Lezione 5 - Università di Padova

UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA
MEDICINA NUCLEARE 1
Medicina Nucleare “in Vitro” o metodiche
radionuclidiche “non imaging”
Lezione 5:
Generalità sul sistema immunitario:
Introduzione alla radioimmunologia
D. Cecchin, F. Bui
Sistema immunitario ?
Il sistema immune è costituito da “quell’insieme di
molecole e cellule deputate alla risposta alla
introduzione di sostanze estranee all’organismo”
(sia di natura infettiva che non infettiva).
Primi esempi storici:
• Gli antichi cinesi avevano intuito il problema e
facevano inalare ai bambini le croste dei
sopravvissuti al vaiolo. Cio’ in qualche modo
forniva una “vaccinazione”.
• Jenner E. ed altri più tardi, nel 1798, impiegharono
per la prima volta il termine vaccinazione (da
vaccus=mucca).
Immunità Naturale Vs Acquisita
Immunità naturale o aspecifica:
• Nasce con l’individuo e non viene modificata dal
contatto con gli agenti estranei (ne fanno parte le
barriere fisiche, gli eosinofili e molte altre cellule e
molecole).
• Si divide in risposta umorale e cellulo mediata.
Immunità acquisita o specifica:
• Stimolata ed amplificata dalla esposizione a
sostanze estranee. Ne fanno parte i linfociti e gli
anticorpi che “guidano” anche parte della risposta
aspecifica
• Più lenta rispetto alla aspecifica
• Si divide in risposta umorale e cellulo mediata
Immunità Specifica: Umorale/Cell Med
Immunità umorale: mediata da molecole circolanti come gli
anticorpi che riconoscono ed aiutano ad eliminare gli antigeni.
Immunità cellulo mediata: mediata da cellule, i linfociti.
I teorici della immnunità cellulare (linfociti) ed umorale
(anticorpi) si sono scontrati per decenni fino alla moderna
teoria integrata: l’immunità umorale e cellulo-mediata sono
coordinate dalla azione di diversi tipi di linfociti:
• LINFOCITI B: Si differenziano in cellule che producono
anticorpi (più attiva verso agenti extracellulari come
microbi extracellulari e tossine)
• LINFOCITI T: Guidano la risposta cellulo mediata (più
attiva verso agenti intracellulari
dove la risposta
umorale stenta ad arrivare).
Immunità Specifica: Attiva/Passiva
Immunità attiva: Quando l’individuo si trova esposto
ad un agente estraneo, reagisce, e si “forma” le
proprie difese partendo dai linfociti B e T. Dopo
l’infezione permangono delle cellule particolari dette
di “memoria” che ricordano l’infezione in caso di
nuovo contagio.
Immunità passiva: Vengono trasferite cellule o
siero di un soggetto che ha reagito in uno che non è
stato esposto. Il secondo soggetto diviene immune
(si pensi come esempio al veleno dei serpenti).
Caratteristiche della risposta immune 1
1) Specificità: La risposta immune è specifica per i
diversi determinanti antigenici o epitopi (parti degli
antigeni). I linfociti B e T esprimono recettori specifici
di membrana che riconoscono tali epitopi.
2) Diversità: Il repertorio linfocitario ovvero il
numero dei possibili riconoscimenti antigenici è stato
stimato, nei mammiferi, in circa 109
3) Memoria: L’esposizione ad un antigene aumenta
(non crea !) la capacita’ di rispondere a
quell’antigene. Le risposte immunitarie secondarie
(quelle cioè successive alla prima) sono più rapide
ed efficaci.
