UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI FERRARA
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica
Sezione di Microbiologia
Corso di Biotecnologie interfacoltà
Modulo: Laboratorio di Microbiologia
medica ed applicata
Prof.ssa Christine Schwienbacher
Anno Accademico 2011 - 2012
Presentazione corso batteriologico:
• Urinocoltura:
semina quali-quantitativa
• Valutazione della crescita batterica su diversi terreni
• Antibiogramma secondo Kirby-Bauer
• Identificazione mediante sistema biochimico (API oppure
Enterotube)
• PAR test
Campione urine
ESAMINARE IL CAMPIONE ENTRO
2 ORE DAL PRELIEVO oppure
CONSERVARE A +4°C PER 24 ORE
Semina quali-quantitativa (Ricerca patogeni causa
di infezione) : TSA terreno TVC totale.
TERRENI SELETTIVI:
MacConkey, mEnterococcus, Columbia agar, Cetrimide agar
Chromogenic UTI Medium
PAR test
(Potere antibatterico residuo)
Dopo incubazione
Interpretazione:
lettura piastre
1-Antibiogramma
(Test sensibilità MIC=
Minima concentrazione
inibente)
2-Identificazione : test
biochimici (Enterotube II)
Refertazione
•
•
•
•
•
FASE 1
– Semina quali-quantitativa urine su piastra di diversi terreni:
– TCV => TSA TERRENO GENERICO BASE
– TERRENI SELETTIVI:
• Agar MacConkey 3
• Agar mEnterococcus, Columbia agar, Cetrimide agar
• Chromogenic Urinary Tract Infection(UTI) Medium
FASE 2:
– Interpretazione semina su piastra
– Allestimento PAR test
FASE 3
– Interpretazione PAR test
FASE 4:
– Allestimento Antibiogramma
– Allestimento API oppure Enterotube
Fase 5:
– Interpretazione Antibiogramma
– Interpretazione API oppureEnterotube
– Conclusioni finali: REFERTO
FASE 1: Semina quali- quantitativa urine su TSA agar, MacConkey, mEnterococcus ,
Columbia agar, Cetrimide agar e Chromogenic Urinary Tract (UTI) Medium.
AGAR MACCONKEY n.3
Terreno selettivo per differenziare in modo ottimale i coliformi
ed enterobatteri patogeni non fermentanti il lattosio :
Composizione
Peptone
20.0 g/l
Lattosio
10.0 g/l
Sali biliari n3
1.5 g/l
.
Sodio cloruro
5.0 g/l
Rosso neutro
0.03 g/l
Descrizione
Cristal violetto
0.001 g/l
Agar
12.0
È una modificazione altamente selettiva del
terreno MacConkey,adatta
perg/lla crescita
7.0 +/- 0,2
e il conteggio dei batteri coliformipH
ed= anche
per la loro differenziazione dagli
Altri coliformi, gli enterobatteri patogeni come Salmonella e Shigella, che non
fermentano il lattosio.
La presenza i una frazione particolare di sali biliari in aggiunta al cristal-violetto, il
terreno migliora la differenziazione fra coliformi e microrganismi che non
fermentano il lattosio. I cocchi gram positivi (esempio Staphylococcus spp.) sono
completamente inibiti.
ASPETTO DELLE COLONIE
Le caratteristiche delle colonie rappresentano un’identificazione
solo presuntiva, che deve essere confermata mediante test
biochimici specifici (esempio Enterotube II).
MICRORGANISMO
COLORE
ESCHERICHIA COLI
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
COLONIA VIOLA CON ALONE
PRECIPITAZIONE ROSSO
INCOLORE -ROSA
COCCHI GRAM+
INIBITI : NON CRESCONO
OSSERVAZIONI
DI
COLONIE IRREGOLARI
I batteri che fermentano il lattosio (es. E. coli) danno colonie
ROSSO MATTONE SENZA ALONE DI
COLONIE PIÙ PICCOLE DI E.COLI
circondate da un alone di sali
biliari precipitati (questa reazione
è
PRECIPITAZIONE
dovuta all’azione di acidi prodotti
dalla
fermentazione del lattosio
SALMONELLA/SHIGHELLA
INCOLORE
TRASPARENTE
sui sali biliari e il successivo assorbimento del rosso neutro
(perciò le colonie di E. coli risultano di colore rosso-viola).
