilmente tamponato e
contenente catalasi per escludere
l'attività antagonistica di acidi e
acqua ossigenata, quindi
stratificando con il ceppo indicatore.
Definizioni
• Sono molecole peptidiche di sintesi ribosomiale
(e perciò diverse dagli antibiotici), che possono
anche essere associate a lipidi e carboidrati
(Papagianni, 2003).
• Sono prodotte da diverse specie batteriche, in
particolare da ceppi Gram positivi appartenenti
al gruppo dei LAB (Lactic acid bacteria) ma
anche da ceppi Gram negativi, come
Escherichia coli.
• La prima batteriocina scoperta prese il nome di
colicina (Gillor et al., 2005).
Definizioni
• Le batteriocine sono molecole ad attività
battericida o batteriostatica.
• Possono avere spettri di inibizione
– limitati ad alcuni ceppi appartenenti alla stessa
specie del microrganismo produttore (narrow
spectrum)
– ad ampio spettro d’azione contro diverse specie
batteriche (broad spectrum) (Gillor et al., 2005).
Definizioni
• Agiscono con svariati meccanismi d’azione:
– formazione di pori nella membrana
citoplasmatica,
– interferenza sulla sintesi della parete
batterica,
– attività nucleasica
• Le batteriocine possono essere codificate da
geni presenti nel cromosoma batterico o in
plasmidi o in altri elementi mobili come i
trasposoni (Gillor et al., 2005).
CLASSIFICAZIONE
• Le batteriocine possono essere riunite
in gruppi distinti in base a diverse
proprietà
• La classificazione più accettata si basa
su:
– il tipo di batterio produttore,
– la natura chimica della batteriocina
– il suo spettro d’azione.
CLASSIFICAZIONE
1. Batteriocine prodotte da batteri Gram negativi:
§ Colicine
§ Microcine
§ Piocine
2. Batteriocine prodotte da batteri Gram positivi:
§ Classe I
§ Classe II
§ Classe III
§ Classe IV
1. Batteriocine prodotte da
batteri Gram negativi:
§ Colicine
§ Microcine
§ Piocine
Batteriocine prodotte dai batteri
Gram negativi
• Le batteriocine prodotte dai Gram negativi
presentano le seguenti caratteristiche:
– sono molecole relativamente grandi (possono superare anche i
30 KDa),
– sono usualmente rilasciate dalla cellula produttrice mediante
lisi e spesso dipendono da sistemi regolativi della stessa,
come il sistema SOS.
• In situazioni di stress (esaurimento dei nutrienti o
l’aumento della densità cellulare) alcuni batteri Gram
negativi producono diversi peptidi e proteine attive
contro i ceppi della stessa specie o di specie vicine
con cui compete.
Batteriocine prodotte dai batteri
Gram negativi
• Prodotte da molte specie appartenenti alle
Enterobacteriaceae
– 15-50 % dei ceppi di E. coli noti produce una o più
colicine.
• Le batteriocine dei Gram negativi necessitano
dell’interazione con un recettore posto sulla
membrana del microrganismo bersaglio e della
successiva internalizzazione per esplicare la
propria attività (Gillor et al., 2005).
COLICINE
• Le colicine sono codificate usualmente
da plasmidi e spesso superano i 20 KDa.
• Sono attive contro E. coli ma anche su
batteri strettamente correlati a questo,
come Salmonella.
Colicine
• Sono stati identificati 30 tipi di colicine, che
differiscono tra loro soprattutto per il meccanismo
d’azione.
• La regolazione basata sul sistema SOS fa sì che le
colicine vengano prodotte solo nei periodi di stress
(mancanza di nutrienti e/o di ossigeno) (Riley et al.,
2002).
• Dopo l’induzione, le colicine vengono rilasciate
nell’ambiente circostante mediante la lisi della cellula
produttrice e si legano a specifici recettori di
superficie di batteri sensibili (Gillor et al., 2005).
Colicine
• Il legame al recettore induce
l’attraversamento della parete batterica e il
raggiungimento della membrana interna.
• Le colicine possono
– agire a questo livello creando pori,
– oppure possono entrare nel citoplasma della cellula
ed esplicare attività di DNAsi
– o inibire la sintesi proteica inattivando il 16S rRNA
e/o i tRNA (Gillor et al., 2005; Riley et al., 2002).
