ALLwell Elution Technologies Coconut Proteins Elisa kit Cat. N. ETE-75CNT Kit per la rilevazione di noce di cocco in campioni alimentari Manuale d’uso Leggere attentamente il manuale prima di procedere all’uso del kit Via San Geminiano, 4 41030 San Prospero (MO)- Italy (: +39 059 8637161 : +39 059 7353024 *: [email protected] : www.generon.it [1] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 1 – Principio del test e suo utilizzo Il test si basa sulla tecnica ELISA utilizzando la metodica del doppio anticorpo coniugato con un enzima per la rivelazione immunoenzimatica dell’analita di interesse. La tecnica viene brevemente descritta di seguito. I pozzetti della piastra ELISA sono rivestiti con un anticorpo che riconosce specificamente le proteine della noce di cocco. L’aggiunta del campione nei pozzetti della piastra permette all’anticorpo monoclonale di legarsi alla proteina di interesse, dopo una fase di lavaggio è aggiunto un secondo anticorpo specifico per la proteina di interesse coniugato con una perossidasi. Questo anticorpo si lega alla proteina bersaglio, attraverso l’utilizzo della perossidasi e del substrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) si ha lo sviluppo della reazione colorimetrica. Il cambio di colorazione dopo l’aggiunta del substrato TMB è un indice della concentrazione di proteina. Il contenuto di proteina nei campioni è determinato dalla comparazione con la curva standard costruita mediante l’utilizzo di standard forniti con il kit. Il test di analisi sandwich ELISA è altamente sensibile per la rilevazione delle proteine della noce di cocco in cibi cotti e crudi. Attenzione: le matrici alimentari possono essere estremamente diverse in seguito alla combinazioni di additivi e processi industriali che possono influenzare l’analisi delle le proteine. Per analisi su altri tipi di matrice non riportati espressamente nel protocollo consultare i tecnici Generon (www.generon.it – email: [email protected]). • Il test è solo ad uso di ricerca non a scopo diagnostico, solo per uso in vitro. • Risultati affidabili e riproducibili vengono ottenuti quando la procedura di analisi viene eseguita dopo aver compreso tutte le informazioni contenute nel manuale illustrativo e seguendo le buone pratiche di laboratorio. • Fattori che potrebbero influenzare il risultato finale del test sono l’adeguatezza dello strumento utilizzato, la pulizia del materiale in vetro, la qualità dell’acqua distillata o deionizzata, la precisione nelle operazioni di prelievo sia dei reagenti che dei campioni, le tecniche di lavaggio, il tempo di incubazione o la temperatura. • Non mescolare tra loro reagenti provenienti da altri lotti o fonti. • I risultati dei test non sono applicabili a porzioni non testate del campione. [2] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 2 – Componenti del Kit La data di scadenza del kit e dei suoi componenti è indicata sull'etichetta della confezione. Tutti i componenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e utilizzati seguendo le istruzioni riportate nel manuale. Materiale Descrizione Preparazione Conservazione Stabilità Piastra da microtitolazione ELISA (ELISA Micro Plate, antibody coated) Piastra da 96 pozzetti con anticorpo immobilizzato. Pronta all’uso. 4-8°C, In un sacchetto di alluminio sigillato con essiccante. Seguendo le corrette modalità di conservazione fino alla data di scadenza. Anticorpo con enzima (Enzyme Conjugated Detection Antibody) 1 vial da 1.5 ml 10X di anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) in soluzione. Diluire 1/10 prima dell’uso per preparare una soluzione di lavoro. 4-8°C al buio. La soluzione 10X è stabile fino alla data di scadenza. Standard 1 vial contenente lo standard concentrato. Fare riferimento al certificato di analisi (CoA). 4-8°C. Non congelare. Stabile fino alla data di scadenza. 