NUTRIZIONE BATTERICA: approvigionamento di sostanze nutritizie

NUTRIZIONE BATTERICA:
approvigionamento di sostanze nutritizie per la
crescita di un microrganismo
Tutti gli organismi viventi per poter crescere devono trarre
dall’ambiente le SOSTANZE NUTRITIZIE di cui hanno bisogno
per il loro METABOLISMO
METABOLISMO
ENERGETICO
o catabolismo
ELEMENTI
NUTRITIZI
METABOLISMO
BIOSINTETICO
o anabolismo
Avviati nei processi
DEMOLITIVI
PRODUZIONE DI
ENERGIA (ATP)
Attività cellulari
Trasporto di membrana
Movimento ecc.
Avviati nei processi di
SINTESI
La cellula costruisce o
“restaura” le proprie
strutture
Dott.
Dott. Esin TPALL 2009
TRE PRINCIPALI MECCANISMI DI PRODUZIONE DI
ENERGIA NEI BATTERI
1) FERMENTAZIONE
Processo di produzione di energia che non comporta una completa demolizione
del substrato.
Avviene in assenza di O2
Substrati fermentabili: zuccheri, amino acidi, acidi organici
E’ UN PROCESSO VELOCE, MA POCO EFFICIENTE: a parità di molecole di
substrato si produce meno ATP
2) RESPIRAZIONE
Completa demolizione del substrato ad H2O ed CO2
Maggiore produzione di energia
RESPIRAZIONE AEROBIA: AVVIENE IN PRESENZA DI O2 (Accettore finale
di e-)
RESP. ANAEROBIA: l’accettore finale di e- è un composto inorganico quale
nitrito, carbonato, solfato.
solfato
3) FOTOSINTESI
SOSTANZE NUTRITIZIE
-MACROELEMENTI (sostanze nutritive necessarie in notevole quantità)
H2O: Rappresenta l’80-90% del peso totale della cellula ed è perciò sempre
l’elemento nutritizio fondamentale.
Fonte di carbonio (C): È utilizzata per:
-sintesi dei composti organici
-produzione di energia
A seconda di quale forma di Carbonio utilizzano, i microrganismi si distinguono in:
- autotrofi (CO2; carbonio inorganico)
- eterotrofi (zuccheri, amido: carbonio organico)
Fonte di azoto (N): È il costituente principale delle proteine
(10% del peso secco dei batteri)
Capacità di utilizzare varie forme di azoto
- N atmosferico (pochi batteri)
- N inorganico (sali di ammonio, NO3, NO2 ecc.)
- N organico (a.a., peptoni, urea)
O2: Esigenza e tolleranza molto diverse tra i batteri.
Fosforo (P): Componente di acidi nucleici (DNA, RNA), fosfolipidi.
Zolfo (S): Componente di alcuni aminoacidi (cisteina, metionina).
Altri elementi: K, Mg, Ca, Na.
Fattori di crescità organici: Composti di cui il batterio ha assoluta necessità per il
proprio accrescimento, ma che non è capace di sintetizzare. Devono essere forniti al
batterio preformati. Le esigenze di fattori di crescita variano da batterio a batterio.
-Amino acidi -Vitamine -Alcune purine o pirimidine
-MICROELEMENTI (sostanze nutritive necessarie in piccole quantità)
Mn, Cu, Zn, Fe
EFFETTO DELL’OSSIGENO SULLA CRESCITA DEI BATTERI:
esigenze e tolleranze molto diverse
1) ANAEROBI:
non sono dotati di una catena di trasporto degli
elettroni (e-) e non possono utilizzare l’O2 come
accettore finale di elettroni
ANAEROBI TOLLERANTI (FACOLTATIVI):
La loro crescita non è migliore in presenza di O2. Tollerano
l’O2, ma anche in presenza di aria producono energia tramite
la
fermentazione.
(Es.
Batteri
dell’acido
lattico
(Streptococchi, Stafilococchi);
ANAEROBI OBBLIGATI o STRETTI
O2 dannoso o fatale. Inibiti da tensioni di O2 10-2 atmosfera.
Fermentano. (Es. Clostridi).
