C.d.L.
Scienze Biosanitarie e
Farmaceutiche
Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei
Microrganismi
AA 2007 2008
VIROLOGIA
Università degli Studi di Bari - Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche 2007 2008
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1888-1892 Studi sull’afta epizootica e sul mosaico del tabacco (Ivanovsky e
Beijerink) dimostrano che queste malattie erano causate da subunità
microscopiche che non potevano essere osservate e coltivate come batteri e
funghi.
Risolutivo fu lo studio sul mosaico del tabacco, si dimostrò che esistevano
subunità microscopiche che attraversavano i filtri per batteriologia è quindi
presenti in una soluzione capace di infettare un’altra pianta di tabacco.
1911 ROUS SCOPRE IL VIRUS DEL TUMORE DEI POLLI.
1915 SCOPERTA DEI BATTERIOFAGI E RAPPORTI TRA CELLULA OSPITE E
BATTERIOFAGO.
1920 COLTURE CELLULARI VIVENTI IMPIEGATE NELLO STUDIO DELLE
INFEZIONI VIRALI DELL’UOMO.
1939 IMPIEGO DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA.
1952 AC. NUCLEICI E INFEZIONE VIRALE (HERSHEY E CHASE).
1970 DIMOSTRAZIONE DELL’ESISTENZA DI UN ENZIMA VIRALE CHE
IMPIEGA STAMPI DI RNA PER
SINTETIZZARE DNA, LA TRASCRITTASI
INVERSA. NEGLI ULTIMI 30 ANNI MESSA A PUNTO DI VACCINI ANTIVIRALI E
IMPIEGO DEI VIRUS NELLE BIOTECNOLOGIE E NELLA CURA DELLE
MALATTIE.
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I virus sono specie specifici esistono virus animali, vegetali e dei batteri
I virus sono agenti patogeni entità acellulari formati da una o più molecole di DNA
o RNA racchiuse in un involucro proteico in grado di infettare cellule animali e
vegetali e batteri.
Le particelle virali complete sono contraddistinte da dimensioni molto modeste (da
10 a 300 nm).
Si possono replicare all’interno di cellule viventi e quindi sono dei parassiti
intracellulari obbligati
La morfologia dei i virus può essere studiata attraverso l’uso del microscopio
elettronico
La replicazione dei virus avviene nell’organismo di animali suscettibili
all’infezione, e sperimentalmente, per inoculazione in animali da laboratorio in
uova embrionate di pollo o in colture cellulari
I costituenti essenziali sono ac. nucleici e proteine.
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core : ac. nucleico + molecola di natura proteica che determina la stabilità dell’acido.
capside : struttura proteica che racchiude l’ac. nucleico o il core.
capsomero: unità proteica che ripetuta forma il capside non sono legati da legami
covalenti.
nucleocapside: ac. nucleico + capside.
envelope: involucro lipoglicoproteico esterno (ortho- e paramyxo- virus)
peplomeri: (neuroamminidasi ed emoagglutinina): proiezioni superficiali che
protrudono dall’envelope. le emoagglutinine sono strutture a bastoncino con attività
emoagglutinante mentre le neuroamminidasi hanno attività enzimatica.
virione: particella virale completa come si può osservare fuori dalla cellula.
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In tutti i virus è
presente un
nucleocapside
costituito da un ac.
Nucleico avvolto da un
capside proteico con
struttura elicoidale,
complessa,
icosaedrica.
La struttura virale è formata da
subunità uguali che vengono
ripetute (nei virus a forma
icosaedrica) infatti è più
efficiente costruire strutture
complesse e più grandi a partire
da subunità tutte uguali e più
piccole.
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Batteriofago: virus in grado di
parassitare i batteri
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batteriofago
I genomi virali sono più differenziati ed eterogenei di quelli
procariotici ed eucariotici e possono consistere in uno o
due filamenti di DNA o RNA, i filamenti di ac. nucleico
sono lineari, circolari o tali da assumere entrambe le
forme.
I virus sono classificati in base alle caratteristiche degli ac.
Nucleici alla simmetria del capside, all’eventuale
presenza di un involucro, al tipo di ospite infettato, alle
patologie provocate, in caso di virus animali e vegetali.
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Acidi nucleici e proteine sono i componenti principali della struttura virale.