Colicine
• La struttura del locus genico che codifica le
colicine è molto complessa e solitamente è
costituita da un cluster.
– il gene strutturale che codifica la colicina,
– un gene che produce un fattore di
protezione verso l’azione della colicina
stessa (gene per l’immunità)
– un gene che codifica un fattore di lisi che
media il rilascio della colicina dalla cellula
produttrice (Gillor et al., 2005; Papagianni,
2003).
Colicine
• Il dominio centrale costituisce delle colicine
circa il 50% della proteina totale ed è
coinvolto nel riconoscimento del recettore
• Il dominio N-terminale (25% della proteina) è
responsabile dell’ingresso della colicina nella
cellula target.
• Il resto della proteina contiene il dominio con
attività battericida (Riley et al., 2002).
MICROCINE
• Prodotte dalle Enterobacteriaceae,
• Finora sono state identificate solo 9 microcine (MccA,
MccB17, MccC7, MccD93, MccE492, MccH47,
MccLJ25, MccColV) (Destoumieux-Garzon et al.,
2002)
• La struttura e meccanismo d’azione non sono ancora
noti nel dettaglio.
• Differiscono dalle colicine per le dimensioni più
ridotte (meno di 10 KDa), per l’indipendenza del
sistema SOS e per essere secrete all’esterno della
cellula produttrice senza richiederne la lisi (Moreno
et al., 2002; Papagianni, 2003).
Microcine
• Le microcine sono molecole idrofobiche, resistenti al
calore, all’azione di certe proteasi e a valori estremi di
pH (Papagianni, 2003).
• Il trasporto all’esterno del batterio produttore
avviene mediante traslocatori omologhi agli ABC (ATPbinding cassette).
• Questi complessi transmembranari sono formati da
due proteine ancorate alla membrana citoplasmatica
ed esposte nel periplasma (codificati dal cluster della
microcina) e da una terza proteina (TolC, codificata da
un gene cromosomiale) (Moreno et al., 2002).
• Quest’ultimo fattore assicura il trasporto finale della
microcina attraverso il periplasma fino all’esterno (
Destoumieux-Garzon et al., 2002).
Microcine
• Lo spettro d’azione delle microcine è più ampio di
quello di quello delle colicine (soprattutto da generi
batterici appartenenti al gruppo delle
Enterobacteriaceae)
• In concentrazioni elevate agiscono creando pori sulla
membrana batterica bersaglio o dissipandone il
potenziale (Destoumieux-Garzon et al., 2002).
• Non è ancora stato stabilito come invece agiscano a
concentrazioni fisiologiche e se necessitino del
riconoscimento di un recettore sulla superficie del
microrganismo sensibile (Destoumieux-Garzon et al.,
2002).
Microcine
• L’immunità alla microcina: coinvolgimento di
pompe proteiche, che espellerebbero la
microcina una volta che questa entra nella
cellula che l’ha secreta ( Garrido et al., 1988).
• Le microcine sono solitamente codificate da
plasmidi, alcuni dei quali anche in grado di
essere trasferiti ad altri ceppi batterici
(Moreno et al., 2002).
Microcine
• Sono state classificate in due classi, in base
alla presenza di modificazioni posttraduzionali nella molecola matura
(Destoumieux-Garzon et al., 2002):
– .Microcine non modificate (peptidi con peso
molecolare minori di 5 KDa): MccE492, MccColV,
MccL
– Microcine modificate (peptidi con peso molecolare
compreso 8-10 KDa): MccB17, MccC7, MccLJ25,
tutte prodotte da ceppi di E. coli.
PIOCINE
• Le piocine sono batteriocine prodotte dal genere
Pseudomonas.
• Il 90% dei ceppi di P. aeruginosa produce almeno una
piocina.
• A differenza delle altre batteriocine prodotte dai
Gram negativi sono codificate da geni cromosomiali,
sempre presenti in clusters assieme anche ad un gene
per l’immunità e ad un sistema per il rilascio della
colicine mediante lisi.
PIOCINE
• L’espressione delle piocine è indotta da danni al DNA
nella cellula produttrice, che sono in grado di attivare
il sistema SOS.
• Le piocine si suddividono in 3 sottotipi -R, F, Sognuno dei quali presenta conformazione
tridimensionale e meccanismo d’azione caratteristici.