I batteri che non fermentano il lattosio (es. Salmonelle) non
modificano il colore del terreno; danno una reazione alcalina e le
colonie appaiono trasparenti.
ENTEROBACTER AEROGENES
Tecnica:Inoculare le piastre ed incubare a 35±2°C per 16- 24 ore per
batteri che non fermentano il lattosio e fino a 48 h per batteri che fermentano il
lattosio.
mENTEROCOCCUS
Terreno selettivo per l’isolamento degli Enterococchi.
Composizione
Triptosio
Estratto di lievito
Destrosio
Sodio fosfatomonoacido idrato
Sodio azide
Tetrazolio cloruro (TTC)
Agar
pH = 7.2 +/- 0,2
20.0 g/l
50. g/l
2.0 g/l
40. g/l
0.4 g/l
0.1 g/l
10.0 g/l
Descrizione
Questo terreno evidenzia gli enterococchi (streptococchi del gruppo D); tutte le
colonie rosse, marroni o rosa sono da considerare presunti enterococchi.
Inibito E. coli.
Conservazione delle piastre di terreno prima dell’uso: temperatura di +2 /+8°C.
mENTEROCOCCUS
Terreno selettivo per l’isolamento degli Enterococchi.
ASPETTO DELLE COLONIE
MICRORGANISMO
COLORE
ENTEROCOCCHI (STREPTOCOCCHI DEL
GRUPPO D)
COLONIE DI COLORE ROSAROSSO SCURO-MARRONE
ESCHERICHIA COLI
NESSUNA CRESCITA
ENTEROCOCCUS FAECALIS
CRESCITA ABBONDANTE CON
COLONIE DI COLORE ROSA ROSSO SCURO
Tecnica:
Inoculare le piastre ed incubare a 37±2°C per 24-48 ore per evidenziare le
caratteristiche colturali dei microrganismi cresciuti.
CHROMOGENIC TRACT URINARY INFECTION (UTI) MEDIUM
Terreno cromogeno per l’identificazione presuntiva e la differenziazione della maggior parte di
patogeni che possono causare infezioni del tratto urinario (UTI).
Il terreno contiene due substrati cromogeni specifici che sono scissi da enzimi prodotti da
Enterococcus spp., da Escherichia coli e dai coliformi.
Contiene, inoltre, triptofano per mettere in evidenza l’attività dell’enzima triptofano deaminasi che, a
sua volta, indica la presenza di Proteus spp..
Lo scarso contenuto di elettroliti che presenta il terreno Chromogeni UTI impedisce la sciamatura
del batterio Proteus spp..
Composizione
Peptone
15.0 g/l
Miscela cromogena
13.0 g/l
Agar
15.0 g/l
pH=7,0+/-0,2
Descrizione
Il bersaglio del primo cromogeno, X-Glucoside, è la b-glucosidasi e consente di identificare in
modo spedifico gli enterococchi che formano colonie blu.
L’altro cromogeno, Rosa-Galattoside, è scisso dall’enzima b-galattosidasi che è prodotto da
Escherichia coli, che forma colonie rosa.
Quando vi sono incertezze di identificazione si può eseguire il test biochimico seguente: si
preleva dalla piastra una colonia di E. coli sospetta e si esegue il test dell’indolo con reattivo
DMAC.
I coliformi vengono differenziati perché si avviene la scissione
di entrambi i cromogeni formando colonie di colore porpora.
Il terreno contiene inoltre triptofano che si comporta da
Indicatore dell’attività triptofano deaminasica: Proteus, Morganella e
Providencia spp. formano colonie circondate da un alone marrone.
E’ importante precisare che i batteri con “pattern” enzimatici atipici
possono fornire reazioni anomale.
Per esempio, durante una semina
su terreno Chromogenic UTI, oltre il 45% di Enterobacter cloacae
saggiati ha evidenziato la mancanza della b-glucosidasi.