4-8°C per la soluzione di lavoro 1X e la soluzione del diluente 5X. La soluzione di lavoro 1X è stabile per una settimana dalla data di preparazione. La soluzione 5X concentrata è stabile fino alla data di scadenza. 4-8°C per la soluzione di lavoro 1X e la soluzione del diluente 5X. La soluzione di lavoro 1X è stabile per una settimana dalla data di preparazione. La soluzione 20X è stabile fino alla data di scadenza. Diluente concentrato (Diluent Concentrate) Soluzione di lavaggio (Wash Solution Concentrate) 1 bottiglia da 50 ml di soluzione 5X. Diluire 1/5 prima dell’uso per preparare una soluzione di lavoro. 1 bottiglia da 50 ml di soluzione di lavaggio 20X. Diluire 1/20 prima dell’uso per preparare una soluzione di lavoro. Soluzione di estrazione concentrata (Extraction Buffer Concentrate) 1 bottiglia da 120 ml di soluzione di estrazione 4X. Diluire 1/4 prima dell’uso per preparare una soluzione di lavoro. La soluzione di lavoro deve essere preriscaldata prima dell’uso a 50-60°C. 4-8°C. La soluzione di lavoro e la soluzione concentrata fino alla data di scadenza.. Soluzione cromogena (Chromogen-Substrate Solution) 1 bottiglia da 12 ml di 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno in tampone di acido citrico pH 3.3. Pronta all’uso. 4-8°C al buio. Stabile fino alla data di scadenza. Proteggere dalla luce. Soluzione bloccante (STOP Solution) Attenzione: evitare il contatto con la pelle 1 bottiglia da 12 ml di 0.3 M di acido solforico. Pronta all’uso. 4-8°C. Stabile fino alla data di scadenza. Materiale richiesto per effettuare l’analisi ma non presente nel kit: Micropipette (da 2 μl a 100 μl), provette, lava-piastre automatico, acqua distillata o deionizzata, lettore di piastre ELISA, vetreria per la preparazione di reagenti e soluzioni, timer, mixer o vortex, agitatore bagnomaria, agitatore orbitale, bilancia, centrifuga. [3] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 3 – Preparazione del campione 1. I campioni alimentari devono essere estratti utilizzando la soluzione di estrazione 1X (Extraction Buffer) preriscaldata (50-60°C). Per una corretta estrazione è necessario ottenere una miscela omogenea del campione. Campioni di alimenti solidi devono essere macinati/frantumati per ottenere una migliore consistenza e favorire l’efficienza dell’estrazione. Per campioni alimentari solidi: preparare una diluizione 1/10 della soluzione di estrazione (Extraction Buffer) preriscaldata. Pesare 0.5 grammi (±4%) del campione ben macinato/frantumato e aggiungere 4.5 ml (±2%) della soluzione di estrazione (Extraction Buffer) diluita e precedentemente preriscaldata. Mescolare mediante agitatore (Vortex). Il rapporto campione/soluzione di estrazione (Extraction Buffer) è 1/9 (1 parte di campione e 9 volumi di soluzione di estrazione - Extraction Buffer). Per campioni liquidi: preparare una diluizione 1/10 della soluzione di estrazione (Extraction Buffer) preriscaldata. Aggiungere 0.5 ml (±2%) del campione liquido omogeneo a 4,5 ml (±2%) della soluzione di estrazione (Extraction Buffer) diluita e precedentemente preriscaldata. Il rapporto campione/soluzione di estrazione (Extraction Buffer) è 1/9 (1 parte di campione e 9 volumi di soluzione di estrazione - Extraction Buffer). Acque di lavaggio industriale (CIP - Clean in Place Solution): preparare una diluizione 1/5 della soluzione di diluizione 1X (Diluent Buffer). Aggiungere 1 ml di soluzione CIP in 4 ml di tampone diluente 1X. 2. Trasferire i campioni nell’agitatore a bagnomaria per 25 minuti a 50-60°C in agitazione. In alternativa lasciare i campioni a bagnomaria per 25 minuti agitando per 1 minuto ogni 5 minuti. 3. Dopo l'estrazione, centrifugare i campioni per favorire la sedimentazione del particolato o in alternativa lasciar riposare il campione per cinque minuti in un porta provette. 4. 