introduzione lab ogm

INTRODUZIONE AL LABORATORIO BIOTEC
CLASSI QUINTE
LICEO SCIENTIFICO «I.VERSARI» CESANO MADERNO
OGM: organismo il cui materiale genetico è stato trasformato
in modo diverso da quanto avviene in natura
• Impiego di tecniche di ingegneria genetica (isolamento, modifica,
trasferimento da un organismo all’altro di sequenze di DNA)
• Il gene trasferito è un Transgene: rende l’organismo ospite capace di
esprimere un nuovo carattere.
• Universalità codice genetico ( tutti gli organismi possono essere OGM)
• Introduzione MIRATA di nuove caratteristiche
Tecnica DNA ricombinante
1. ISOLAMENTO DEL GENE ESOGENO
a) Estrazione di mRNA e sintesi cDNA
b) Isolamento e purificazione del gene dal DNA genomico
2. PREPARAZIONE DEL VETTORE
3. TRASFERIMENTO DEL GENE ALL’ORGANISMO OSPITE
4. IDENTIFICAZIONE E SVILUPPO ORGANISMO OGM
Esistono due metodi per isolare geni di interesse
In vivo
(1973)
Clonaggio
genico
In vitro
(1983)
PCR
(polymerase
chain reaction)
ISOLAMENTO DEL GENE
a) Estrazione di mRNA – transcrittasi
inversa- cDNA
Per preparare i cDNA a partire da
mRNA, si utilizza un enzima virale: la
trascrittasi inversa (RT).
Questa polimerasi, la cui scoperta
fruttò il premio Nobel per la Medicina
nel 1975 a David Baltimore e Howard
Temin, è l’unico enzima esistente in
grado di generare una copia di DNA
a partire da una stampo di RNA e
viene usato dai retrovirus come
HIV per la replicazione del loro
genoma.
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (II)
La trascrittasi inversa copia il singolo filamento
dell’mRNA, generando un doppio filamento ibrido
DNA/RNA.
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Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (III)
La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento
a RNA, esponendo la singola elica di DNA.
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Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (IV)
La trascrittasi inversa sintetizza il filamento
complementare di DNA, generando un cDNA
a doppia elica.
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ISOLAMENTO DEL GENE
b) Isolamento del gene direttamente da DNA genomico – ENZIMI
DI RESTRIZIONE : le endonucleasi di restrizione sono enzimi
batterici in grado di legarsi a specifiche sequenze del DNA
(generalmente di 4 – 6 paia di basi) e tagliare la doppia elica
all’interno della sequenza bersaglio.
Le biblioteche di cDNA:
gli enzimi di restrizione (II)
Il taglio genera estremità che possono essere piatte
oppure sporgenti, nel qual caso si definiscono
coesive (sticky ends).
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Gli Enzimi di restrizione
• Le deossiribonucleasi II (sito-specifiche) sono una classe di enzimi, appartenente
alla classe delle idrolasi, che catalizzano il taglio endonucleolitico del DNA per
dare frammenti specifici a doppia elica con fosfati terminali al 5'.
• Questi complessi proteici sono in grado di rompere i legami fosfodiesterici del
DNA a doppio filamento
• La scoperta degli enzimi di restrizione è dovuta a Werner Arber, microbiologo
svizzero, insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith. Nel 1978 i tre ricevettero il
Premio Nobel in medicina .
• Ciascun enzima di classe II possiede una propria sequenza bersaglio (detta anche
sequenza consenso), che riconosce e taglia. Questa sequenza, solitamente di 4-8
paia di basi, è detta sito di restrizione e permette di tagliare il DNA a livello di quel
sito. Si tratta di siti con sequenze palindromiche: se lette secondo la stessa
polarità, sono identiche nei due filamenti
• In gene esogeno deve essere trasferito
all’organismo ospite affinchè possa
essere trascritto e tradotto nella
proteina di interesse.
• Deve possedere un PROMOTORE cioè
una sequenza in grado di favorire
l’attacco della RNA pol e dare inizio alla
trascrizione .