Le colonie di tali ceppi sono risultate di colore rosa, difficilmente
distinguibili da quelle di E. coli.
In questi casi si esegue su carta da filtro il test dell’indolo con reattivo
DMAC oppure utilizzare il reattivo di Kovacs, si dovrebbe evidenzia re il
colore rosa - bordeaux della reazione positiva del test
dell’indolo).
Questo test consente di differenziare E. coli da Enterobacter spp. ,
nonché Proteus mirabilis da altre specie.
ASPETTO DELLE COLONIE:
Tabella delle reazioni colorimetriche tipiche
MICRORGANISMO
b-D
GALATTOSIDASI
bGLUCOSIDAS
I
ENTEROCOCCHI
TDA
TRIPTOFANO
DEAMINASI
+
ESCHERICHIA COLI
+
COLIFORMI
+
PROTEUS
/MORGANELLA E
PORVIDENCIA SPP.
COLORE DELLE
COLONIE
BLU
ROSA
+
PORPORA
+
MARRONE
PSEUDOMONAS
FLUORESCENTE
STAPHYLOCOCCUS
PIGMENTAZION
E NORMALE
Tecnica:
Inoculare le piastre ed incubare a 37±2°C per 24-48 ore per evidenziare le
caratteristiche colturali dei microrganismi cresciuti.
Organism
ß-galactosidase
ß-glucosidase
TDA
Colony colour
Enterococci
-
+
-
Blue
E. coli
+
-
-
Pink
Coliforms
+
+
-
Purple
Proteus/Morganella
& Providencia spp.
-
-
+
Brown
Pseudomonads
-
-
-
Fluoresce
Staphylococci
-
-
-
Normal
pigmentation
Terreno:
Chromogenic UTI Medium :
Blu-verdi = Colonie di Enterococchi
Rosa= colonie di Escherichia coli
Azzurre= colonie di coliformi (Gruppo KES)
Enterobacter
cloacae
Staphylococcus
aureus
Enterococcus
faecalis
Pseudomonas
aeruginosa
Proteus mirabilis
Escherichia Coli
Metodo: SEMINA QUANTITATIVA
•
Materiale:
–
–
–
–
–
urine
1 piastra Macconkey3
1 piastra mEnterococcus
1 piastra Chromogenic Urinary Tract Infection (UTI) Medium
3 anse blu da 10 l (1 ansa blu per ogni terreno :
Macconkey3, mEnterococcus e Chromogenic UTI Medium)
– 1 pennarello
– Guanti
•
Procedimento:
– Scrivere il nome e la data sul fondo delle piastre
– Immergere l’ansa blu da 10 l nella provetta delle urine per prelevare il campione e
seminare su piastra Chromogenic UTI Medium nel seguente modo:
1
2
IL SISTEMA PERMETTE DI QUANTIFICARE L'INFEZIONE contando il numero di colonie: più di 20-25 corrispondono a una conta di 100.000 (Clicca sull'immagin
Dipslide
• IL SISTEMA PERMETTE DI QUANTIFICARE
L'INFEZIONE contando il numero di colonie:
più di 20-25 corrispondono a una conta di
100.000
Giorno 2:
INTERPRETAZIONE SEMINA IN PIASTRA
Lettura piastra:
si esegue visivamente la conta delle colonie;
In caso di:
1)-assenza di crescita (nessuna colonia presente): il risultato si esprime come segue:
< 1000 CFU/ml;
2)-presenza di colonie:
2.1- eseguire visivamente la conta delle colonie;
2.2- il N.° di colonie conteggiate deve essere moltiplicato x 100 se si utilizza l’ansa da 10
microlitri = 1/ 100 ml [oppure x 1000 se si utilizza l’ansa gialla da 1 microlitro];
2.3- L’unità di misura si esprime nel seguente modo:
CFU/ml oppure UFC/ml (CFU o UFC = Unità Formante Colonia / ml).
La determinazione della carica microbica deve essere eseguita per ogni tipo di colonia
morfologicamente diversa.