La tecnica che permette la purificazione dei virus è la ultracentrifugazione in
gradiente di densità, questa tecnica permette la separazione di particelle fagiche
che sono differenti anche per percentuali dell’ 1% di DNA.
Le proteine virali possono essere suddivise in tre classi:
a)
proteine che permettono all’ acido nucleico di replicarsi.
proteine strutturali, che sono costituenti del capside o sono emoagglutinine o
neuroamminidasi.
proteine che alterano alcune funzioni e strutture della cellula ospite, bloccano ad esempio la
trascrizione del DNA cellulare e lasciando così i ribosomi a disposizione dell’ RNA virale..
b)
c)
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Il capside è formato da subunità proteiche che in alcuni virus si aggregano a formare i capsomeri, con peso
molecolare tra 10 e 80 KDA (1 Dalton= 1/6 della massa atomica dell’ossigeno 1,66x10-24g ).
Non sempre tutte le proteine che si trovano nel virus entrano nella formazione del capside a volte esse sono
devolute a funzioni di stabilizzazione dell’acido nucleico si tratta delle cosiddette proteine interne in stretta
relazione con l’acido nucleico.
I virus posseggono una molecola di DNA il cui peso molecolare è 1,5 a 240 x 106 daltons (poxvirus), di solito si
tratta di un doppio filamento in genere lineare.
Per l’RNA virale quasi sempre si tratta di un filamento a catena singola con peso molecolare da 2,4 a 10-12 x
106 daltons. Non sempre è presente in un’ unica molecola ma viene spesso estratto in frammenti.
Nei virioni sono presenti altri costituenti che contengono elevate quantità di lipidi. Questi lipidi sono identici a
quelli della cellula dove il virus si è replicato.
La quantità di materiale genetico presente è in diretta relazione con il grado di complessità della particella
virale.
In alcune specie sono presenti rame, biotina, Fad (ruolo funzionale sconosciuto).
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La struttura virale è formata da subunità uguali che vengono ripetute (nei virus a
forma icosaedrica) infatti è più efficiente costruire strutture complesse e più grandi
a partire da subunità tutte uguali e più piccole.
vengono codificati solo pochi peptidi o anche uno solo.
non viene richiesta informazione supplementare per
l’assemblaggio delle subunità virali.
un meccanismo di rigetto è attivo per le subunità non
funzionanti.
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Adsorbimento: interazione tra strutture superficiali del
virione e le strutture della cellula.
Penetrazione (periodo di eclissi) e svestimento.
Replicazione (diversi tipi di replicazione).
Maturazione (aggregazione spontanea del materiale
genetico con le componenti).
Liberazione (periodo di latenza)
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GEMMAZIONE
PROTEINE DELLA MATRICE
E PEPLOMERI
GEMMAZIONE
ATTRAVERSO APPARATO
DEL GOLGI E IL RER
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Il meccanismo di adsorbimento è
interamente devoluto al
riconoscimento di siti specifici, da
parte delle fibre che si distendono
ed ancorano il fago al batterio, in
un secondo momento gli aculei
portano a contatto la piastra
basale con la parete batterica, la
guaina si contrae e forza la coda
a penetrare, l’azione della coda è
facilitata dalla presenza di un
enzima (lisozima) infine il DNA
fagico penetra attraverso il
canale. (Batteriofago).
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Rappresentazione schematica del
ciclo replicativo di un virus a DNA
doppio filamento.
Virus animali
RAPPRESENTAZIONE
SCHEMATICA DEI CICLI
REPLICATIVI (assenza
di integrazione nel DNA
della cellula ospite)
Rappresentazione schematica del
ciclo replicativo di un virus a RNA
singolo filamento. (Il filamento viene
replicato per intervento di un filamento
complementare e dà così origine ai genomi
della progenie virale e nel contempo funge
anche da RNA messaggero per la sintesi del
capside virale. Le proteine dell’envelope si
localizzano sulla membrana citoplasmatica
della cellula infetta nei siti da cui usciranno
le particelle virali che utilizzeranno la
membrana modificata come envelope).
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Integrazione nel DNA della
cellula ospite
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È indispensabile separare i virus dalle cellule e dai loro costituenti per
poterle studiare soprattutto se il loro ciclo non si conclude con la lisi
Centrifugazione differenziale e in gradiente di densità (basata
sull’impiego di un gradiente di saccarosio con raccolta delle particelle
virali)
Precipitazione dei virus con solfato d’ammonio concentrato e raccolta
mediante centrifugazione.