VETTORE
PROMOTORE
2. PREPARAZIONE DEL VETTORE
• Requisiti di un buon vettore
• Deve essere in grado di replicarsi nella
cellula ospite
• Deve avere un gene marcatore (es gene per
la resistenza agli antibiotici)
• Si usano soprattutto i PLASMIDI
• Il vettore viene tagliato impiegando lo
stesso enzima di restrizione usato per il
frammento di interesse.
• Questo genera estremità compatibili
• La Ligasi salda il frammento al plasmide
• TALE ENZIMA LEGA COVALENTEMENTE
L’ESTREMITA’ 5’ FOSFATO DI UNA BASE
CON L’ ESTREMITA’ 3’ FOSFATO DELLA
BASE SUCCESSIVA
I vettori di clonaggio
I vettori plasmidici contengono
un’origine di replicazione per
potersi duplicare insieme al DNA
cellulare, un gene marcatore
(resistenza ad un antibiotico) per
poter selezionare le cellule che li
contengono e siti di taglio unici per
enzimi di restrizione.
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Il sito di clonaggio, in cui viene
inserito il segmento di DNA
esogeno, è chiamata POLYLINKER
o zona di clonaggio multiplo.
Contiene un tratto di DNA con
sequenze uniche riconosciute
come siti di taglio da parte di
diversi enzimi di restrizione
polylinker
sequenze uniche di riconoscimento
per diverse endonucleasi di restrizione
che permettono l’inserzione del DNA
eterologo
questo elemento facilita il lavoro di
clonaggio permettendo di utilizzare
l'enzima di restrizione più
conveniente.
Unione del
frammento di
DNA al vettore
Il vettore ricombinante
Trasferimento del gene esogeno all’organismo
ospite
• Trasformazione batterica:
bisogna favorire l’ingresso
del plasmide nella cellula
ospite
• Metodo biolistico
• Elettroporazione
• Sistemi biologici
(batteri/virus)
Introduzione del DNA nella cellula ospite
Trasformazione: CaCl2
Elettroporazione
In E.coli
Impacchettamento e infezione fagica
Trasfezione (transiente o stabile):
Calcio fosfato
Liposomi
In cellule di
eucarioti superiori
Elettroporazione
Microiniezione
DNA gun
Identificazione e sviluppo organismo
modificato
Le cellule geneticamente
modificate (ovvero contenenti
il vettore) acquisiranno la
resistenza all’antibiotico
portata dal vettore stesso,
quindi le cellule sopravvissute
conterranno tutti i cDNA. Ogni
singola cellula originerà un
clone di un singolo cDNA.
L’insieme dei cloni sarà la
biblioteca a DNA.
Identificazione di un gene di
interesse: il Southern Blotting (I)
Per identificare il clone della
biblioteca che contiene il cDNA
del gene di nostro interesse si
può utilizzare il metodo del
Southern Blotting, chiamato
così dal suo inventore: Edwin M.
Southern.
Edwin Southern
Immagine:Jane Gitschier
(Plos Genetics)
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Identificazione di un gene di
interesse: il Southern Blotting (II)
Il Southern Blotting si compone di tre fasi principali:
•
•
•
Elettroforesi sul gel di agarosio del cDNA
separato dal vettore plasmidico estratto dai cloni,
dopo digestione con endonucleasi di restrizione.
Trasferimento dei frammenti di DNA dal gel ad una
membrana di nitrocellulosa.
Ibridazione della membrana con un frammento di
DNA complementare al cDNA di interesse marcato
radioattivamente e rilevazione del segnale su lastra
fotografica.
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Elettroforesi su gel di agarosio (I)
Il DNA plasmidico (vettore) estratto dai cloni viene digerito
con gli stessi enzimi di restrizione usati per il clonaggio.
In questo modo il cDNA viene separato dal vettore. Poi si
prepara una miscela di agarosio all’ 1% in un opportuno
tampone. L’agarosio è un polimero naturale che solidifica
in un gel a temperatura ambiente.
Una vasca piena di gel di agarosio
solidificato. Immagine: Joseph Elsbernd via
Wikimedia Commons
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Elettroforesi su gel di agarosio (II)
Nel gel vengono lasciate delle fessure (pozzetti) in cui si
deposita la miscela contenente vettore e cDNA digeriti.
