ALLwell
Elution Technologies
Pine Nut Proteins
Elisa kit
Cat. N. ETE-75PNE
Kit per la rilevazione di pinolo in campioni alimentari
Manuale d’uso
Leggere attentamente il manuale prima di procedere all’uso del kit
Via San Geminiano, 4
41030 San Prospero (MO)- Italy
(: +39 059 8637161
: +39 059 7353024
*: [email protected]
: www.generon.it
[1]
User Manual - ALLwell Pine Nut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016
1 – Principio del test e suo utilizzo
Il test si basa sulla tecnica ELISA utilizzando la metodica del doppio anticorpo coniugato con un
enzima per la rivelazione immunoenzimatica dell’analita di interesse. La tecnica viene brevemente
descritta di seguito.
I pozzetti della piastra ELISA sono rivestiti con un anticorpo che riconosce specificamente le proteine
del pinolo.
L’aggiunta del campione nei pozzetti della piastra permette all’anticorpo monoclonale di legarsi alla
proteina di interesse, dopo una fase di lavaggio è aggiunto un secondo anticorpo specifico per la
proteina di interesse coniugato con una perossidasi.
Questo anticorpo si lega alla proteina bersaglio, attraverso l’utilizzo della perossidasi e del substrato
TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) si ha lo sviluppo della reazione colorimetrica.
Il cambio di colorazione dopo l’aggiunta del substrato TMB è un indice della concentrazione di
proteina.
Il contenuto di proteina nei campioni è determinato dalla comparazione con la curva standard
costruita mediante l’utilizzo di standard forniti con il kit.
Il test di analisi sandwich ELISA è altamente sensibile per la rilevazione delle proteine del pinolo in cibi
cotti e crudi.
Attenzione: le matrici alimentari possono essere estremamente diverse in seguito alla combinazioni di
additivi e processi industriali che possono influenzare l’analisi delle le proteine.
Per analisi su altri tipi di matrice non riportati espressamente nel protocollo consultare i tecnici
Generon (www.generon.it – email: [email protected]).
•
Il test è solo ad uso di ricerca non a scopo diagnostico, solo per uso in vitro.
•
Risultati affidabili e riproducibili vengono ottenuti quando la procedura di analisi viene eseguita
dopo aver compreso tutte le informazioni contenute nel manuale illustrativo e seguendo le buone
pratiche di laboratorio.
•
Fattori che potrebbero influenzare il risultato finale del test sono l’adeguatezza dello strumento
utilizzato, la pulizia del materiale in vetro, la qualità dell’acqua distillata o deionizzata, la precisione
nelle operazioni di prelievo sia dei reagenti che dei campioni, le tecniche di lavaggio, il tempo di
incubazione o la temperatura.
•
Non mescolare tra loro reagenti provenienti da altri lotti o fonti.
•
I risultati dei test non sono applicabili a porzioni non testate del campione.
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User Manual - ALLwell Pine Nut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016
2 – Componenti del Kit
La data di scadenza del kit e dei suoi componenti è indicata sull'etichetta della confezione. Tutti i
componenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e utilizzati seguendo le istruzioni
riportate nel manuale.
Materiale
Descrizione
Preparazione
Conservazione
Stabilità
Piastra da
microtitolazione ELISA
(ELISA Micro Plate,
antibody coated)
Piastra da 96 pozzetti
con anticorpo
immobilizzato.
Pronta all’uso.
4-8°C, In un sacchetto
di alluminio sigillato con
essiccante.
Seguendo le corrette
modalità di
conservazione fino alla
data di scadenza.
Anticorpo con enzima
(Enzyme Conjugated
Detection Antibody)
1 vial da 1.5 ml 10X di
anticorpo coniugato
con perossidasi di
rafano (HRP) in
soluzione.
Diluire 1/10 prima
dell’uso per preparare
una soluzione di lavoro.
4-8°C al buio.
La soluzione 10X è
stabile fino alla data di
scadenza.
Standard
1 vial contenente lo
standard concentrato.
Fare riferimento al
certificato di analisi
(CoA).
4-8°C. Non congelare.
