trasformazione genetica di cellule di mesofillo fogliare di spinacio

LABORATORIO DI BIOTECNOLOGIE VEGETALI
(Prof. Alma Balestrazzi)
TRASFORMAZIONE GENETICA DI
SPINACIO (SPINACIA OLERACEA L.)
MEDIATA DA AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
CHE COSA SONO LE PIANTE
TRANSGENICHE?
Le piante transgeniche sono prodotte con
la tecnica del DNA ricombinante
Con questa tecnica è possibile introdurre
nuovi geni che consentono alla pianta di
migliorare le proprie caratteristiche
http://mv.picse.net/pesticides/cotton/how-was-bt-cotton-produced/
Esempio di OGM vegetale (pianta transgenica)
dotato di resistenza a insetti dannosi ottenuto
mediante inserimento del gene Bt
foglie di arachide
divorate da larve
dell’insetto dannoso
foglie di arachide che
producono un
pesticida naturale
in grado di proteggerle
dalle larve
www.slideshare.net
Agrobacterium tumefaciens:
un sistema di ingegneria genetica frutto dell’evoluzione
Agrobacterium tumefaciens:
un sistema di ingegneria genetica frutto dell’evoluzione
INOCULAZIONE
ESEMPIO DI TUMORE
(GALLA)
Agrobacterium tumefaciens
GALLA
indotta in vitro
TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI
MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO
http://www.slowfood.it/
IL NOSTRO
TARGET
http://www.ortofruttabaldan.it/
CELLULE DI
MESOFILLO
FOGLIARE
http://study.com/academy/lesson/mesophyllcells-function-definition-quiz.html
MESOFILLO FOGLIARE
(TESSUTO)
http://inhabitat.com/
CLOROPLASTI
TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO
I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS)
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
1
ENZIMA DI RESTRIZIONE
DNA LIGASI
SALDATURA
TAGLIO
TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO
I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS)
2
VETTORE (PLASMIDE)
GENE DI INTERESSE
PLASMIDE
RICOMBINANTE
TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO
I NOSTRI STRUMENTI (TOOLS)
Coltura in vitro di cellule vegetali
microcallo
callo
rigenerazione
TRASFORMAZIONE GENETICA DI CELLULE DI MESOFILLO FOGLIARE DI SPINACIO
PLASMIDE
RICOMBINANTE
GIA’ PREDISPOSTO
RISULTATO
???
ESERCITAZIONE
trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens
STEP 1: STERILIZZAZIONE TESSUTO FOGLIARE
•
•
•
trasferire foglie in contenitore sterile (tipo Magenta)
forte agente sterilizzante,
versare 200 ml di Etanolo al 70%
estremamente fitotossico
incubare per 3 min a temperatura ambiente
•
al termine eliminare l’etanolo e versare 200 ml di soluzione contenente
ipoclorito di sodio: efficace
teepol (0.04%) e ipoclorito di sodio (10%)
incubare per 15-20 min a temperatura ambiente per sterilizzazione di
•
•
superficie - teepol: detergente
universale, rimuove particelle
estranee
al termine eliminare la soluzione ed effettuare 3-4 lavaggi con dH2O sterile
per eliminare ogni residuo di agente sterilizzante.
STEP 2: preparazione degli espianti (leaf discs) e co-coltivazione
con il ceppo ingegnerizzato di Agrobacterium tumefaciens
• Tutte le operazioni devono essere effettuate con estrema cura per
non danneggiare il tessuto fogliare
• Prelevare una foglia sterilizzata con la pinzetta e trasferirla in una
piastra Petri
• Con l’aiuto di un bisturi excidere porzioni di tessuto di forma
quadrata (1 cm x 1 cm, approssimativamente) (espianti o dischetti
fogliari) e
• trasferire gli espianti in una piatra Petri contenente la sospensione di
cellule di Agrobacterium tumefaciens (ceppo ingegnerizzato con il
gene nptII) e incubare per 10-20 min
• al termine asciugare bene gli espianti su carta bibula sterile per
eliminare l’eccesso di sospensione batterica
• trasferire gli espianti su piastre NUTRICI, incubare per 10-20 min
CHE COSA SONO LE PIASTRE NUTRICI?
• le cellule del tessuto fogliare sono state sottoposte a stress meccanico
durante la preparazione degli espianti e sono state poi esposte
all’inoculazione con Agrobacterium tumefaciens
•
•
•
per favorire la ripresa della proliferazione, gli espianti sono trasferiti su
piastre nutrici costituite da terreno mescolato con cellule vegetali in
sospensione
le colture cellulari in attiva proliferazione riversano nel mezzo composti
che stimolano la riattivazione del ciclo cellulare
cellule vegetali in proliferazione inglobate in terreno a formare le piastre
nutrici forniscono questo supporto agli espianti di spinacio
CHE COSA SONO LE PIASTRE NUTRICI?
TERRENO MS
cellule in sospensione di pioppo
(Populus spp.)
PIASTRA NUTRICE
(recovery)
STEP 3: gli espianti co-coltivati sono trasferiti su terreno selettivo
•
gli espianti sono infine trasferiti su piastre Petri contenenti un substrato
nutritivo (TERRENO MS) costituito da sali (macronutrienti, micronutrienti) e
vitamine (es, piridossina, tiamina), saccarosio (fonte di carbonio organico)
• il terreno contiene l’antibiotico kanamicina come agente selettivo – questo
antibiotico è citotossico e uccide le cellule vegetali che non sono state
trasformate da Agrobacterium tumefaciens
•
le cellule che sono state trasformate (frequenza di trasformazione = 1 cellula
ogni 106) esprimono il gene nptII che codifica per l’enzima neomicina
fosfotransferasi in grado di detossificare la molecola di kanamicina
• gli espianti sono mantenuti a 24-25°C per 4-5 settimane in attesa di
verificare la comparsa di calli e/o tessuto da cui sarà possibile rigenerare in
vitro la pianta geneticamente modificata