• Mentre il tipo S agisce solo su ceppi di P. aeruginosa, i
tipi R e F hanno uno spettro d’azione più ampio, che
comprende altri batteri Gram negativi come Neisseria
e Haemophilus (Gillor et al., 2005).
Batteriocine prodotte da
batteri Gram positivi:
§ Classe I
§ Classe II
§ Classe III
§ Classe IV
Batteriocine prodotte dai batteri
Gram positivi
• Le batteriocine dei Gram positivi sono generalmente
molecole cationiche, anfifiliche, di piccole dimensioni
• Agiscono permeabilizzando la membrana
citoplasmatica (Gillor et al., 2005; Papagianni, 2003)
• Sono usualmente attive verso i Gram positivi e non
hanno alcuna azione sui Gram negativi
Classe I: i lantibiotici
• Sono peptidi contenenti aminoacidi non
tradizionali come la lantioina (da cui poi deriva
il nome lantibiotici), la 6-metil lantioina, oltre
a residui deidratati (Papagianni, 2003).
• Resistono al trattamento termico
(Kleerebenzem, 2004)
• Solitamente sono codificati dal cromosoma
batterico ma anche da elementi mobili
(trasposoni o plasmidi) (Gillor et al., 2005)
I lantibiotici
• I lantibiotici presentano tutti un
meccanismo di produzione simile.
• Sono sintetizzati come peptidi
precursori, costituiti da un
caratteristico peptide leader Nterminale e un dominio C-terminale in cui
specifici aminoacidi vengono modificati a
livello post-traduzionale.
I lantibiotici
• Il peptide leader può avere numerose
funzioni.
– rendere la batteriocina inattiva durante il
trasporto da ribosoma all’ambiente esterno;
– facilitare l’iterazione con le proteine
trasportatrici;
– promuovere i legami con gli enzimi
responsabili delle modificazioni posttraduzionali
I lantibiotici
• Il peptide precursore è codificato da un gene
strutturale che fa parte anche in questo caso
di un cluster genico solo parzialmente
sovrapponibile a quello delle batteriocine
codificate dai Gram negativi.
• Sono infatti presenti ulteriori geni, come
quelli per gli enzimi che modificano gli
aminoacidi e tagliano il peptide leader mentre
sono assenti quelli che determinano la lisi
cellulare (Gillor et al., 2005).
I lantibiotici
• I lantibiotici vengono suddivisi in due
gruppi, IA e IB, in base alle
caratteristiche conformazionali e al
meccanismo d’azione ( Papagianni, 2003).
Lantibiotici tipo A
• Il tipo A comprende molecole di 2-5
KDa, di forma allungata e flessibile, con
amminoacidi carichi positivamente.
• Esse agiscono inattivando la polarità
della membrana batterica,
comportandosi da detergenti (Brotz et
al., 2000) e creando pori nella membrana
(Diep et al., 2002)
Lantibiotici tipo B
• Il tipo B raggruppa peptidi di al massimo 2 KDa, di
forma globulare.
• Uccidono il batterio interferendo a vari livelli con
reazioni biosintetiche specifiche, come la sintesi della
parete batterica (blocco della reazione di
transglicosilazione (Gillor et al., 2005, Brotz et al.,
2000)).
• Il risultato finale consisterebbe in un eccessivo
assottigliamento della parete, facilitando la lisi
cellulare (Brotz et al., 2000).
• Ai lantibiotici appartengono le batteriocine nisina,
lattacina 481, lattococcina S e carnacina U149.
CLASSE II
• Sono peptidi di piccole dimensioni (minori di 10 KDa),
stabili a modesti trattamenti termici (e come tali
vengono identificati come heat stable minimally
modified bacteriocins).
• Non contengono aminoacidi modificati.
• Sono caratterizzate dalla presenza del motivi Gly-GlyX,
• La membrana dei batteri Gram positivi sarebbe il
bersaglio primario di tali batteriocine (Papagianni,
2003).
CLASSE II
• All’interno di questa classe è stata operata un’ulteriore
suddivisione nelle sottoclassi ( Kleerebenzem, 2004;
Papagianni, 2003):
– IIA (pediocins-like bacteriocins): costituite da 36-40
aminoacidi, sono attive contro Listeria e sono
caratterizzate dal motivo YGNGV. La regione Nterminale è ben conservata e anche in questo caso il
trasporto si avvale della presenza di un peptide leader.