Caratteristiche della risposta immune 2
4) Auto limitazione: Tutte le risposte immuni si esauriscono
da sole (o quasi…si pensi alle malattie autoimmuni) una volta
risolto il “pericolo”
5) Discriminazione del self dal non-self: la risposta distingue
antigeni estranei ed antigeni propri. In altri termini il sistema è
tollerante verso i propri antigeni ma non verso antigeni
estranei (non self). Ciò è alla base dei problemi che esistono
nei trapianti d!organo nei quali un organo è estraneo
all!individuo (per esempio un rene). Ecco perche! un individuo
trapiantato, per tutta la vita, deve assumere dei farmaci che
vengono detti immunosoppressori che servono a controllare la
risposta immune del ricevente. Purtroppo come è intuibile la
soppressione della risposta immune comporta non pochi rischi
per il ricevente (infettivi, neoplastici, reumatologici ecc)
Fasi della risposta immune
1) Riconoscimento: Si ha il legame fra antigeni e recettori
presenti sui linfociti. I linfociti B riconoscono principalmente
antigeni in fase fluida, i linfociti T sequenze peptidiche sulla
superfice delle cellule.
2) Attivazione: Proliferazione dei linfociti specifici che si
diffeenziano: i
linfociti B si differenziano in cellule che
producono anticorpi, i linfociti T in cellule che attivano i fagociti
ed in T di risposta (chiamati T-helper)
3) Fase effetrice: E! data sia dai linfociti attivati che dalle
cellule mobilizzate dai linfociti T-helper e dagli anticorpi (che
attivano il complemento che partecipa alla lisi degli agenti
estranei. Il complemento e! costituito da una serie di proteine in
grado, se attivate, di creare dei canali nella parete cellulare e di
aiutare, “essere complementari” alla risposta cellulare)
Anticorpi: Generalità
Esistono molti diversi tipi di anticorpi ognuno derivante da uno
specifico “ceppo” o clone di linfociti B, e ciascuno dotato di
una struttura specifica. Tali anticorpi, tutti diversi, si trovano
mescolati ad una miriade di altre molecole proteiche (e
risultavano perciò, nel passato, difficili da studiare !)
Quando si scoprì che un particolare tumore detto mieloma
multiplo produce un gran numero di molecole anticorpali tutte
uguali si ebbe finalmente il modo di purificarle, cristallizzarle
ed in definitiva studiarle. Distribuzione degli anticorpi: si
ritrovano, oltre che nel plasma, anche sulla superficie di molte
cellule del sistema immune e nei fluidi di secrezione (muco,
latte ecc). Se si coagula il sangue gli anticorpi “restano” in una
fase fluida detta siero. Se nel siero ci sono un gran numero di
anticorpi tutti contro uno specifico antigene quel siero viene
solitamente definito “antisiero”.
Struttura degli anticorpi
Tutti gli anticorpi hanno caratteristiche simili che spiegano
alcune comuni caratteristiche fisico-chimiche quali carica
elettrica e solubilità.
Tutti sono costituiti da:
a) Due catene pesanti (55-70 Kd)
b) Due catene leggere (24 Kd)
Ad ogni catena pesante è unita una catena leggera. Le due
catene pesanti sono unite fra loro da ponti disolfuro.
Tutte le proteine di questo tipo si ripiegano in un comune
motivo globulare (dominio immunoglobulinico) il che ha fatto
pensare che derivino da un gene comune. Si parla perciò di
superfamiglia delle immunoglobuline.
Struttura degli anticorpi
Si possono dividere le porzioni aminoterminali
(N) di un anticorpo in zone:
1)Ipervariabili: In questa zona si forma
una “tasca” costituita da parte della
catena pesante e parte della catena
leggera. La regione è molto variabile
ed è deputata al riconoscimento dei
diversi epitopi antigenici. Tali regioni
che determinano la complementarietà
fra anticorpo ed antigene sono dette
CDR (complementarity determining
regions).
2)Variabili: è una zona di minore
variabilità
caratterizzata
da
cambiamenti “minori”
3)Costanti.
La radioimmunologia
Il dosaggio radioimmunologico si basa:
1) sulla specificità della interazione anticorpale.
2) sulla sensibilità della rivelazione radiochimica.