Stabile fino alla data di
scadenza.
4-8°C per la soluzione di
lavoro 1X e la soluzione
del diluente 5X.
La soluzione di lavoro 1X
è stabile per una
settimana dalla data di
preparazione. La
soluzione 5X
concentrata è stabile
fino alla data di
scadenza.
4-8°C per la soluzione di
lavoro 1X e la soluzione
del diluente 5X.
La soluzione di lavoro 1X
è stabile per una
settimana dalla data di
preparazione.
La soluzione 20X è
stabile fino alla data di
scadenza.
Diluente concentrato
(Diluent Concentrate)
Soluzione di lavaggio
(Wash Solution
Concentrate)
1 bottiglia da 50 ml di
soluzione 5X.
Diluire 1/5 prima
dell’uso per preparare
una soluzione di lavoro.
1 bottiglia da 50 ml di
soluzione di lavaggio
20X.
Diluire 1/20 prima
dell’uso per preparare
una soluzione di lavoro.
Soluzione di estrazione
concentrata
(Extraction Buffer
Concentrate)
1 bottiglia da 120 ml di
soluzione di estrazione
4X.
Diluire 1/4 prima
dell’uso per preparare
una soluzione di lavoro.
La soluzione di lavoro
deve essere
preriscaldata prima
dell’uso a 50-60°C.
4-8°C.
La soluzione di lavoro e
la soluzione
concentrata fino alla
data di scadenza..
Soluzione cromogena
(Chromogen-Substrate
Solution)
1 bottiglia da 12 ml di
3,3',5,5'tetrametilbenzidina
(TMB) e perossido di
idrogeno in tampone di
acido citrico pH 3.3.
Pronta all’uso.
4-8°C al buio.
Stabile fino alla data di
scadenza. Proteggere
dalla luce.
Soluzione bloccante
(STOP Solution)
Attenzione: evitare il
contatto con la pelle
1 bottiglia da 12 ml di
0.3 M di acido solforico.
Pronta all’uso.
4-8°C.
Stabile fino alla data di
scadenza.
Materiale richiesto per effettuare l’analisi ma non presente nel kit:
Micropipette (da 2 μl a 100 μl), provette, lava-piastre automatico, acqua distillata o deionizzata,
lettore di piastre ELISA, vetreria per la preparazione di reagenti e soluzioni, timer, mixer o vortex,
agitatore bagnomaria, agitatore orbitale, bilancia, centrifuga.
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User Manual - ALLwell Pine Nut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016
3 – Preparazione del campione
1. I campioni alimentari devono essere estratti utilizzando la soluzione di estrazione 1X (Extraction
Buffer) preriscaldata (50-60°C). Per una corretta estrazione è necessario ottenere una miscela
omogenea del campione. Campioni di alimenti solidi devono essere macinati/frantumati per
ottenere una migliore consistenza e favorire l’efficienza dell’estrazione.
Per campioni alimentari solidi: preparare una diluizione 1/10 della soluzione di estrazione
(Extraction Buffer) preriscaldata. Pesare 0.5 grammi (±4%) del campione ben
macinato/frantumato e aggiungere 4.5 ml (±2%) della soluzione di estrazione (Extraction Buffer)
diluita e precedentemente preriscaldata. Mescolare mediante agitatore (Vortex). Il rapporto
campione/soluzione di estrazione (Extraction Buffer) è 1/9 (1 parte di campione e 9 volumi di
soluzione di estrazione - Extraction Buffer).
Per campioni liquidi: preparare una diluizione 1/10 della soluzione di estrazione (Extraction
Buffer) preriscaldata. Aggiungere 0.5 ml (±2%) del campione liquido omogeneo a 4,5 ml (±2%)
della soluzione di estrazione (Extraction Buffer) diluita e precedentemente preriscaldata. Il
rapporto campione/soluzione di estrazione (Extraction Buffer) è 1/9 (1 parte di campione e 9
volumi di soluzione di estrazione - Extraction Buffer).
Acque di lavaggio industriale (CIP - Clean in Place Solution): preparare una diluizione 1/5 della
soluzione di diluizione 1X (Diluent Buffer). Aggiungere 1 ml di soluzione CIP in 4 ml di tampone
diluente 1X.