2) AEROBI:
AEROBI STRETTI:
L’O2 è indispensabile per la loro crescita e funge da accettore
finale di e-. Capaci solo di RESPIRAZIONE AEROBIA (Es.
micobatteri)
AEROBI FACOLTATIVI:
O2 non indispensabile, ma facilita la crescita. Sono i più
versatili; cambiano il prprio metabolismo a seconda della
presenza o meno di aria. (Es. Enterobacteriaceae)
MICROAEROFILI
O2 richiesto, ma in concentrazione inferiore a quella
atmosferica. Respirano. CO2 al 5-10% facilita la loro crescita.
(Es. Campylobacter)
COLTIVAZIONE DEI BATTERI
COLTIVAZIONE DEI BATTERI:
BATTERI processo mediante il quale si cerca di
ottenere la riproduzione dei microrganismi in un ambiente artificiale
fornendo loro le sostanze nutritizie necessarie e adatte condizioni
ambientali:
- Temperatura
- Acidità (pH)
- Pressione osmotica
- Luce ecc.
TERRENI DI COLTURA:
COLTURA mezzi artificiali contenenti tutti gli elementi
nutritizi necessari per coltivare i batteri.
La coltivazione dei batteri ci permette di:
- studiarne le caratteristiche biologiche
- isolarli ed identificarli da un campione biologico a scopo diagnostico
..(microbiologia medica)
PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA
- Pesata dei vari costituenti
- Dissoluzione in H2O
- Sterilizzazione (in autoclave o tramite filtrazione)
SUDDIVISIONE DEI TERRENI DI COLTURA PER BATTERI
A) In base allo stato fisico
1) TERRENI LIQUIDI
2) TERRENI SOLIDI
B) In base alla composizione chimica
1) TERRENI MINIMI: contengono
in composizione nota solo sali
inorganici;
2) TERRENI SINTETICI:
C) In base alla funzione
1) TERRENI SELETTIVI
2)TERRENI
DISCRIMINATIVI
3) TERRENI (COLTURE)
DI ARRICCHIMENTO
contengono in composizione nota sia
composti organici che inorganici;
3) TERRENI COMPLESSI
(RICCHI): ricchi di substrati
organici di cui non tutti i componenti
sono noti (estratto di lievito, di
organo). Usati per l’isolamento di
germi esigenti
A) In base allo stato fisico
1) TERRENI LIQUIDI
Sono di consistenza liquida
Sono limpidi, se sterili; evidenziano la
crescita
batterica
tramite
intorbidimento
ES: BRODO NUTRIENTE, infuso di
cuore e cervello (terreno molto ricco)
Impiego:
Studiare in vitro la crescita batterica;
Favorire la crescita dei batteri in un
campione clinico (arricchimento)
2) TERRENI SOLIDI
La consistenza solida è ottenuta tramite l’aggiunta di AGAR (polisaccaride,
inerte estratto da alghe marine; 70%agarosio, 30% agaropectina)
ES: AGAR SANGUE, AGAR SALE MANNITE, AGAR McCONKEY ecc.
Impiego:
permettono l’isolamento in COLTURA PURA
permettono di OSSERVARE LA MORFOLOGIA DELLE COLONIE Ultima
zona di
semina:
colonie isolate
Prima zona di semina:
crescita confluente
C) In base alla funzione
1)
TERRENI
SELETTIVI:
sono terreni di crescita adatti alla
moltiplicazione di uno specifico microrganismo o di un numero ristretto di
microrganismi che sfavoriscono la crescita di altri microrganismi.
campione clinico polimicrobico
FECI, TAMPONE FARINGEO,
TAMPONE CUTANEO ecc.
il terreno selettivo sfavorisce la
crescita dei batteri che non voglio
isolare
ESEMPI:
AGAR SALE MANNITE:
MANNITE contiene il 7.5% di NaCl che inibisce la maggior parte dei
Gram-; terreno selettivo per l’isolamento degli Stafilococchi;
AGAR MacCONKEY:
MacCONKEY: contiene sali biliari che inibiscono la maggior parte dei Gram+;
terreno selettivo per l’isolamento degli enterobatteri;
AGAR THAYER MARTIN: terreno selettivo per l’isolamento delle neisserie patogene.
