Biologia delle cellule staminali
“come si IDENTIFICANO, si CATTURANO e
si CRIOPRESERVANO ”
Irene Paolucci
Dirigente biologo
Servizio Immunotrasfusionale
Polo Ospedaliero di Verbania
ASL VCO
Domodossola 20 ottobre 2012
“ le cellule staminali hanno ricevuto negli ultimi anni una
sempre maggiore attenzione da parte della ricerca scientifica e
dalla stampa per le loro potenzialità “
Capacità di autorinnovamento
Capacità di differenziarsi in
progenitori commissionati
Due tipi di cellule staminali:
Staminali embrionali
Staminali adulte
Domodossola 20 ottobre 2012
… una cellula si divide (di solito raramente), dando origine a due cellule
diverse fra loro : una cellula figlia uguale alla madre (staminale ) e una
cellula figlia diversa (progenitore) che anche se può dividersi numerose volte
ad un certo punto perderà la capacità di duplicarsi (STAMINALITA’ ) e la sua
progenie si differenzierà in un solo tipo cellulare o in più tipi cellulari ,
sarà unipotente o multipotente…
Domodossola 20 ottobre 2012
Nell’uomo
Le cellule staminali embrionali presenti nell’embrioblasto , isolate e
coltivate per la prima volta nel 1998, sono in grado di dare origine a
tutti i tessuti differenziati dell’organismo (neuroni, epatociti ,
cardiomiociti.. ). La prospettiva di rigenerazione dei tessuti
danneggiati da malattie degenerative è diventato ampio oggetto di
studio.
le cellule staminali adulte sono presenti in molti e forse in tutti gli
organi anche se il loro numero si riduce con l’avanzare dell’età.
Anche il sistema nervoso centrale e periferico sembrano possedere
le loro cellule staminali neurali stimolabili in vitro.
A partire dal 1998 numerose pubblicazioni dimostravano la
stupefacente capacità plastica delle cellule staminali embrionali e
adulte : multipotenti a seconda dello stimolo cui erano sottoposte in
vitro.
Domodossola 20 ottobre 2012
Cellula staminale emopoietica
E’ una cellula presente nel midollo osseo e nel
sangue periferico capace di:
automantenersi
dare origine a tutte le
linee cellulari
emopoietiche
Domodossola 20 ottobre 2012
LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (1)
• Negli anni ’70
SI ERA NOTATO CHE ALCUNI
GIORNI DOPO CHEMIOTERAPIA IL SANGUE
PERIFERICO era INTERESSATO DA UNA 'FIAMMATA'
DI CELLULE CLONOGENICHE 100 VOLTE PIU'
FREQUENTI CHE IN CONDIZIONI BASALI.
• Intorno alla metà degli anni '80, CON L'AVVENTO DEI
FATTORI DI CRESCITA EMOPOIETICI (EPO, G-CSF),
USATI PER ACCELERARE LA RIPRESA
EMOPOIETICA DOPO CHEMIOTERAPIA, QUESTA
'FIAMMATA' VENIVA GRANDEMENTE AMPLIFICATA
(MOBILIZZAZIONE DI CELLULE CLONOGENICHE)
• VARIABILITA' DI COMPARSA (Picco 9-14 gg POSTCHEMIO), IN FUNZIONE DI VARIABILI CLINICHE.
Domodossola 20 ottobre 2012
LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (2)
• LE CELLULE DEL SANGUE PERIFERICO
SONO ELEMENTI MATURI TERMINALI.
• TUTTAVIA, SE SI COLTIVA CON OPPORTUNI
FATTORI DI CRESCITA UN QUALSIASI SANGUE
PERIFERICO NORMALE, SI NOTA DOPO 15 gg
LA COMPARSA DI COLONIE DI VARIO TIPO.
• QUESTO SIGNIFICA CHE IL SANGUE NORMALE
E' INTERESSATO DALLA CIRCOLAZIONE DI
ELEMENTI DOTATI DI
CAPACITA' CLONOGENICA.
.