Per indicare positiva una urinocoltura (presenza di infezione) si deve ottenere una conta = o
> a 105 CFU/ml (= 100.000 germi/ml) per campione ottenuto da mitto intermedio.
In caso di valori inferiori a 10 4 CFU/ml sono indice di contaminazione.
Giorno 2:
INTERPRETAZIONE SEMINA IN PIASTRA
Lettura piastra:
si esegue visivamente la conta delle colonie;
Tipo colonia (specificare l’aspetto)
Somma delle colonie
numero
Test del POTERE ANTIMICROBICO
RESIDUO (PAR test)
• Il test individua
– Residui di farmaci antibiotici
– Residui di farmaci non antibiotici dotati
di attività antimicrobica
– Sostanze
naturali
con
effetto
antimicrobico simile
Numerose piante sono dotate di potere antimicrobico:
•
•
•
•
•
•
•
Vari cereali
Carote
Patate
Liliacee come aglio e cipolla
Crocifere (senape, rafano)
Propoli
Aloe vera
•
•
•
•
•
•
•
Estratti di semi di pompelmo
Rosmarino
Ceci
Salvia
Timo
Fragole
Aceto di mele
Numerosi oli essenziali hanno azione antisettica
perché contengono
FENOLI ED ALDEIDI (Thymol da Thymus vulgaris)
ALCOOLI (Linalol da Lavandula vera, L. latifolia/spica)
• Alcuni farmaci NON antibiotici sono dotati di attività
antibatterica evidenziabile nei liquidi biologici:
–
–
–
–
–
–
–
Esempi:
Neurolettici
Antimalarici
Antistaminici
Diuretici
Anti-ulcera
Anti-ipertensivi
Anestetici
• Alcuni fattori naturali e principi attivi diversi dagli
antibiotici sono dotati di attività antibatterica
evidenziabile nei liquidi biologici:
–
–
–
–
Esempi:
Frazioni del complemento
Opsonine ed anticorpi specifici
Proteine di derivazione fagocitaria
Beta-lisine
Par test: saggio di diffusione in agar
Dischetto imbevuto di urine
Dischetto sterile (CONT NEG)
Inoculo con spore
di Bacillus subtilis
Dischetto imbevuto di
Penicillina (CONT POS)
37 °C
PAR positivo
PAR negativo
URINE
POS
URINE
NEG
PAR TEST POSITIVO
NEG
POS
PAR TEST NEGATIVO
Par test: interpretazione
Par -
Coltura - Il risultato della coltura è
avvalorato
Par-
Coltura + Il risultato della coltura è
avvalorato
Par+
Coltura -
Par+
Coltura + Se i paziente è in terapia
antibiotica, questa è inefficace
Attenzione alle basse cariche batteriche
Germi difficili?
Esecuzione di test di approfondimento
Richiesta di informazioni cliniche (paziente
sintomatico?, terapia antibiotica in atto?)
Assunzione di sostanze antibatteriche con
l’alimentazione?terapie alternative con effetto
antimicrobico?
Par test: ruolo nella diagnosi delle
infezioni delle vie urinarie
• Il Par test in associazione all’urinocoltura è
fondamentale per una corretta diagnosi delle
infezioni delle vie urinarie
• In assenza di dati clinici: Aiuta il microbiologo
nell’interpretazione dell’esame colturale
• Strumento aggiuntivo nella diagnosi delle infezioni
delle vie urinarie
Giorno 4: PAR TEST
Il PAR test è un saggio di diffusione da eseguire in piastre di agar nutritivo inoculato con spore
del microrganismo Bacillus subtilis. E’ utilizzato per determinare la presenza di sostanze dotate di
potere antibatterico nei liquidi biologici (latte, urine, sangue, ecc.).
Materiale
-piastre di PAR test con la coltura vitale di Bacillus subtilis;
-pinzetta;
-dischetti BLANK di diametro 13 mm da utilizzare per immergere nel campione di urine in esame;
-dischetti CONTROL di diametro 13 mm imbibiti di antibiotico come controllo positivo;
-dischetti BLANK di diametro 13 mm da utilizzare come controllo negativo.