4. Prelevare 100 μl dallo strato intermedio della soluzione contente il campione in una nuova provetta e aggiungere 900 μl della soluzione diluente precedentemente diluita. Vortexare o mescolare bene. La diluzione finale del campione da analizzare è ora di 1/100. Sostanze inibenti la reazione enzimatica: l'anione azide e il Thimerosal a concentrazioni superiori allo 0.1%. La stabilità dei campioni non è stata valutata. [4] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 4 – Preparazione dei reagenti • Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20°C-25°C) prima dell'uso. • Soluzione diluente (Diluent Concentrate): la soluzione diluente è concentrata 5X e deve essere diluito 1/5 con acqua distillata o deionizza (1 parte di soluzione 5X, 4 parti di H2O). • Soluzione di lavaggio concentrata (Wash Solution Concentrate): la soluzione di lavaggio è concentrata 20X e deve essere diluita 1/20 con acqua distillata o deionizzata (1 parte di soluzione 20X, 19 parti di H2O). La formazione di cristalli nel concentrato può verificarsi quando le temperature di conservazione sono basse, in tal caso riscaldare la soluzione a 30-35°C prima dell’utilizzo. • Soluzione di estrazione (Extraction Buffer Concentrate): la soluzione di estrazione è concentrata 4X e deve essere diluito 1/4 con acqua distillata o deionizzata. (1 parte di soluzione 4X, 3 parti di H2O). La soluzione diluita 1X deve essere riscaldato a 50-60°C prima dell'uso. • Anticorpo legato con l’enzima (Enzyme-Antibody Conjugate): determinare la quantità necessaria di soluzione di lavoro 1X per effettuare l’analisi. La soluzione è concentrata 10X e deve essere diluita 1/10 (1 parte di soluzione 10X, 9 parti di diluente 1X) immediatamente prima dell'uso. Diluire solo ciò che è necessario. Mescolare delicatamente ed evitare la formazione di schiuma. • Piastra ELISA (Pre-coated ELISA Micro Plate): pronto per l'uso. Dissigillare il sacchetto di alluminio e rimuovere la piastra dal sacchetto, prelevare le strip che non verranno utilizzate e riporle nel sacchetto di alluminio. • Standard: preparare seguendo il certificato di analisi. [5] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 5 – Procedura per l’esecuzione del test Si consiglia di analizzare standard e campioni in duplicato. 1. Prelevare 100 μl di: • Standard 0 1X diluente (0.0 ng/ml) • Standard 1 (20 ng/ml) • Standard 2 (60 ng/ml) • Standard 3 (180 ng/ml) • Standard 4 (540 ng/ml) 2. Depositare 100 μl del campione (in duplicato) all’interno dei pozzetti scelti. 3. Incubare la piastra ELISA agitando su un agitatore orbitale a 400 rpm, a temperatura ambiente, per 30 ± 2 minuti. Mantenere la piastra coperta al buio durante l'incubazione. 4. Dopo l'incubazione rimuovere ed eliminare il contenuto dai pozzetti. 5. Riempire completamente ogni pozzetto (300 μl) con la soluzione di lavaggio opportunamente diluita e aspirare. Ripetere tre volte, per un totale di quattro lavaggi. • Se il lavaggio viene effettuato manualmente: riempire completamente i pozzetti con tampone di lavaggio, capovolgere la piastra quindi rovesciare il contenuto in un contenitore per rifiuti. Ripetere 3 volte per un totale di quattro lavaggi. Per rimuovere completamente il liquido in eccesso al termine dei tre lavaggi utilizzare della carta assorbente su cui capovolgere la piastra. 6. Pipettare 100 μl della soluzione contente l’anticorpo legato con l’enzima (Enzyme-Antibody Conjugate) in ogni pozzetto. Incubare su un agitatore orbitale a 400 rpm, a temperatura ambiente, per 10±2 minuti. Mantenere la piastra coperta al buio durante l'incubazione. 7. Lavare e asciugare i pozzetti come al punto 5. 8. Pipettare 100 μl di Soluzione cromogena TMB (Chromogen-Substrate Solution) in ogni pozzetto. 9. Incubare agitando (lontano dalla luce del sole diretta o UV) su un agitatore orbitale a 400 rpm a temperatura ambiente esattamente per 10 minuti. N.B. non svuotare la piastra. 