Domodossola 20 ottobre 2012
LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (3)
• SI E' QUINDI PENSATO DI TRARRE VANTAGGIO DA
QUESTA FIAMMATA DI CELLULE CLONOGENICHE:
IL SANGUE PERIFERICO PER POCHI GIORNI SI
TRASFORMA IN UNA SPECIE DI MIDOLLO.
• SE PRELEVO CON LEUCAFERESI I GB CIRCOLANTI
OTTENGO QUINDI FACILMENTE MOLTE CELLULE
STAMINALI CHE POSSO UTILIZZARE PER
SUPPORTARE NUOVI CICLI DI CHEMIOTERAPIA
• QUI NASCE LA NUOVA BRANCA DELLA CHEMIOTERAPIA "AD ALTE DOSI": AUMENTA L'EFFICACIA
DELLA TERAPIA SUI TUMORI CHEMIOSENSIBILI,
GRAZIE AL SUPPORTO DELL' AUTOTRAPIANTO
DI CELLULE STAMINALI.
Domodossola 20 ottobre 2012
LE CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE (4)
• IL PROBLEMA ERA QUELLO DI RICONOSCERE LE
CELLULE STAMINALI IN TEMPO REALE.
• I TESTS CLONOGENICI DANNO RISPOSTE SOLO
DOPO 15 GIORNI, NON SONO CONTROLLABILI
E SONO CARATTERIZZATI DA ELEVATA
VARIABILITA'.
Domodossola 20 ottobre 2012
FREQUENZA DELLE CELLULE
STAMINALI CD34
• MIDOLLO OSSEO:
CONDIZIONI BASALI
STIMOLATO
1%
5%
• SANGUE PERIFERICO
CONDIZIONI BASALI
STIMOLATO
0.1%
1%
DA UN CORDONE OMBELICALE SI RICAVANO CIRCA
10-20 x 105 cellule totali
70kg
70x10 5 QUINDI SI PREDILIGE L’UTILIZZO DEI
CORDONI PER I TMO PEDIATRICI
Domodossola 20 ottobre 2012
COME
SI RICONOSCONO …
Domodossola
20 ottobre 2012
Nel 1984 scopre
l’antigene CD34
Prof.
CURT I.CIVIN
University of Maryland
Domodossola 20 ottobre 2012
Caratteristiche fenotipiche delle cellule
staminali emopoietiche
Nell’uomo l’antigene di superficie
identificativo è ilCD34, glicoproteina
integrale di membrana, pm pari a 105-120
kDa.
Unico marcatore fenotipico delle cellule
emopoietiche agli stadi primordiali
La sua funzione biologica nell’emopoiesi non
è completamente chiarita : sembra coinvolta
nei meccanismi di adesione e di homing
midollare delle cellule staminali.
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STEM CELL
PHENOTYPE
• MINORANZA DI CELLULE
LINEAGE
PHENOTYPE
• MAGGIORANZA DI CELLULE
Rod
123+
• FENOTIPO PIU' MATURO
• VARIETA' MARCATORI LINEA
• ALTA REPLICAZIONE
CD34++
• FENOTIPO PIU' IMMATURO
AdH+
CD90+
• BASSA REPLICAZIONE
Rod
CD38 123
CD45RA CD62L Fase S ± HLADR -
Fase S ++
CD34+
CD90±
CD38+
CD45RA+
HLADR+
CD62L+
CD117±
CD 133
Domodossola 20 ottobre 2012
IL PROTOCOLLO MILANO (Siena, Bregni, Brando 1991-92)
R2
R1
• SEMPLICE TEST A SINGOLO COLORE (FITC), DOPPIA PIATTAFORMA
• APPLICABILE A TUTTI I CITOMETRI. NO GATE LOGICO
•ANCORA MOLTO USATO IN MOLTI CENTRI
• PUNTO DEBOLE: NON ELIMINA EFFICACEMENTE EVENTI ASPECIFICI
• SOVRASTIMA DELLE CD34+ A BASSO LIVELLO % e ASSOLUTO
