DIAGNOSTICA
ULTRASTRUTTURALE
Giovanna Finzi
Istologia e Anatomia Patologica Ospedale di Circolo
Varese
DIAGNOSI DELLE
GLOMERULONEFRITI
Clinica
Microscopia
Ottica
DIAGNOSI
Microscopia
Elettronica
Immunofluorescenza
IL GLOMERULO RENALE
PODOCITI
MEMBRANA BASALE
GLOMERULARE
CELLULE
ENDOTELIALI
CELLULE E MATRICE
MESANGIALE
QUANDO E’ RICHIESTA LA
MICROSCOPIA ELETTRONICA?
Quando c’è il sospetto di: minimal change
disease, sindrome di Alport,
Alport, malattia
membrane sottili,
sottili, glomerulopatia fibrillare,
fibrillare,
glomerulonefrite membranosa,
glomerulonefrite membranomembrano-proliferativa,
glomerulonefrite postinfettiva, glomerulopatia
da rigetto cronico di trapianto,…
Quando in microscopia ottica il quadro è
apparentemente normale, non corrispondente
alla clinica o difficile da interpretare
Nel dubbio di malattie concomitanti
IN LETTERATURA E’
RIPORTATO CHE :
Stirling, Curry and Eyden:
Diagnostic electron
microscopy, RMS-Wiley, 2013
SE VIENE CHIESTA LA M.E. (NEL
30% DEI CASI CIRCA), LA BIOPSIA
RENALE VIENE COSI’DIVISA:
UNA PARTE (50%) FISSATA IN FORMALINA PER LA
MICROSCOPIA OTTICA
UNA PARTE (30%) A FRESCO CHE VIENE SUBITO
CONGELATA PER L’IMMUNOFLUORESCENZA
UNA PARTE (20%) FISSATA IN LIQUIDO DI
KARNOVSKY (FORMALDEIDE+GLUTARALDEIDE) PER LA
MICROSCOPIA ELETTRONICA
IMPORTANTE CHE LA FISSAZIONE SIA TEMPESTIVA E
CHE IL MATERIALE SIA ADEGUATO (CORTICALE
(CORTICALE)) IN
TUTTE E 3 LE BIOPSIE
AL MICROSCOPIO ELETTRONICO NELLA MAGGIOR PARTE
DEI CASI SERVE L’ANALISI DEI GLOMERULI!!!
…E SE NON ARRIVA LA
BIOPSIA PER M.E., MA A
POSTERIORI CI SI RENDE
CONTO CHE SERVE?
recuperare del materiale da una parte della
biopsia in paraffina
recuperare la biopsia congelata
recuperare la sezione dal vetrino
RECUPERO DA PARAFFINA
RECUPERO DA PARAFFINA
FUSIONE PEDICELLI
(MINIMAL CHANGE DISEASE)
DEPOSITI SOTTOEPITELIALI
(GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA)
RECUPERO DA TESSUTO
CONGELATO
RECUPERO DA TESSUTO
CONGELATO
DEPOSITI SOTTOENDOTELIALI
DEPOSITI SOTTOEPITELIALI
(GLOMERULONEFRITE
MEMBRANOPROLIFERATIVA)
(GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA)
Recupero per esame ultrastrutturale
di sezioni istologica su vetrino
Materiale di partenza:
sezioni >/= 5 micron di spessore, su vetrini NON POLARIZZATI
colorate in EE, montante acrilico per istologia
METODO
Distacco copricopri-oggetto in xilolo
Reidratazione
Osmificazione
Deidratazione
Infiltrazione
Inclusione
Distacco delle piramidi in azoto liquido
Tosoni A. Zini E. Barbiano di Belgiojoso G. Nebuloni M.
Anatomia Patologica OspedaleOspedale-Polo Universitario “Luigi Sacco”
Milano
OSSERVAZIONE AL M.E.:
Occorre valutare 11-3 glomeruli, non sclerotici.
Occorre effettuare l’osservazione prima a
piccolo ingrandimento (1000X), poi scendere
nel dettaglio (generalmente fino a 20000X, o
oltre), con documentazione fotografica con cui
discutere col patologo e col nefrologo.
Se alla fine il quadro ultrastrutturale non
corrisponde a quello della microscopia ottica o
alla clinica, occorre riprendere in
considerazione tutti gli aspetti.
COSA GUARDARE AL M.E.
– Presenza, localizzazione e caratterizzazione di
eventuali depositi nella membrana basale
glomerulare (GBM) o nel mesangio.
– Variazioni di spessore e struttura della GBM.