Appartengono a questo sottogruppo la sakacina A e P, la
leucocina A e la pediocina AcH/PA-1;
– IIB: sono usualmente sistemi a due peptidi, che
posseggono attività battericida solo grazie alla loro
azione concomitante e assieme costituiscono la
batteriocina attiva. Appartengono a questo sottogruppo
la Lattococcina A, G, M e la lattacina F (Garneau et al.,
2002);
– IIC: necessitano di residui ridotti di Cys per la loro
attività. La lattococcina B ne è un rappresentante.
CLASSE II
• Tuttavia la divisione delle batteriocine di
classe II in questi sottogruppi non è più
universalmente accettata perché un numero
crescente di batteriocine non vi rientra.
• A conferma di ciò è il fatto che alcune
batteriocine possono rientrare
contemporaneamente in più di una delle tre
sottoclassi (Diep et al., 2002).
CLASSE II
• Alla classe II appartengono anche la
lattococcina B e la curvacina A.
• La classe II contiene batteriocine
potenzialmente molto utili perché molte
di esse hanno dimostrato di essere
attive contro L. monocytogenes
(O’Sullivan et al., 2002).
CLASSE III
• Sono proteine termosensibili di
dimensioni maggiori di 30 KDa e perciò
vengono definite large heat labile
bacteriocins.
• Rientrano in questa classe l’helveticina
J, l’helveticina V -129, l’acidof ilina A e
la lattacina A e B (Papagianni, 2003).
CLASSE IV
• Sono proteine complesse, associate a porzioni
lipidiche o carboidratiche, indispensabili per la
loro attività.
• Appartengono a questa classe di batteriocine
la plantericina S, la leucocina S, la lattacina 27
e la pediocina SJ-1.
APPLICAZIONI DELLE
BATTERIOCINE
• L’uso indiscriminato degli antibiotici in ambito clinico,
veterinario e agricolo ha avuto notevoli ripercussioni
sull’attuale efficacia degli stessi antibiotici.
• Si è infatti instaurato ed esteso il fenomeno
dell’antibiotico -resistenza tra numerose specie
batteriche, in particolare tra i ceppi patogeni, molti
dei quali sono anche multi-resistenti.
• Questa situazione ha stimolato la ricerca a esplorare
settori innovativi per l’identificazione di nuovi
antimicrobici ( Papagianni, 2003).
Caratteristiche utili delle
batteriocine
• spettri d’azione estremamente specifici o
molto estesi;
• tossicità ed effetti collaterali ridotti per
l’uomo e gli animali;
• stabilità;
• possibilità di applicare metodiche di
ingegneria genetica per migliorarne la
stabilità, aumentarne
• la produzione, modificarne lo spettro d’azione
o il ceppo produttore.
APPLICAZIONI DELLE
BATTERIOCINE
• Lo studio, anche attraverso microarray (de Saizieu et
al., 2000), dei genomi dei batteri produttori e la
comprensione dei sistemi di regolazione delle
atteriocine ha portato all’identificazione di nuove
molecole antimicrobiche e di altri ceppi in grado di
produrle (Nes et al., 2004)
• Per molte batteriocine sono state proposte
applicazioni in clinica, in veterinaria e in agricoltura
ma soprattutto nel settore alimentare per la
conservazione degli alimenti (aumento della durabilità)
e per il miglioramento della qualità e delle tecnologie
produttive in particolare dei formaggi.
Ricerca applicata alle
batteriocine
• Oltre alla scelta delle batteriocine più
efficaci e appropriate, la ricerca si è
interessata anche allo
– sviluppo di metodi in grado di produrre e purificare
elevate quantità di tali antimicrobici.
• Le fermentazioni in continuo con riciclo di
cellule e con cellule immobilizzate sono
risultate molto più adatte a raggiungere
questo scopo rispetto alle tradizionali
fermentazioni in batch (Parente et al., 1999)
Ricerca applicata alle
batteriocine
• Sono stati altresì sviluppati metodi di
purificazione semplici basati sull’adsorbimento
delle batteriocine su composti in resina
• Questi, assieme alle tecnologie innovative di
fermentazione, possono costituire processi
integrati per l’ottenimento rapido di elevate
quantità di batteriocine (Parente et al., 1999).