Domodossola 20 ottobre 2012
INTERNATIONAL
SOCIETY of
HEMATOTHERAPY
AND
GRAFT
ENGINEERING
IL CONTEGGIO DELLE
CELLULE CD34+
• MARCATURA
CD45 FITC / CD34 PE (di Classe III)
• ACQUISIZIONE DI ALMENO 100 EVENTI CD34+
• CONCENTRATIONE DEL CAMPIONE < 25.000 /µL
• TEST IN SINGOLA PIATTAFORMA (Microsfere)
• PIPETTAMENTO INVERSO DI PRECISIONE
•PROTOCOLLO ISHAGE
• CONTROLLI DI QUALITA’ ESTERNI (UK NEQAS)
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CONTA IN SINGOLA PIATTAFORMA
IL PRINCIPIO DELLE MICROBEADS
MICRO BIGLIE
QUANTITà NOTA
CELLULE
QUANTITà
IGNOTA
Parameter 2
VOLUME NOTO DI CAMPIONE
GATE 1
(Cells)
GATE 2
(Beads)
Parameter 1
N°of CELL Events (Gate 1)
N°of BEAD Events (Gate 2)
N° of BEADS per ABSOLUTE
X Unit of Volume = CELL
COUNT
Gated on R1
R1
R7
R2
NOT
R5
Gated on
R1*R2
Lymphs
from R5
Gated on
R1*R2*R3
R4
R3
R4
R6
BEADS
R8
LDS
All
LDS+
events
THRESHOLD
Gate
Events % Gated
G1 (CD45) 42225 100.00
G2
603
1.43
G3
562
1.33
G4 (STEM
CELLS)
554
G4 (stem cells)
554
1.31
G5 (Lymphocytes) 19170
45.40
G6G6
(BEADS)
(BEADS) 1127
559
1.32
G7 (acq. gate) 42087
99.67
R8: CELLS ONLY 41625
98.58
• METODO
ROBUSTO E RIPRODUCIBILE
• LA
RIGOROSA STRATEGIA DI GATING EVITA
L' INCLUSIONE DI EVENTI MARCATI
ASPECIFICAMENTE
• MOLTO
PRECISO E ACCURATO ANCHE PER
CONTE CD34+ % e /µL ESTREMAMENTE BASSE
• DIRETTAMENTE
APPLICABILE A TECNICHE DI
CONTEGGIO IN SINGOLA PIATTAFORMA
(ISHAGE Modificato EWGCCA)
Domodossola 20 ottobre 2012
COME SI CATTURANO …
Domodossola
20 ottobre 2012
RACCOLTA CELLULE STAMINALI
MIDOLLO
ASPIRAZIONI MULTIPLE DALLA CRESTA ILIACA
POSTERIORE IN ANESTESIA GENERALE/SPINALE.
(cresta iliaca anteriore e sterno)
IL MIDOLLO VIENE ASPIRATO, PROCESSATO E
QUINDI CRIOPRESERVATO
O SUBITO REINFUSO
Domodossola 20 ottobre 2012
RACCOLTA DI CELLULE STAMINALI DA MIDOLLO OSSEO
Domodossola 20 ottobre 2012
RACCOLTA CELLULE STAMINALI
SANGUE PERIFERICO
• La raccolta di cellule staminali da sangue periferico
avviene tramite passaggio del sangue in una
macchina che e’ in grado di identificare le cellule
staminali e di trattenerle, restituendo tutte le altre
cellule al paziente.
• Le cellule staminali cosi’ raccolte vengono
concentrate e criopreservate o subito reinfuse.
Domodossola 20 ottobre 2012
…..…e che era possibile raccogliere
un numero sufficiente di queste cellule
con procedure di leucoaferesi
La somministrazione di G-CSF per 3-4 giorni determina un
incremento significativo delle CD34 circolanti da 3,8 x 109/l a 61,9 x 109/l
pari ad un incremento di 16,3 volte del loro basale………….