– Modificazioni delle componenti cellulare e
stromale del mesangio
– Alterazioni caratteristiche delle cellule del
glomerulo (fusione dei pedicelli, presenza di
TRI,…)
DEPOSITI
Depositi sottoepiteliali
(glomerulonefrite postpost-infettiva)
Depositi sottoendoteliali
(nefrite da Lupus)
Depositi intramembranosi
(glomerulonefrite membranoproliferativa di tipo II)
Depositi mesangiali
(nefropatia da depositi di IgA)
DEPOSITI STRUTTURATI
AMILOIDOSI RENALE
(DIAM 10 NM)
CRIOGLOBULINEMIA (DIAM 20-30
NM)
GLOMERULONEFRITE FIBRILLARE
(DIAM 20 NM)
GLOMERULONEFRITE
IMMUNOTACTOIDE (DIAM 50 NM, con
core chiaro)
ALTERAZIONI DELLA MEMBRANA
BASALE GLOMERULARE
Sindrome Alport
Normale
Glomerulopatia da membrane sottili
ALTERAZIONI CARATTERISTICHE
DI ALCUNE CELLULE
Inclusi tubulo-reticolari nelle
cellule endoteliali (Lupus)
Fusione dei pedicelli dei
podociti (glomerulonefrite da
lesioni minime)
CASO 1
Clinica: ♀29 anni. Macroematuria
I.F.D. Si osservano 4 glomeruli. Positività segmentaria e
focale di IgM (1+), IgA (1+), C3 (2+) e fibrinogeno (2+)
mesangiale. Non si osservano depositi di C1q e IgG.
M.O. Frustolo renale della lunghezza di mm 6 con
conservazione sub-ottimale. Sono presenti
complessivamente 6 glomeruli con minima tendenza alla
lobulazione con focale riduzione del calibro delle anse.
Lievi segni sofferenziali a carico degli epiteli tubulari. Non
salienti alterazioni a carico dei vasi e dell'interstizio.
C3
IgA
IgG
ESAME ULTRASTRUTTURALE. L’esame ultrastrutturale
di due glomeruli mostra un diffuso assottigliamento delle
membrane basali (spessore medio 220 nm), che appaiono
di tessitura regolare, seppur con alcuni aspetti di lieve
sclerosi, specialmente nelle regioni paramesangiali. Non si
osservano depositi elettrondensi nella membrana basale
né nel mesangio.
Il quadro morfologico ed ultrastrutturale complessivamente
suggeriscono di considerare tra le altre possibilità anche
una glomerulopatia da membrane sottili.
CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA
PERMESSO DI EVIDENZIARE LESIONI NON
EVIDENZIABILI CON LA MICROSCOPIA OTTICA
CASO 2
Clinica: ♂ 51 anni. Sindrome nefrosica,
nefrosica, proteinuria,
grave ipoalbuminemia.
COLORAZIONE ARGENTICA (JONES)
M.E:
CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA
HA MODIFICATO LA STADIAZIONE DELLA
GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA (DA STADIO II
A STADIO III)
CASO 3
Clinica:
Clinica: ♂ 43 anni. Diabete mellito da 6 anni, proteinuria nefrosica ed
insufficienza renale.
I.F.D.: Sono presenti 5 glomeruli. Positività focale e segmentaria (2+)
per IgM e IgA lungo le anse periferiche e il mesangio; C3 (1+)
mesangiale. Negatività per IgG, C1q e Fibrinogeno.
M.O.: 19 glomeruli 4 dei quali mostrano marcata scleroialinosi. I
restanti glomeruli mostrano glomerulosclerosi diffusa moderata e
focalmente severa con espansione mesangiale e diffuso aumento della
matrice; in 9 glomeruli presenza di noduli mesangiali multipli
prevalentemente ipocellulati; ispessimento della parete delle anse
capillari, rari microaneurismi e singola "goccia capsulare".Sclerosi
capsulare e pericapsulare. Tubuli con alterazioni regressive epiteliali;
marcato ispessimento delle membrane basali. Sclerosi interstiziale.
Arteriolosclerosi di grado discreto.
Quadro compatibile con glomeruloscleosi diabetica diffusa e nodulare
di grado moderato.
PAS
C3
IgA
IgM
M
M
M.E:
L'esame ultrastrutturale di due glomeruli evidenzia varie alterazioni
riferibili a glomerulosclerosi diabetica:
- diffuso ispessimento della membrana basale glomerulare, con zonale
fusione dei pedicelli
- aumento del mesangio, in particolare della componente amorfa
- presenza di materiale elettrodenso tra la membrana basale
glomerulare e le cellule endoteliali (ialinosi).
In alcuni tratti della membrana basale glomerulare si osservano inoltre
depositi elettrondensi sottoepiteliali e intramembranosi.
CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA
EVIDENZIATO, OLTRE AL QUADRO DI GLOMERULOPATIA
DIABETICA, ASPETTI DI GLOMERULONEFRITE MEMBRANOSA
CASO 4
Clinica: ♂ 87 anni. Sindrome nefrosica
nefrosica,,
proteinuria.
COLORAZIONE ARGENTICA (JONES)
M.E:
CONCLUSIONE: LA MICROSCOPIA ELETTRONICA HA
CONFERMATO LA SOVRAPPOSIZIONE DI GLOMERULOSCLEROSI
FOCALE SEGMENTALE A UN QUADRO DI GLOMERULONEFRITE
MEMBRANOSA
CONCLUSIONI
La microscopia elettronica è
fondamentale per diagnosticare
alcune glomerulonefriti
In altri casi la microscopia
elettronica può completare o
correggere la diagnosi fatta al
microscopio ottico