In campo farmaceutico-clinico:
• Epidermina e gallidermina per il trattamento dell’acne
giovanile perché efficaci contr o il Propionibacterium acnei
(Allgaier et al., 1986; Kellner et al., 1988);
• lanthiopeptina per il trattamento di infezioni da Herpes
simplex virus, data la sua attività antivirale (Naruse et al.,
1989);
• mersacidina, prodotta dal Bacillus subtilis (Stein, 2005),
con meccanismo d’azione sovrapponibile a quello
dell’antibiotico vancomicina, e lattacina 3147 ( Guiane et
al., 2005) per l’inibizione della crescita dei ceppi di
Staphylococcus meticillina-resistenti (Bierbaum et al.,
1995);
• microcina E294 come farmaco attivo contro i tumori
perché in grado di indurre i cambiamenti biochimici e
morfologici dell’apoptosi nelle cellule eucarioti ( Hetz et
al., 2002);
In campo farmaceutico-clinico:
• ancovenina come anti-ipertensivo perché dimostratasi
un inibitore naturale dell’angiotensina 1 (Kido et al.,
1983);
• duramicina come anti-allergico perché in grado di
inibire l’enzima fosfatasi A2, responsabile della
produzione di prostaglandine e leucotrieni, importanti
mediatori dell’infiammazione ( Marki et al., 1991);
• microcina B17 utilizzabile come alternativa ai chinoloni
perché in grado di agire inibendo l’attività della
topoisomerasi II batterica ( Yorgey et al., 1994).
In campo veterinario:
• La lattacina 3147 è una batteriocina costituita da due
componenti e rientra nella categoria delle
batteriocine ad ampio spettro d’azione.
• È codificata da un plasmide coniugativo contenuto nel
L. lactis subsp. lactis (Guiane et al., 2005).
• È stata impiegata nel trattamento delle mastiti
causate da Staphylococcus spp.
• In questo caso la terapia con antibiotici verrebbe
sostituita da quella con batteriocine, evitando il
problema della presenza di residui di antibiotici nel
latte e della selezione di ceppi resistenti nei soggetti
che lo bevono (Ryan et al., 1999; Garneau et al., 2002);
Nel settore alimentare: prevenzione e
controllo delle zoonosi alimentari
• Colicine E1, E4, E7, E8, K54 e le microcine J25 e J24
inibiscono la crescita di E. coli O157:H7 (Jordi et al.,
2001).
• Questo batterio ha come reservoir i ruminanti.
• L’utilizzo di antibiotici come strategia di controllo
dell’infezione da O157 si è dimostrata inefficace
perché aumenta la produzione delle tossine Shiga e la
virulenza del batterio.
Nel settore alimentare: prevenzione e
controllo delle zoonosi alimentari
• La somministrazione orale di batteri produttori di tali microcine
e colicine in vacche positive per O157 a livello intestinale risulta
efficace (Doyle et al., 1999).
• Le colicine E e B invece sono già state applicate per la
prevenzione e il controllo di ceppi patogeni di E. coli nei maialini
neonati.
• Lamicrocina J25 invece ha manifestato attività antimicrobica
contro i serovar typhimurium e enteritidis di Salmonella
(Portrait et al., 1999).
• Per ridurre la presenza di C. botulinum nel pesce confezionato
sottovuoto sono stati inseriti prima del confezionamento ceppi
vitali di Carnobacterium divergens in grado di produrre
batteriocine attive contro il patogeno in questione. La
popolazione di C. botulinum è stata controllata senza modificare
la qualità finale del prodotto (O’Sullivan et al., 2002).
Nel settore alimentare: le batteriocine
come conservanti naturali
• Le batteriocine prodotte dai batteri LAB hanno
ricevuto un’attenzione particolare in questo ultimo
periodo per l’effettiva possibilità di utilizzarle come
conservanti.
• Questo fenomeno riflette un nuovo atteggiamento dei
consumatori, che richiedono non solo cibi privi di
potenziali patogeni alimentari ma contenenti la minor
quantità possibile di additivi chimici e poco elaborati,
a garanzia della freschezza dell’alimento stesso ( Nes
et al., 2004, O’Sullivan et al., 2002).