Contiene antibiotici ed antifungini verso cui le neisserie patogene non sono sensibili.
2) TERRENI DISCRIMINATIVI:
rendono possibile alle colonie di un dato germe di svilupparsi assumendo un
aspetto tale da essere riconosciuto a prima vista.
ESEMPI:
AGAR SALE MANNITE:
MANNITE contiene la MANNITE come unica fonte di carbonio;
permette di discriminare gli Stafilococchi patogeni (S. aureus) nell’ambito degli
Stafilococchi;
Colonie
acidificanti
(gialle):
la
fermentazione del mannitolo produce acidi
che fanno virare il colore dell’indicatore
verso la forma acida. ES: S. aureus
Colonie incolori: il germe non fermenta il
mannitolo; le colonie rimangono del
colore del terreno ES: S. epidermidis
2) TERRENI DISCRIMINATIVI:
rendono possibile alle colonie di un dato germe di svilupparsi assumendo un aspetto
tale da essere riconosciuto a prima vista.
ESEMPI:
AGAR MacCONKEY: contiene il LATTOSIO come unica fonte di carbonio;
permette di discriminare gli enterobatteri patogeni (S. typhi) nell’ambito degli
enterobatteri.
Colonie
acidificanti
(rosse):
la
fermentazione del lattosio produce acidi
che fanno virare il colore dell’indicatore
verso la forma acida. ES: E. Coli
Colonie incolori: il germe non fermenta
il lattosio; le colonie rimangono del
colore del terreno ES: S. typhi
3) TERRENI (COLTURE) DI ARRICCHIMENTO: sono terreni selettivi
liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche
favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la
fase di latenza delle specie competitrici.
ESEMPIO:
TERRENO AL SELENITO per l’isolamento delle Salmonelle dalle feci
Numero
di batteri
6-8 ore
Batterio patogeno che voglio isolare
dalle feci (es: Salmonella typhi)
Tempo (ore)
Batteri non patogeni
commensali intestinali
LA COLTIVAZIONE DEI GERMI ANAEROBI
Varie procedure a seconda della sensibilità all’O2:
1) Chiusura ermetica delle provette o aggiunta di olio di vasellina;
2) Aggiunta al terreno di agenti riducenti (es: Tioglicollato) che riducono l’O2 ad H2O;
3) Giara per anaerobiosi
All’interno del contenitore, accanto alle piastre, viene sistemata una
busta contenente composti per lo sviluppo di H2 (boroioduro di sodio) e di
CO2 (acido citrico e sodio bicarbonato). I composti vengono attivati
mediante l’aggiunta di 10 ml di acqua. Nella busta è presente anche un
catalizzatore che permette la combinazione dell’O2 contenuto nel
recipiente con l’H2 liberato e la formazione di H2O
4) Cabina anaerobica
L’atmosfera all’interno della cabina
contiene: 85% N2; 10% H2; 5% CO2
LA RIPRODUZIONE E LA CRESCITA
DEI BATTERI
I BATTERI SI
RIPRODUCONO PER
SCISSIONE BINARIA.
BINARIA
In questo processo si verifica:
w La duplicazione del cromosoma
...batterico;
w L’allungamento della cellula
batterica;
w La formazione di un setto
trasverso in posizione
centrale;
w La suddivisione di una copia
del ...cromosoma e del
citoplasma ...nelle due cellule
figlie.
La SCISSIONE BINARIA è un processo di riproduzione asessuata. I
batteri non si riproducono sessualmente sebbene sia possibile un
processo di scambio di informazione genetiche tra due cellule
batteriche differenti descritto come una forma di sessualità.
In seguito a scissione binaria si verifica un aumento del
numero degli individui con costituzione di una COLTURA
BATTERICA o POPOLAZIONE
Studiare la CRESCITA BATTERICA significa analizzare
come il numero degli individui in una popolazione varia
rispetto al tempo
METODI DI CONTA DEI BATTERI
Per seguire l’andamento della crescita batterica è necessario
eseguire delle misurazioni quantitative.