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Elettroforesi su gel di agarosio (III)
Applicando un campo elettrico, il DNA (carico
negativamente) migra verso il polo positivo e le molecole
si separano in base al peso molecolare (P.M.) secondo la
relazione 1/log10 (P.M.). Il vettore (più pesante) correrà più
lentamente del cDNA (più leggero).
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Le molecole lineari di dsDNA
migrano a velocità
inversamente proporzionali
al logaritmo in base 10 del
numero di paia di basi.
Trasferimento (blotting) su membrana
Il gel contenente il DNA separato, è sottoposto a un
trattamento per denaturare il DNA, ovvero aprire i due
filamenti. Il gel è poi appoggiato a una membrana di
nitrocellulosa: il DNA migra dal gel alla membrana per
capillarità o applicando un campo elettrico. La
membrana, carica positivamente trattiene il DNA (a singola
elica perché denaturato) carico negativamente.
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Ibridazione (I)
La membrana è immersa in una soluzione contenente
un frammento di DNA a singola elica complementare
al cDNA di interesse e recante un atomo di fosforo
radioattivo (32P) all’estremità 5’.Grazie alla proprietà del
DNA a singola elica di appaiarsi spontaneamente a una
sequenza complementare (ibridazione) la sonda
radioattiva si legherà al cDNA di interesse.
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Ibridazione (II)
Il segnale ad alta energia del 32P viene catturato su una
lastra fotografica, permettendo di identificare quale
pozzetto conteneva il cDNA cercato. Dato che in ogni
pozzetto era stato caricato il DNA di un singolo clone, con
questa procedura è possibile risalire al clone della biblioteca
che contiene il cDNA che cercavamo.
.
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OGM perché?
Miglioramento genetico
tradizionali
- Miglioramento genetico mediante incroci
- Mutagenesi
moderne
- Colture di cellule e tessuti
- Utilizzo dei marcatori molecolari
- Ingegneria genetica (OGM)
Tutte tecniche che devono essere usate in sinergia e non in alternativa
Tramite incrocio si cambiando le combinazioni
genotipiche sfruttando la variabilità genetica presente
nella specie
Tramite mutagenesi si può aumentare la variabilità
genetica
Con la tecnologia del DNA Ricombinante è possibile
trasferire caratteri/geni da altre specie
PERCHE’ SI FANNO GLI OGM
Nell’elenco che segue sono indicati i settori produttivi e di ricerca in cui le biotecnologie trovano,
o potrebbero trovare, varie applicazioni:
- farmacologia e medicina (produzione di biofarmaci, molecole utili a fini terapeutici,
vaccini e antibiotici, terapia genica, ecc…)
-industria alimentare (modificazione del contenuto di zuccheri, amminoacidi, grassi
ecc…)
-chimica e farmaceutica (enzimi, additivi, alcol, acidi, solventi, detergenti, materie
plastiche, reagenti diagnostici, ecc… )
-agricoltura, zootecnia e veterinaria (miglioramento genetico per rendere resistenti
alle malattie, ai pesticidi e agli stress ambientali, incremento della produzione, ecc…)
- protezione ambientale (biorisanamento di ambienti contaminati, depurazione delle
acque e dei reflui, ecc…)
- energia (estrazione del petrolio presente nelle rocce mediante produzione di sostanze
tensioattive che ne favoriscono la separazione, ecc…)
Ingegneria genetica nelle piante
• Le cellule somatiche delle piante sono totipotenti,
possono cioè essere indotte a rigenerare una pianta
intera
• Trasformazione di cellule vegetali: per produrre piante
transgeniche basta introdurre il gene di interesse in
una cellula o pezzo di tessuto somatico che poi verrà
stimolato con ormoni vegetali a produrre radici e
germogli dando una pianta transgenica
• Agrobacterium tumefaciens: batterio capace di
infettare molti tipi di piante e di produrre un tumore
vegetale noto come galla del colletto
Esperimento Cusmibio
• OBTV: verificare la presenza del gene Bt
(trnsgene) in un carico di Mais (Certificato
no OGM)
• ANALISI
• Campionamento
• Estrazione DNA e amplificazione con PCR
• Elettroforesi
• Analisi risultati
Geni spia: cloroplasti/zeina
6 provette (marcatore PM, cloroplasto, zeina,
transgene, CP, CN, Blank)
Confronto bande corsa elettroforetica