PROCEDIMENTO:
Prelevare con pinzetta un dischetto BLANK ed immergerlo nel campione di urine in esame;
allontanare il liquido in eccesso;
-porre il dischetto sulla piastra di PAR Test esercitando una leggera pressione su di esso in modo
da assicurare
un buon contatto con la superficie dell’agar;
-porre su ogni piastra un dischetto CONTROL come controllo positivo e un dischetto BLANK come
controllo negativo.
-Incubare le piastre a 37 °C per 24 - 48 ore.
Giorno 4: PAR TEST
ATTENZIONE: prima di passare da un dischetto al successivo pulire accuratamente la pinzetta usata
con alcool isopropilico, in modo da evitare il trasferimento di eventuali sostanze antibatteriche da
un dischetto all’altro.
DISCHETTO BLANK
(CONTROLLO NEGATIVO)
DISCHETTO CONTROL
(CONTROLLO POSITIVO)
DISCHETTO IMBEVUTO
DI URINA
INOCULO CON SPORE
DI BACILLUS SUBTILIS
Giorno 5:
INTERPRETAZIONE DEL PAR TEST
-Osservare
controluce le piastre dopo incubazione per individuare la presenza di un
alone di inibizione attorno al dischetto imbibito con il campione in esame.
In presenza di alone significa che sono presenti nel campione sostanze ad azione
battericida.
-Il controllo negativo non deve presentare alcun alone;
-Il controllo positivo deve esibire un alone chiaramente visibile.
URINE
POS
URINE
NEG
PAR TEST POSITIVO
NEG
POS
PAR TEST NEGATIVO
TEST DELLA SENSIBILITA’ DEI BATTERI AGLI ANTIBIOTICI: metodo di
diffusione in agar
Materiale:
1 piastra petri con terreno Mueller-Hinton
1 provetta di soluzione fisiologica 4-5 ml.
1 ansa
1 tampone sterile
guanti
pennarello
pinzette
dischetto antibiotato
PROCEDIMENTO:
1-INOCULO DELLE PIASTRE DI MUELLER HINTON AGAR:
-scegliere , da una coltura in MAC CONKEY AGAR, 4 o 5 colonie ben isolate e
morfologicamente simili e con un’ansa sterile toccare la parte superiore della colonia;
- sospendere in una provetta contenente 4- 5 ml di soluzione fisiologica;
-agitare bene le colonie raccolte con l’ansa nella provetta del terreno liquido,
aiutandosi con il vortex, fino ad ottenere una soluzione con torpidità omogenea =
CORRISPONDENTE AD UNA TORBIDITA’ DI MAC FARLAND ( corrispondente a 106 di
batteri).
-Immergere un tampone sterile nella provetta, prelevare una certa quantità di
sospensione; eliminare l’eccesso di sospensione presente nel tampone con cura ,
ruotando diverse volte e premendo contro la parte superiore della provetta, sopra
dal menisco della sospensione.
Giorno 2: ANTIBIOGRAMMA
METODICA DI KIRBY- BAUER o TEST DI DIFFUSIONE IN AGAR o TEST DI SENSIBILITA’
MIC ( MINIMA CONCENTRAZIONE INIBENTE)
Metodo di diffusione in agar (KIRBY-BAUER) è un metodo quantitativo per valutare la
sensibilità agli antibiotici basato sulla misurazione degli aloni di inibizione.
Si utilizzano piastre pronte del terreno agarizzato Mueller Hinton.
MUELLER HINTON AGAR
Terreno raccomandato per i test di sensibilità agli antibiotici
Composizione
Infuso di carne di manzo
300 g/L
Idrolisato di caseina
17,5 g/l
Amido solubile
1,5 g/l
Agar
17,0 g/l
Conservazione delle piastre di terreno prima dell’uso: temperatura di +2 /+8°C.
-Inoculare strisciando il tampone uniformemente sulla superficie della piastra del terreno
Mueller-Hinton Agar ruotando la piastra di circa 60° . Ripetere per altre due volte per
garantire una semina uniforme e quindi una crescita confluente ( per fornire aloni di
inibizione uniformemente circolari).