2. Trasferire i campioni nell’agitatore a bagnomaria per 25 minuti a 50-60°C in agitazione. In
alternativa lasciare i campioni a bagnomaria per 25 minuti agitando per 1 minuto ogni 5 minuti.
3. Dopo l'estrazione, centrifugare i campioni per favorire la sedimentazione del particolato o in
alternativa lasciar riposare il campione per cinque minuti in un porta provette.
4. 4. Prelevare 100 μl dallo strato intermedio della soluzione contente il campione in una nuova
provetta e aggiungere 900 μl della soluzione diluente precedentemente diluita. Vortexare o
mescolare bene. La diluzione finale del campione da analizzare è ora di 1/100.
Sostanze inibenti la reazione enzimatica: l'anione azide e il Thimerosal a concentrazioni superiori allo
0.1%.
La stabilità dei campioni non è stata valutata.
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User Manual - ALLwell Pine Nut Proteins ELISA Kit Rev. 1 04/01/2016
4 – Preparazione dei reagenti
•
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20°C-25°C) prima dell'uso.
•
Soluzione diluente (Diluent Concentrate): la soluzione diluente è concentrata 5X e deve essere
diluito 1/5 con acqua distillata o deionizza (1 parte di soluzione 5X, 4 parti di H2O).
•
Soluzione di lavaggio concentrata (Wash Solution Concentrate): la soluzione di lavaggio è
concentrata 20X e deve essere diluita 1/20 con acqua distillata o deionizzata (1 parte di soluzione
20X, 19 parti di H2O). La formazione di cristalli nel concentrato può verificarsi quando le
temperature di conservazione sono basse, in tal caso riscaldare la soluzione a 30-35°C prima
dell’utilizzo.
•
Soluzione di estrazione (Extraction Buffer Concentrate): la soluzione di estrazione è concentrata 4X
e deve essere diluito 1/4 con acqua distillata o deionizzata. (1 parte di soluzione 4X, 3 parti di H2O).
La soluzione diluita 1X deve essere riscaldato a 50-60°C prima dell'uso.
•
Anticorpo legato con l’enzima (Enzyme-Antibody Conjugate): determinare la quantità necessaria
di soluzione di lavoro 1X per effettuare l’analisi. La soluzione è concentrata 10X e deve essere
diluita 1/10 (1 parte di soluzione 10X, 9 parti di diluente 1X) immediatamente prima dell'uso. Diluire
solo ciò che è necessario. Mescolare delicatamente ed evitare la formazione di schiuma.
•
Piastra ELISA (Pre-coated ELISA Micro Plate): pronto per l'uso. Dissigillare il sacchetto di alluminio e
rimuovere la piastra dal sacchetto, prelevare le strip che non verranno utilizzate e riporle nel
sacchetto di alluminio.
•
Standard: preparare seguendo il certificato di analisi.
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5 – Procedura per l’esecuzione del test
Si consiglia di analizzare standard e campioni in duplicato.
1. Prelevare 100 μl di:
•
Standard 0
1X diluente (0.0 ng/ml)
•
Standard 1
(15 ng/ml)
•
Standard 2
(45 ng/ml)
•
Standard 3
(135 ng/ml)
•
Standard 4
(405 ng/ml)
2. Depositare 100 μl del campione (in duplicato) all’interno dei pozzetti scelti.
3. Incubare la piastra ELISA agitando su un agitatore orbitale a 400 rpm, a temperatura ambiente,
per 30 ± 2 minuti. Mantenere la piastra coperta al buio durante l'incubazione.
4. Dopo l'incubazione rimuovere ed eliminare il contenuto dai pozzetti.
5. Riempire completamente ogni pozzetto (300 μl) con la soluzione di lavaggio opportunamente
diluita e aspirare. Ripetere tre volte, per un totale di quattro lavaggi.