• I medesimi consumatori considerano positivamente
’introduzione di batteri LAB nei prodotti alimentari
perché ritenuti naturali e probiotici.
Batteriocine come conservanti
naturali
• Le batteriocine più impiegate in questo campo sono la
nisina e l’enterocina, entrambe impiegate nei formaggi
per il controllo della crescita di Listeria
monocytogenes (Papagianni, 2003) in vari prodotti
come la carne, il petto di pollo, il prosciutto.
• La lattacina 3147 è invece attiva contro i Clostridi
(Guiane et al., 2005) e può essere utilizzata per
proteggere vari tipi di formaggi, yogurt e zuppe
ricostituite da L. monocytogenes e da B. cereus
(Papagianni, 2003, Guiane et al., 2005)
• E’ stata applicata anche alle confezioni alimentari
(Morgan et al., 2001, Scannell et al., 2000b) e per
aumentare la durabilità del latte pasteurizzato (Ross
Paul et al., 2002).
Nell’applicare le batteriocine come
conservanti o nell’introdurre negli
alimenti i ceppi batterici produttori
bisogna fare attenzione all’eventualità
che l’introduzione di questi sistemi
innovativi non modifichi le qualità
organolettiche dell’alimento stesso (
O’Sullivan et al ., 2002).
Nel settore alimentare: le batteriocine
per il miglioramento della qualità degli
alimenti
• Rispetto alle applicazioni precedenti la letteratura
scientifica a disposizione è limitata.
• Nonostante ciò, le batteriocine possono essere
applicate per migliorare le proprietà degli alimenti
generalmente in due modi (O’Sullivan et al ., 2002):
– utilizzare batteri LAB produttori di batteriocine per
controllare la popolazione microbica indesiderata -tra cui gli
NSLAB-o per aumentare l’entità della lisi cellulare
– per velocizzare la reazione di proteolisi nei formaggi (in
questo caso le batteriocine funzionerebbero come agente
proteolitico) (O’Sullivan et al ., 2002).
•
a | Food quality. A cheese made with a commercial starter culture (Bac-)
will develop an undefined flora called non-starter lactic acid bacteria
(typified by different fingerprints generated by random amplified
polymorphic DNA patterns). However, a cheese inoculated with the same
commercial strain that can produce a bacteriocin (Bac+) (lacticin 3147,
in this example) and a resistant adjunct strain of Lactobacillus, chosen
for a flavour attribute, will develop a single defined culture once the
starter culture has died off, offering the cheese manufacturer control
over previously adventitious flora development.
. b | Food safety. A simple
example of the role of
bacteriocins in food safety is
the production of cottage
cheese with a starter culture
that produces a bacteriocin
with activity against
Listeria monocytogenes,
which results in a cheese
that is inherently antiListeria.
c | Veterinary medicine.
A teat seal is a physical
barrier against infection.
Here, a bacteriocin was
incorporated into the
teat seal and the teat
was challenged with
Staphylococcus
aureus. The number of
staphylococci recovered
from 14 teats with or
without bacteriocin is
shown.
d | Human medicine. A Streptococcus mutans
strain that cannot produce acid, but that produces
the lantibiotic mutacin (shown), can competitively
exclude acidogenic S. mutans, thereby offering
protection against tooth decay.
Argomenti di approfondimento
• INGEGNERIA GENETICA APPLICATA
ALLE BATTERIOCINE
• MECCANISMI DI RESISTENZA ALLE
BATTERIOCINE
• NISINA
Infezioni e intossicazioni alimentari
• Le infezioni sono causate dall’ingestione di
patogeni contenuti in un alimento
contaminato
• Le intossicazioni alimentari sono causate
dall’ingestione di tossine preformate negli
alimenti
TERMINOLOGIA
• Le infezioni alimentari sopravvengono in seguito al consumo di
alimenti contenenti microrganismi vivi che, una volta raggiunto
l’intestino si moltiplicano (infezione enteroinvasiva) e possono
o meno produrre delle tossine (infezione enterotossica)
• Le intossicazioni alimentari sono manifestazioni patologiche
che si determinano in seguito al consumo di alimenti
contenenti tossine prodotte da microrganismi che si sono
moltiplicati sull’alimento precedentemente al suo consumo.