-Prima di porre i dischetti impregnati di antibiotico, lasciare assorbire l’inoculo chiudendo
la piastra con il coperchio e lasciarla a temperatura ambiente per 5 minuti.
2-DEPOSIZIONE DEI DISCHETTI
-per mezzo di una pinza, pulita e disinfettata con alcool isopropilico, porre i dischetti di
antibiotici sulla superficie del terreno effettuando una leggera e delicata pressione del
dischetto sul terreno.
-Temperatura e tempo di incubazione in termostato:
+ 35 / +37 °C per 16-18 ore.
Giorno 3:
INTERPRETAZIONE ANTIBIOGRAMMA
-INTERPRETAZIONE DEGLI ALONI
-Dopo incubazione si esegue la lettura delle piastre: misurare gli aloni di
inibizione completa (arrotondando al millimetro più prossimo), utilizzando un
calibro o un idoneo dispositivo di misurazione = righello.
Si misura il diametro dell’alone comprendente anche il diametro del
dischetto. In base all’ampiezza dell’alone si classifica l’efficacia
dell’antibiotico e in base a apposite tabelle si classifica il microrganismo
come sensibile, moderatamente sensibile oppure resistente .
In caso di nessun alone si ha assenza di inibizione e quindi non
efficacia dell’antibiotico.
INTERPRETAZIONE
Tabella di riferimento
Antibiotico
Ac.nalidixico(NA)
Ampicillina(AMP)
Ceftazidime(CAZ)
Nitrofurantoina(F)
Norfloxacina(NOR)
Diametro alone di inibizione (mm)
Contenuto
disco(g)
del
Resistente
30
13
Intermedi
o
14-18
Moderatament
e sensibile
/
Sensi
bile
19
10
30
13
14
/
/
14-17
15-17
17
18
300
14
15-16
/
17
10
12
13-16
/
17
- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un
righello
- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento
Antibiotico
Acido nalidixico
Ampicillina
Ceftazidime
Nitrofurantoina
Norfloxacina
Diametro alone di inibizione
interpretazione
Dischetto
antibiotato
Diametro
dell’alone di
inibizione
Prato o coltura
batterica
INTERPRETAZIONE
Tabella di riferimento
Antibiotico
Diametro alone di inibizione (mm)
Contenuto
disco(g)
del
Resistente
Intermedio
Netilmicina(NET)
Clindamicina(CC)
30
13
14-18
Moderatamente
sensibile
/
2
Cefuroxima (CXM)
Ac.Pipemidico ( Pi)
Eritromicina (E)
30
10
14
/
/
11-16
15-17
16
18
20
14
15-16
/
17
15
10
11-14
/
14
- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un
Sensi
bile
19
righello
- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento
Antibiotico
Diametro alone di inibizione
interpretazione
Dischetto
antibiotato
Diametro
dell’alone di
inibizione
Prato o coltura
batterica
INTERPRETAZIONE
Tabella di riferimento
Antibiotico
Diametro alone di inibizione (mm)
Contenuto
disco(g)
del
Resistente
Intermedio
Cefoperazon (CF)
Oxicillina (OX)
30
13
14-18
Moderatamente
sensibile
/
1
Gentamicina (GM)
Piperacilina ( PiP)
Penicilllina (P)
10
10
12
/
/
11-16
13-16
16
16
100
14
15-16
/
17
10
10
11-14
/
14
- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un
Sensi
bile
19
righello
- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento
Antibiotico
Diametro alone di inibizione
interpretazione
Dischetto
antibiotato
Diametro
dell’alone di
inibizione
Prato o coltura
batterica
.
Giorno
2:
IDENTIFICAZIONE
MICROBICA
In campo microbiologico molto importante è l’isolamento e l’identificazione delle colture
microbiche cresciute dopo semina su terreno selettivo. Se sul terreno selettivo sono
presenti colonie ben isolate si procede con l’identificazione batterica basata su
specifici test biochimici necessari per identificare il genere e la specie batterica.