In altre parole per dosare sostanze presenti nel sangue in
concentrazioni piccolissime, tra microgrammo ed il
picogrammo (10-6 -> 10-12), si deve usare la combinazione tra
una tecnica molto sensibile (la radiochimica, in grado di
rilevare, se presenti, tracce piccolissime di attivita!) ed una
molto specifica (l!immulologia, la reazione anticorpale che
riesce a distinguere una specifica proteina in mezzo a migliaia
di altre proteine, vitamine, enzimi, farmaci ecc.)
Due componenti:
1) Ligando (ciò che voglio misurare…)
2) Legante o recettore
Classificazione dei dosaggi di legame
Possiamo dividere i moderni dosaggi di legame in:
1) Dosaggi per valutare il legante o recettore.
2) Dosaggi per valutare il ligando.
Bisogna considerare attentamente in questi dosaggi:
1) il tipo di legante (anticorpo, proteine circolanti, recettori)
2) il tipo di tracciante (isotopo, enzima, fago, particelle
fluorescenti)
3) tipo di separazione
Nel caso della medicina nucleare in vitro il ligando è la
sostanza ignota da dosare, il legante o recettore una
sostanza con specificità per il ligando (spesso si tratta di
anticorpi) ed il tracciante un isotopo radioattivo (in genere
tecnezio o iodio).
“Capitoli” della “immunometria”
1) Dosaggi radioimmunometrici (RIA/IRMA): Si utilizzano
anticorpi marcati (come nell!IRMA) oppure antigeni marcati (come
nel RIA) per quantificare una molecola di interesse. Pur essendo
l!IRMA piu! semplice e talora più sensibile del RIA spesso non sono
disponibili gli anticorpi specifici marcati per attuare la tecnica.
2) Metodi fluoroimmulologici: Oggi molte delle tecniche di
medicina nucleare in vitro sono in competizione con i dosaggi
fluoroimmunologici che si basano sullo stesso principio citato ma,
al posto del tracciante radioattivo utilizzano un tracciante
fluorescente (fluoresceina, terre rare, ecc). Tecniche analoghe sono
quelle di chemioluminescenza che sfruttano il luminolo. Ciò ha il
notevole vantaggio che non si utilizzano sostanze radioattive.
Purtroppo però l!immunofluorimetria non ha raggiunto la specificità
possibile con i composti radioimmunologici (perche! i composti si
legano anche altrove). Per tale motivo, specie quando si debbano
dosare sostanze presenti in concentrazioni piccolissime il “gold
standard” restano le tecniche di medicina nucleare in vitro.
“Capitoli” della “immunometria”
3) Tecniche immunoenzimatiche (es: EIA): In questo caso
spesso non servono fasi di separazione: sono tecniche
omogenee (fase liquida) che utilizzano enzimi.
Se invece servono alcuni passaggi per separare i componenti
(fase liquida+solida) si parla di tecniche eterogenee: L!ELISA
(enzime linked immuno sorbent assay) è una di queste. E` un
sistema a sandwich (anticorpo+ antigene da dosare vengono
legati da un anticorpo coniugato con un enzima).
Un tipico schema di ELISA e! il seguente:
(Ab+AgDA DOSARE)
(Ab+AgDA DOSARE) + (AbENZIMA)
(Ab+AgDA DOSARE) + (AbENZIMA) + substrato dell!enzima
Dosaggi competitivi e non competitivi
I dosaggi di legame si dividono inoltre in:
1) Dosaggi
competitivi
(come
il
RIA)
dove c!e
competizione fra antigene freddo ed antigene marcato per un
certo numero (limitato) di siti anticorpali. Il recettore o legante
è un anticorpo specifico contro il ligando da misurare. Si parla
perciò di dosaggi in difetto di reattivo (di anticorpo).
2) Dosaggi non competitivi (come l!IRMA) dove il
tracciante non e! l!antigene radioattivo ma l!anticorpo
radioattivo presente in eccesso. Si parla perciò di dosaggi in
eccesso di reattivo.
Sia nei dosaggi non competitivi che in quelli competitivi il
legante e! l!anticorpo ma il tracciante nei competitivi e!
l!antigene marcato, nei non competitivi e! l!anticorpo marcato.