1) CONTA TOTALE: valuta il numero totale di cellule
batteriche sia quelle vive che quelle morte
a)
Conta
al
microscopio:
Viene utilizzata
una camera di
conta in cui è
noto il volume di
ogni riquadro
b) Impiego di contatori elettronici: Strumenti automatici che
misurano la conducibilità elettrica di una sospensione di cellule
batteriche
c) Misurazione della densità ottica allo spettrofotometro: In seguito
alla crescita si verifica un intorbidimento del mezzo di coltura che
può essere valutato quantitativamente con l’ausilio di uno
spettrofotometro
2) CONTA VITALE:
valuta il numero di
cellule batteriche
VITALI cioè in grado
di dividersi e dare
origine a due cellule
figlie e,
successivamente, a
colonie batteriche.
CFU: unità formanti colonie
LA CURVA DI CRESCITA
Per seguire la crescita di una coltura batterica rispetto al tempo si impiegano TERRENI
LIQUIDI come ad esempio un brodo nutriente
1) FASE DI LATENZA
Rappresenta la fase di adattamento dei microrganismi al
mezzo di coltura (sintesi di tutti i fattori, proteine,
enzimi necessari per l’approvigionamento di sostenze
nutritizie presenti nel mezzo di coltura). La velocità di
crescita è zero. Il numero dei batteri è costante
rispetto al tempo;
Ž
•
2) FASE ESPONENZIALE
È la fase di crescita in cui i batteri si
accrescono alla massima velocità
possibile. Il numero dei batteri
raddoppia ad intervalli regolari di
tempo. La velocità di crescita è
costante;
•
Œ
3) FASE STAZIONARIA
La mancanza di nutrienti e l’accumulo dei metaboliti
tossici rallentano la crescita dei batteri fino ad
azzerarla. La velocità di crescita è zero. Il numero
dei batteri è costante rispetto al tempo;
4) FASE DI LETALITÀ O DI MORTE
I batteri muoiono con una cinetica
esponenziale. Il numero dei batteri dimezza ad
intervalli regolari di tempo. La coltura va
incontro ad autosterilizzazione.
FATTORI CHE INFLUENZANO LA PRESENZA E LA DURATA DI
ALCUNE FASI DI CRESCITA
FASE DI LATENZA:
w Non sempre è presente
w La sua presenza è influenzata da vari fattori quali ad esempio:
1) Stato fisiologico delle cellule
2) Natura del terreno in cui le cellule vengono inoculate
3) Modalità di inoculo
Œ
Cellule batteriche provenienti
da una fase ESPONENZIALE
di crescita inoculate in un
terreno
di
identica
composozione chimica
Cellule batteriche provenienti
da una fase STAZIONARIA
di crescita inoculate in un
terreno
di
identica
composizione chimica
NO
LATENZA
SI
LATENZA
•
Ž
Inoculi abbondanti riducono la fase di latenza
Inoculi diluiti allungano la fase di latenza
FASE ESPONENZIALE
Diversi fattori possono influenzare la velocità di crescita
di
una
coltura
batterica
ed
il
TEMPO
DI
GENERAZIONE:
tempo
che
intercorre
tra
due
generazioni successive
1) FATTORI GENETICI
Velocità di crescita di alcuni batteri alle loro T ottimali
Organismi
Temp. °C
Tempo di generazione in ore
Bacillus stearothermophilus
Escherichia coli
60
40
0,18
0,35
Bacillus subtilis
Vibrio marinum
Mycobacterium tuberculosis
40
15
37
0,43
1,35
c.a.24
Velocità di crescita
2) FATTORI AMBIENTALI
ü Sostanze nutritizie
ü Temperatura
ü PH
ü Aereazione
ü Forza ionica
CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI A
SECONDA DELLA TEMPERATURA
OTTIMALE DI CRESCITA
TERMOFILI:
55-75°C
MESOFILI:
30-45°C
PSICROFILI:
15-20°C
Effetto della T
sulla velocità di
crescita di E.
coli, un tipico
mesofilo
Temperatura (°C)
SCHEMA DI CHEMOSTATO PER ALLESTIMENTO DI
COLTURE CONTINUE
Buona
Pasqua
STERILIZZAZIONE