Per l’ identificazione si utilizzano dei sistemi pronti appositamente preparati che si
basano sulla capacità di fermentazione degli zuccheri e di test biochimici che
possiedono i batteri a seconda della famiglia microbica di appartenenza.
Questi sistemi di identificazione sono i SITEMI API ( esempio API STAF per Staphylococcus
o API E per enterobacteriaceae) oppure gli ENTEROTUBE , per esempio ENTEROTUBE II
utilizzato per identificare i batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriacea
cresciuti
su
terreno
selettivo
MacConkey
Agar.
Giorno
:
IDENTIFICAZIONE
MICROBICA
Materiale:
-ENTEROTUBE II : un kit formato da una provetta di plastica con 12 sezioni, ciascuna
delle quali contiene un substrato di coltura diverso. Presenta un ago metallico per
l’inoculazione che passa attraverso i vari substrati e sporge da entrambe le estremità
della
provetta;
-colture
isolate
cresciute
su
MacConkey
Agar.
PROCEDIMENTO:
-Inoculazione : con l’estremità del filo metallico che sporge si preleva una colonia ben
isolata dal terreno di coltura e si fa passare attraverso tutte le sezioni
dell’Enterotube II.
Giorno 2: Interpretazione Enterotube
istruzioni per l’impiego
1)
SVITARE ENTRAMBI I CAPPUCCI DELL’
ENTEROTUBE II.
LA PUNTA DELL’AGO DA INOCULO SI TROVA
SOTTO IL CAPPUCCIO BIANCO. PRELEVARE
UNA COLONIA BEN ISOLATA DIRETTAMENTE
CON LA PUNTA DELL’AGO.
FARE ATTENZIONE A NON PENETRARE
NELL’AGAR.
5)
INCUBARE ENTEROTUBE II. ALLA
TEMPERATURA DI + 35° / + 37°C PER 20 – 24
ORE IN POSIZIONE VERTICALE IN
PORTAPROVETTE, CON LO SCOMPARTO DEL
DESTROSIO RIVOLTO VERSO L’ALTO.
6)
2)
INOCULARE ENTEROTUBE II RUOTANDO
PRIMA L’AGO ED ESTRAENDOLO POI
CON MOVIMENTO ROTATORIO
ATTRAVERSO TUTTI GLI SCOMPARTI DEL
TUBO. REINSERIRE NELL’ENTEROTUBE
L’AGO (SENZA STERILIZZARE) FINO A
FAR CORRISPONDERE LA TACCA
ALL’APERTURA DEL TUBO. LA PUNTA
DEVE ARRIVARE FINO ALLO SCOMPARTO
DEL CITRATO.
3)
SPEZZARE L’AGO, PIEGANDOLO IN
CORRISPONDENZA DELLA TACCA. LA
PARTE DI AGO CHE RIMANE
ALL’INTERNO DELL’ENTEROTUBE II
ASSICURA, DURANTE L’INCUBAZIONE ,
UN AMBIENTE ANAEROBIO NECESSARIO
PER LA VERA FERMENTAZIONE DEL
DESTROSIO E PER LA
DECARBOSSILAZIONE DELLA LISINA E
DELL’ORNITINA E PER
L’EVIDENZIAZIONE DELLO SVILUPPO DI
GAS.
4)
CON L’AGO RIMASTO PERFORARE LA
PELLICOLA DI PLASTICA IN
CORRISPONDENZA DEGLI ULTIMI 8
SCOMPARTI ( ADONITOLO,
LATTOSIO,ARABINOSIO,SORBITOLO, VOGESPROSKAUER,DULCITOLO/FENILALANINA,UREA,CITRAT
PER CREARE UN AMBIENTE
AEROBIO. RIAVVITARE EMTRAMBI I
CAPPUCCI.
O)
DOPO INCUBAZIONE PROCEDERE CON LA
LETTURA REGISTRARE SULL’APPOSITO
FOGLIO DI IDENTIFICAZIONE LE REAZIONI
POSITIVE, TRANNE INDOLO E VOGESPROSKAUER, CONFRONTANDO IL TUBO CON
LA TABELLA DELLE REAZIONI E/O CON UN
ENTEROTUBE II NON INSEMENZATO.