Perché si manifesti l’intossicazione pertanto non
obbligatoriamente ci deve essere il microrganismo, bensì è
indispensabile la presenza della sua tossina
• Esistono poi le cosiddette tossinfezioni alimentari in sensu
strictu determinate dal consumo di alimenti contenenti sia
tossine che batteri. In questo caso la tossicità è data sia dalle
tossine preformate sia da quelle prodotte da cellule vive
ingerite con l’alimento all’interno dell’ospite.
Infezioni alimentari
http://vm.cfsan.fda.gov/~mow/foodb
orn.html
Infezioni alimentari
Le infezioni alimentari sopravvengono in seguito al consumo di alimenti
contenenti microrganismi vivi che, una volta raggiunto l’intestino si
moltiplicano (infezione enteroinvasiva) e possono o meno produrre delle
tossine (infezione enterotossica)
Numerosi sono i microrganismi responsabili di infezioni: accanto a forme la cui
patogenicità è da sempre conosciuta, sono da ricordare i cosidetti patogeni emergenti
che possono diventare pericolosi in particolari condizioni (organismo debilitato, ecc.).
Le infezioni alimentari più note sono:
•
•
•
•
•
•
•
•
Salmonellosi
Shigellosi
Gastroenteriti varie provocate da: E. coli, Yersinia enterocolitica, Campylobacter,
Plesiomonas shigelloides
Infezioni da Aeromonas hydrophyla
Infezioni da Vibrio spp.
Listeriosi
Brucellosi
Gastroenteriti da enterococchi (streptococchi fecali)
Intossicazioni alimentari
Le intossicazioni alimentari sono manifestazioni
patologiche che si determinano in seguito al
consumo di alimenti contenenti tossine prodotte da
microrganismi che si sono moltiplicati nell’alimento
precedentemente al suo consumo. Perché si
manifesti l’intossicazione pertanto non
obbligatoriamente ci deve essere il microrganismo,
ma è indispensabile la presenza della sua tossina
Le sole e vere intossicazioni alimentari di origine batterica
sono:
• Intossicazione botulinica o botulismo
• Intossicazione stafilococcica
Tossinfezioni alimentari in sensu
strictu
Esistono poi le cosiddette tossinfezioni
alimentari in sensu strictu determinate dal
consumo di alimenti contenenti sia tossine
che batteri. In questo caso la tossicità è data
sia dalle tossine preformate sia da quelle
prodotte da cellule vive ingerite con
l’alimento all’interno dell’ospite.
Sono tossinfezioni alimentari le sindrome tossiche
provocate da:
• Bacillus cereus
• Clostridium perfringens
Gli agenti più frequenti
Parassiti, batteri, virus, funghi, prioni
I batteri sono gli agenti più frequenti
• Salmonella (in Italia circa 10000 identificazioni ogni anno)
• Staphylococcus
• Clostridium
• Campylobacter
• Escherichia coli
• Shigella
• Yersinia
• Vibrioni
• Listeria
Tra i virus: rotavirus, enterovirus, epatite A
I patogeni emergenti
Tra i batteri:
• Campylobacter jejuni
• Campylobacter fetus
• Escherichia coli produttori di verocitotossina (VTEC)
associati a patologia nell’uomo solo nel 1982
• Lesteria monocytogenes
• Salmonella typhimurium DT 104
Tra i virus: i virus di Norwalk, il virus Nipah
I prioni
Tra i parassiti: Cryptosporidium parvum, Cyclospora
cayetanensis
I patogeni emergenti II
• L’incidenza delle tossinfezioni alimentari causate da
questi agenti è in costante aumento
– Miglioramento delle tecniche diagnostiche
– Ampia applicazione dei metodi epidemiologici
– Modificazioni sociali dell’ultimo secolo (crescita della
popolazione mondiale; migrazioni; faciltà di
spostamenti)
– Uso allargato ed irresponsabile degli antibiotici
– Pazienti immunodepressi (tumori, diabete, AIDS,
trapianti)
– Metodologie di produzione e distribuzione degli
alimenti
– Metodiche utilizzate negli allevamenti di animali (uso
di antibiotici)
I patogeni emergenti III
• Vie di trasmissione e sorgenti di infezione
spesso INUSUALI
• Uno degli aspetti importanti di questo gruppo di