10. Dopo 10 minuti, aggiungere 100 μl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto. 11. Determinare l'assorbanza (450 nm) del contenuto di ogni pozzetto entro 30 minuti. Calibrare il lettore di piastre in base alle specifiche del costruttore. [6] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 6 – Elaborazione dei risultati 1. Sottrarre il valore del rumore di fondo (valore medio di assorbanza rilevato con standard zero) dai valori ottenuti dall’analisi per ogni campione. 2. Calcolare la media delle eventuali letture eseguite in duplicato per ogni standard e utilizzarli per costruire una curva standard. Costruire la curva standard utilizzando un software in grado di generare una curva standard con almeno quatto punti. 3. Calcolare la concentrazione del campione mediante l’interpolazione con la curva standard. Il risultato è espresso in ng/ml (ppb). Moltiplicare per il fattore di diluizione del campione per ottenere la concentrazione dei campioni originali. Ad esempio, se la diluizione totale del campione è 1/100 e la concentrazione del campione ottenuta mediante l’interpolazione con la curva standard è di 200 ng/ml (ppb), la concentrazione finale del campione è di 200 ng/ml x 100 = 20.000 ng/ml (ppb) che è 20 mg/ml (ppm). 4. Nella figura seguente vien riportata una curva standard ad uso dimostrativo, non utilizzare per l’esecuzione del test. Ad ogni analisi è necessario disegnare una nuova curva standard. [7] Standard Concentrazione (ng/ml) Valori Densità Ottica (OD) Calcolo concentrazione (ng/ml) 0 1 2 3 4 0 20 60 180 540 0.102 0.267 0.898 2.029 2.881 (-) 19.998 60.025 180.566 540.640 User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 % Recupero 99.99 100.04 100.31 105.67 7 – Sensibilità Il limite di rilevabilità più basso è 9.678 ng/ml. Il limite di rilevabilità più basso è determinato sommando tre deviazioni standard del valore medio della densità ottica di quarantotto replicati dello standard zero calcolando poi la concentrazione corrispondente. 8 – Precisione Precisione intra saggio Media %CV=3.443 N=12 Precisione inter saggio Media %CV=8.027 N=12 9 – Specificità e reattività incrociata Anacardo Betalactoglobulina BLG Capasanta Caseina bovina Ceci Estratto di pisello Fagiolo di Lima Farina di arachidi Farina di grano saraceno Farina di mais Farina di mandorla Farina di noce di cocco Farina di pistacchio Farina di soia Farina di sorgo Gamberetto Latte bovino Latte di mandorla Latte di noce di cocco Latte di soia Nocciola Noce Noce brasiliana Noce macadamia Noce pecan Ovomucoide Parvalbumina di pesce Pinolo Sedano Semi di girasole Semi di senape Semi di sesamo Semi di zucca [8] <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% (+) <1% <1% <1% <1% <1% <1% (+) <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016 10 – Dichiarazione di non responsabilità Generon srl non si assume responsabilità di alcun tipo, esplicite o implicite, eccetto garantire che i materiali di cui i propri prodotti si compongono sono di qualità standard. In caso di materiale difettoso, Generon srl si impegna a fornire un prodotto sostitutivo. Generon srl non è tenuta a rispondere per qualunque danno, inclusi danni speciali o consequenziali o spese che derivano direttamente o indirettamente dall`uso di questo prodotto. L’acquirente può duplicare questo documento, in tutto o in parte, solo per scopi interni, a condizione che questa nota venga riportata in tutte le copie. Nella duplicazione l’acquirente si impegna a compiere ogni ragionevole sforzo per impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. Questo manuale è la semplice traduzione in lingua italiana del manuale in lingua straniera presente nel kit. [9] User Manual - ALLwell Coconut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016