Denaturazione dei contaminanti con calore o pH. (tollerato dai virus).
Digestione enzimatica delle componenti cellulari che non agiscono nei
confronti delle particelle virali.
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Nel caso di preparazioni virali molto concentrate
ultracentrifugazione in gradiente di densità
Soluzioni di saccarosio o glicerolo a concentrazione decrescente.,
in modo che la densità sia distribuita in un gradiente continuo. Le
particelle virali si raccolgono in una zona di densità
corrispondente.
ELETTROFORESI:
Indicazione su volume forma dimensioni per mezzo delle
caratteristiche superficiali del virus, in quanto i virus come l e
proteine sono anfoteri hanno cioè carica elettrica che è funzione
del pH del mezzo.
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I virus non possono essere coltivati all’esterno di cellule viventi, per molto tempo la loro
coltivazione è stata fatta su uova embrionate di pollo o in animale.
Attualmente i virus vengono coltivati su monostrati cellulari associati con antibiotici che ne
evitano la contaminazione.
Nelle colture su monostrato cellulare compaiono aree di lisi definite placche che possono
essere anche colorate.
A volte non si ottengono regioni di lisi ma zone dove compaiono effetti citopatici ( a volte non
accompagnati da placche).
I batteriofagi vengono coltivati impiegando i batteri come coltura.
Una coltura batterica torbida a contatto con il fago diventa limpida in conseguenza dell’attività
litica
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Isolamento e crescita del virus
Esame citologico valutazioni delle inclusioni citoplasmatiche
Microscopia elettronica, ricerca delle particelle virali (osservazione al microscopio elettronico)
Rivelazione di proteine virali
Rivelazione di materiale genetico virale
Ricerca di acidi nucleici virali
Ibridazione in situ
Dot blot, Southern blot, Northern blot
PCR, rt - PCR, pcr quantitativa, Nasba, Branched Dna, PCR in situ)
Sierologia
Diagnosi sierologica consiste nella ricerca di anticorpi virali nel siero del paziente. Si avvale di diversi test
mediante rivelazione di IgM specifiche, con aumento di quattro volte del titolo anticorpale tra i sieri della fase
acuta e della convalescenza inoltre si ottengono profili di anticorpi specifici indicativi di recente infezione.
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Tecniche istopatologiche: si impiega solo il microscopio ottico e tecniche di
fissazione o colorazione delle cellule dei tessuti in maniera simile a quelle usate
per le osservazioni di patologia cellulare. Due esempi importanti la diagnosi della
rabbia mettendo in evidenza i corpi del Negri nelle cellule dell’ ippocampo, e la
valutazione dei corpi del Guarnieri per le infezioni da vaiolo.
Ricerca di antigeni virali : si utilizzano sieri policlonali o anticorpi monoclonali
specifici per proteine del virus. Possono essere condotti su liquidi biologici, siero o
liquor cefalo rachidiano, ma anche su cellule o tessuti.
Ricerca di proteine virali e acidi nucleici virali : diversi metodi possono essere
impiegati, tra cui anche l’elettroforesi per separare componenti proteiche dei virus.
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Microscopia elettronica : è una tecnica molto utile nella
individuazione di virus non ancora noti o per identificare
particelle virali nei tessuti o in colture cellulari provenienti da
materiale con sospetta infezione virale.
È molto valida nella ricerca, ma meno nella pratica quotidiana
dove morfologia e dimensione non svelano la vera identità di un
virus, pertanto è un metodo poco specifico.
A questa tecnica si può applicare l’ immuno microscopia
elettronica ma i limiti pur migliorando il metodo rimangono e
anche i costi che sono molto elevati. I limiti sono quelli della
ricerca di antigeni virali.
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I virus non possono essere coltivati all’esterno di cellule viventi, per molto
tempo la loro coltivazione è stata fatta su uova embrionate di pollo o in
animale. Attualmente i virus vengono coltivati su monostrati cellulari
associati con antibiotici che ne evitano la contaminazione.