infezioni è la loro relazione con l’ambiente
animale
• Il serbatoio naturale di diversi microrganismi è
costituito da animali che non manifestano
necessariamente la malattia
• Questo fattore rende DIFFICILE il controllo e la
prevenzione di tali infezioni
E.Coli O157:H7
• Colite emorragica o sindrome emolitico-uremica
• Epidemia di grandi dimensioni verificatasi negli
USA e associata agli hamburger distribuiti in una
catena di fast-food non opportunamente cotti
• Il serbatoio NATURALE principale di questi
patogeni sono i BOVINI che ospitano questo
ceppo SENZA presentare alcun sintomo
• Carne bovina e prodotti derivati sono la
principale fonte di contaminazione ma: acqua,
vegetali, trasmissione da persona a persona
sono state descritte come fonti di
contaminazione
DIAGNOSI NELLE INFEZIONI
ALIMENTARI
Sui campioni
prelevati dal paziente
Sui campioni
prelevati dalle
possibili fonti di
contaminazione
(alimento e/o
ambiente)
RETI INTERNAZIONALI
• Le reti di sorveglianza internazionali sono essenziali allo
scopo di riconoscere e limitare episodi dispersi su grandi
aree
• FOOD-NET: è un sistema di sorveglianza-sentinella
attivo che ha lo scopo di descrivere l’epidemiologia di
malattie, trasmesse attraverso gli alimenti, nuove o
emergenti sul territorio degli USA, di determinarne la
frequenza e la gravità e di stabilire il rischio associato
all’esposizione a diversi alimenti
• ENTER-NET è invece un sistema di sorveglianza
internazionale che copre gran parte dei Paesi europei.
E’ basato sui laboratori di Microbiologia e rivolto alla
sorveglianza delle infezioni da Salmonella e E.coli
O157
http://www.simi.iss.it/Enternet/index.asp
FONTI DI INFORMAZIONE IN
ITALIA
• I dati disponibili in Italia derivano dal sistema di notifica
obbligatorio per i casi di malattie infettive (D.M. del
1991) che richiede una segnalazione individuale per
ogni caso diagnosticato di alcune malattie in cui
l’acquisizione da alimenti è più frequente (brucellosi,
febbre tifoide, salmonellosi, epatite virale A) e una
segnalazione per i focolai epidemici
• I dati vengono analizzati dal Ministero della Sanità che
li pubblica nel volume “Bollettino Epidemiologico”
disaggregati per regioni. I dati individuali sono anche
disaggregati per classi standard di età
• I dati sono disponibili nel sito
http://www.ministerosalute.it/promozione/malattie/bolletti
no.jsp
ALTRE FONTI INFORMATIVE
• Un’ulteriore fonte informative è l’Istituto Superiore di
Sanità al sito www.simi.iss.it
• Esiste inoltre il sistema di segnalazione degli isolamenti
di Salmonella che fa capo al sistema ENTERNET. I dati
raccolti in Italia che poi confluiscono nella banca dati
internazionale sono consultabili grazie all’ISS e
consentono di monitorare la diffusione dei ceppi più
comuni, o identificare l’emergenza di quelli più rari:
http://www.simi.iss.it/Enternet/dati1_s.asp
• Infine il centro di collaborazione dell’OMS di Berlino
riporta le casistiche delle malattie da alimenti segnalate
dai vari paesi e la distribuzione relativa dei veicoli di
trasmissione identificati
FREQUENZA DI ALCUNE MALATTIE
VEICOLATE DA ALIMENTI IN ITALIA
• L’Italia è il Paese dell’Unione Europea con il numero più
elevato di casi di Botulismo, molti dei quali si verificano
nelle regioni del Sud
• La frequenza della febbre tifoide è diminuita
progressivamente
• In controtendenza sono tutte le altre salmonellosi per
le quali si è assistito ad un notevole aumento di
frequenza soprattutto negli anni ’90 (S. enteritidis
veicolata da pollame e uova)
• Anche l’epatite A presenta un andamento caratterizzato
da flessioni e ampi incrementi di dimensioni epidemiche.
L’ultimo picco riportato a livello nazionale è quasi
totalmente attribuibile ad un’estesa epidemia che in
Puglia si è protratta per circa due anni (1996-1997)