GLI SCOMPARTI CHE NON PRESENTANO
VARIAZIONI CORRISPONDONO A REAZIONI
NEGATIVE.
7)
EFFETTUARE DUE TEST
1- TEST DELL’INDOLO;
2-TEST DI VOGES-PROSKAUER.
TENERE ENTEROTUBE II IN POSIZIONE
ORIZZONTALE ED AGGIUNGERE I
REAGENTI FACENDO UN FORO NELLA
PELLICOLA SUL FONDO
DELL’ENTEROTIBE . (I REAGENTI
VERRANO AGGIUNTI DIRETTAMENTE NEI
SEGUENTI SCOMPARTI:
1- NELLO SCOMPARTO H2S/INDOLO
INIETTARE 3 o 4 GOCCE DEL REAGENTE DI
KOVACS o REAGENTE DI JAMES
POSITIVO= VIRAGGIO AL ROSSO ENTRO
POCHI MINUTI;
2- NELLO SCOMPARTO DI VOGESPROSKAUER, INIETTARE 3 GOCCE DI VP
1 (SOLUZIONE DI ALFANAFTANOLO) E 2
GOCCE DI VP 2 (IDRATO DI POTASSIO).
POSITIVO =QUANDO VI NOTA UNA
VARIAZIONE DI COLORE , VIRA AL
ROSSO, DOPO
10 MINUTI.
Interpretazione Enterotube: Tabella delle reazioni
REAZIONI
SUBSTRATO
DESTROSIO O
GLUCOSIO
SVILUPPO DI GAS
OSSERVAZIONI
NEGATIVO
POSITIVO
ROSSO
GIALLO
Dalla fermentazione del substrato si ha acidificazione con variazione di
colore dell’indicatore
La cera serve per creare le condizioni di anerobiosi e aiuta la
fermentazione con sviluppo di gas.
In presenza di gas si ha il sollevamento o il distacco della cera dall’agar
delo scomparto.
CERA ADESA
CERA STACCATA
LISINA
GIALLO
VIOLA
Per decarbossilazione della lisina si forma cadaverina, composto alcalino che
provoca il viraggio dell’indicatore dal giallo al viola.
ORNITINA
GIALLO
VIOLA
Per decarbossilazione della ornitina si forma putrescina, composto alcalino
che provoca il viraggio dell’indicatore dal giallo al viola.
BEIGE
NERO-MARRONE
L’acido solfidrico reagisce con ioni ferro e forma un precipitato insolubile
nero di solfuro di ferro.
INCOLORE
ROSSO
H2S
INDOLO
La produzione dell’indolo nella decomposizione del triptofano si evidenzia dalla
colorazione rossa che assume il REAGENTE DI KOVACS aggiunto nello
scomparto dopo l’incubazione.
ADONITOLO
LATTOSIO
ROSSO
GIALLO
INCOLORE
ROSSO
VERDE
GIALLO
Durante la fermentazione dei carboidrati si formano prodotti acidi che sono
rivelati dalla variazione di colore dell’indicatore.
In presenza di colore arancio la reazione è negativa
ARABINOSIO
SORBITOLO
VOGES- PROSKAUER
DULCITOLO
Dalla fermantazione del destrosio si forma l’acetoina che viene rivelata
dall’aggiunta nello scomparto dei reagenti di Voges-Praskauer dopo
incubazione. Se entro 10 minuti si nota una colorazione rossa la reazione
è positiva.
La fermentazione del dulcitolo porta ad acidificazione con viraggio
dell’indicatore al colore giallo.
Giorno 3: Interpretazione Enterotube
InterpretazioneL’identificazione del microrganismo preso in esame si ottiene
procedendo con la determinazione di un profilo numerico.
Il profilo numerico è un codice di 5 cifre da ricercare nella lista dei profili microbici
identificati e catalogati nel l’INDICE ANALITICO. Registrazione dell’identità del
microrganismo:
Codice identificativo:
Specie microbica :
API® Yeast Identification
API 20C AUX – 48 to 72-hour identification of yeasts