Nelle colture su monostrato cellulare compaiono aree di lisi definite
placche che possono essere anche colorate. A volte non si ottengono regioni
di lisi ma zone dove compaiono effetti citopatici ( a volte non accompagnati
da placche).
I batteriofagi vengono coltivati impiegando i batteri come coltura. Una
coltura batterica torbida a contatto con il fago diventa limpida in
conseguenza dell’attività litica
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La coltivazione dei virus può avvenire mediante uso di:
Animali da esperimento.
Uova embrionate, soprattutto di pollo.
Colture cellulari in vitro.
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L’uso degli animali per la coltivazione dei virus è condizionato dal fatto che
gli animali considerati siano indenni da malattie infettive di varia natura e
siano mantenuti con cura in isolamento prima delle prove.
In genere un ruolo speciale è riservato all’utilizzo del topo per la facilità di
riproduzione e la sensibilità nei confronti di virus animali e umani, in
genere è l’ animale giovane così come per l’ embrione di pollo la maggiore
sensibilità non avendo questo un sistema immunitario maturo.
Si usano per la identificazione del virus della rabbia, che determina la
comparsa di inclusioni cellulari, virus coxhsackie A herpes virus
poliomavirus e reovirus, ognuna di queste specie è in grado di provocare
una particolare forma di malattia.
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Le uova fertilizzate di pollo possono essere utilizzate (Rous e Murphy 1908) per la
coltura dei virus, nel 1930 furono fatti esperimenti mediante inoculazione del virus del
vaiolo sulla membrana corion allantoidea.
Ha sempre rappresentato sino all’introduzione delle colture cellulari il mezzo più diffuso
per la praticità e i costi contenuti. Attualmente è ancora utilizzato a scopo diagnostico
(isolamento del virus da materiale patologico, titolazione del virus e dei sieri antivirus)
sia per ottenere grandi quantitativi di virus.
Le uova possono essere inoculate con diversi metodi in relazione ai virus che si vogliono
studiare.
Tecniche di inoculazione : le uova utilizzate devono essere SPF Specific Pathogen Free.
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Isolamento del
virus in uova
embrionate
L’uso delle uova embrionate di
pollo ha rappresentato un
metodo adottato grandemente in
passato per lo studio dei virus
attualmente il mezzo
fondamentale per l’isolamento e
la propagazione e
l’identificazione dei virus animali,
è il monostrato cellulare .
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Rappresentano il mezzo più importante per isolamento propagazione e identificazione dei
virus animali, hanno consentito di condurre indagini del ciclo replicativo e delle caratteristiche
geniche, e di interpretare l’ oncogenesi virale. Su questo substrato vengono allestiti alcuni dei
vaccini virali (polio, rabbia, rosolia, morbillo).
Per colture di tessuto si intendono cellule, tessuti ed organi provenienti da animali e mantenuti
o fatti sviluppare in vitro per oltre 24 ore. Le colture di tessuto o organo si riferiscono ad
espianti di tessuto o a frammenti d’organo le cui cellule sono rimaste aggregate e hanno
conservato i caratteri tipici che avevano in relazione alla loro morfologia e struttura.
Le colture di cellule sono ottenute da sospensioni cellulari allestite disgregando
meccanicamente e chimicamente i tessuti dopo la crescita tali cellule assumono un aspetto
fibroblastico ed epitelioide e non presentano tracce della primitiva organizzazione.
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Nelle colture cellulari infette i segni
della moltiplicazione virale possono
essere svelati con le procedure più
diverse. Per molti agenti virali, si
procede all’esame microscopico
diretto delle colture infette. La
replicazione virale può indurre dei
cambiamenti morfologici evidenti delle
colture cellulari. Si parla di effetti
citopatici, il tipo e la rapidità dello
sviluppo sono di grande aiuto per
identificare i virus.
Le colture cellulari
rappresentano attualmente il
mezzo fondamentale per
l’isolamento e la propagazione e
l’identificazione dei virus animali,
con l’uso di metodi appropriati
hanno consentito di condurre
indagini sul ciclo replicativo e
sulle caratteristiche genetiche
dei diversi virus.
L’effetto citopatico più imponente è senza
dubbio al lisi cellulare: un esempio è dato
dagli enterovirus che producono dopo poche
ore dall’infezione i cambiamenti morfologici
della coltura. Dopo 12 24 ore le colture cellulari
vengono
distrutte completamente.
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