•
Se il lavaggio viene effettuato manualmente: riempire completamente i pozzetti con
tampone di lavaggio, capovolgere la piastra quindi rovesciare il contenuto in un
contenitore per rifiuti. Ripetere 3 volte per un totale di quattro lavaggi. Per rimuovere
completamente il liquido in eccesso al termine dei tre lavaggi utilizzare della carta
assorbente su cui capovolgere la piastra.
6. Pipettare 100 μl della soluzione contente l’anticorpo legato con l’enzima (Enzyme-Antibody
Conjugate) in ogni pozzetto. Incubare su un agitatore orbitale a 400 rpm, a temperatura
ambiente, per 10±2 minuti. Mantenere la piastra coperta al buio durante l'incubazione.
7. Lavare e asciugare i pozzetti come al punto 5.
8. Pipettare 100 μl di Soluzione cromogena TMB (Chromogen-Substrate Solution) in ogni pozzetto.
9. Incubare agitando (lontano dalla luce del sole diretta o UV) su un agitatore orbitale a 400 rpm a
temperatura ambiente esattamente per 10 minuti. N.B. non svuotare la piastra.
10. Dopo 10 minuti, aggiungere 100 μl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto.
11. Determinare l'assorbanza (450 nm) del contenuto di ogni pozzetto entro 30 minuti. Calibrare il
lettore di piastre in base alle specifiche del costruttore.
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6 – Elaborazione dei risultati
1. Sottrarre il valore del rumore di fondo (valore medio di assorbanza rilevato con standard zero) dai
valori ottenuti dall’analisi per ogni campione.
2. Calcolare la media delle eventuali letture eseguite in duplicato per ogni standard e utilizzarli per
costruire una curva standard. Costruire la curva standard utilizzando un software in grado di
generare una curva standard con almeno quatto punti.
3. Calcolare la concentrazione del campione mediante l’interpolazione con la curva standard. Il
risultato è espresso in ng/ml (ppb). Moltiplicare per il fattore di diluizione del campione per
ottenere la concentrazione dei campioni originali. Ad esempio, se la diluizione totale del
campione è 1/100 e la concentrazione del campione ottenuta mediante l’interpolazione con la
curva standard è di 200 ng/ml (ppb), la concentrazione finale del campione è di 200 ng/ml x 100
= 20.000 ng/ml (ppb) che è 20 mg/ml (ppm).
4. Nella figura seguente vien riportata una curva standard ad uso dimostrativo, non utilizzare per
l’esecuzione del test. Ad ogni analisi è necessario disegnare una nuova curva standard.
[7]
Standard
Concentrazione
(ng/ml)
Valori Densità
Ottica (OD)
0
1
2
3
4
0
15
45
135
405
0.068
0.181
0.516
1.24
2.536
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Calcolo
concentrazione
(ng/ml)
(-)
15.145
44.841
135.244
406.041
% Recupero
100.97
99.65
100.18
100.26
7 – Sensibilità
Il limite di rilevabilità più basso è 6.922 ng/ml.
Il limite di rilevabilità più basso è determinato sommando tre deviazioni standard del valore medio
della densità ottica di quarantotto replicati dello standard zero calcolando poi la concentrazione
corrispondente.
8 – Precisione
Precisione intra saggio
Media %CV=4.615
N=12
Precisione inter saggio
Media %CV=8.713
N=12
9 – Specificità e reattività incrociata
Anacardo
Betalactoglobulina BLG
Capasanta
Caseina bovina
Ceci
Estratto di pisello
Fagiolo di Lima
Farina di arachidi
Farina di grano saraceno
Farina di mais
Farina di mandorla
Farina di noce di cocco
Farina di pistacchio
Farina di soia
Farina di sorgo
Gamberetto
Latte bovino
Latte di mandorla
Latte di noce di cocco
Latte di soia
Nocciola
Noce
Noce brasiliana
Noce macadamia
Noce pecan
Ovomucoide
Parvalbumina di pesce
Pinolo
Sedano
Semi di girasole
Semi di senape
Semi di sesamo
Semi di zucca
[8]
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(+)
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impedire l'uso non autorizzato e la distribuzione delle informazioni sulla proprietà. Questo manuale è la
semplice traduzione in lingua italiana del manuale in lingua straniera presente nel kit.
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