(Korbling et al, 1995)
La raccolta di cellule
staminali avviene attraverso il
passaggio di sangue in una
macchina che è in grado di
trattenere le CSE e restituire tutte
la altre cellule al paziente/donatore
Domodossola 20 ottobre 2012
GB
/µL
Chemioterapia
10000
Conta
CD34+
GB
Trattamento con G-CSF
CD
34+
/µL
40
30
5000
20
10
1000
Giorni
0
5
10
DECISIONE DI
EFFETTUARE
LEUCAFERESI
AB cd
ESEMPIO SCHEMATICO
Procedura
Di Mobilizzazione
E Raccolta CD34+
1
15
AB cd
AB cd
2
3
20
CONTA ASSOLUTA
Cellule CD34+
RACCOLTE IN
CIASCUNA SACCA
Valutazione Finale Raccolta
Cellule CD34+/Kg Peso
REPARTO CLINICO
(Ematologia, Oncologia...)
Identifica il Paziente Candidabile
e Pone Indicazione al TX.
Decide START e STOP Procedure
SERVIZIO IMMUNOTRASFUSIONALE
LABORATORIO FCM
Valuta Eleggibilità
Monitorizza il Livello di CD34+
Paziente
Durante la Mobilizzazione.
al Trattamento Aferetico.
Misura Quantità CD34+
Esegue Aferesi.
e Qualità della Raccolta.
Misura i Parametri Post-Aferesi. Manipola, Campiona,
Valuta Qualità dello Scongelato Custodisce e Assegna
al Momento del TX.
la Sacca di Aferesi
Domodossola 20 ottobre 2012
Dal cordone ombelicale di tanti piccoli donatori
Come si criopreservano…
Le cellule umane e animali possono essere
criopreservate in azoto liquido a -196°C per
almeno
15
anni
senza
significativi
cambiamenti
delle
loro
caratteristiche
biologiche.
Il mantenimento di tali caratteristiche
biologiche oltre i 15 anni non ha al momento
nessuna prova scientifica.
Si verifica una minima riduzione della loro
capacità clonogenica.
Le cellule vitali possono essere recuperate
in qualsiasi momento
Domodossola
20 ottobre 2012
Tanto tempo fa ….
Le origini della criobiologia risalgono al 2500 a.C. quando gli
Egiziani già utilizzavano le basse temperaturee in medicina.
L'uso del freddo era consigliato da Ippocrate come un ottimo
rimedio contro i sanguinamenti e i gonfiori.
Agli albori dello sviluppo della medicina moderna, Robert
Boyle studiò gli effetti delle basse temperature sugli animali.
Nel 1949 un gruppo di scienziati guidati da S. Polge sottopose
per la prima volta dello sperma a un processo di
crioconservazione. Oggigiorno la stessa tecnica è applicata in
innumerevoli altri campi: il congelamento di organi e tessuti è
un'operazione di routine.
Domodossola 20 ottobre 2012
Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche
(CSE)-1
•CSE vitali per 2-3 giorni a temperature > a t. di congelamento
Domodossola 20 ottobre 2012
Criopreservazione delle cellule staminali emopoietiche
(CSE)-2
Possibili danni della crioconservazione:
Cristalli di ghiaccio e danno degli organuli
cellulari
Cristalli di ghiaccio extracellulari e
disidratazione delle cellule
Funzionamento parziale degli enzimi cellulari
a basse
Temperature con possibile accumulo di
metaboliti tossici intermedi
Domodossola 20 ottobre 2012
Criopreservazione delle cellule staminali
emopoietiche (CSE)-3
Il congelamento e lo scongelamento non migliorano lo status quo
delle cellule
Gli agenti crioprotettivi possono essere Dimetilsulfossido (DMSO)
o Glicerolo; proteggono le cellule dai danni indotti
dalla formazione dei cristalli di ghiaccio durante il criocongelamento
in una quantità pari al 5-10% della quota di sangue midollare da congelare
Domodossola 20 ottobre 2012
Il crioprotettore
Principi base:
DMSO aggiunto all’anticoagulante pochi ml alla volta
mentre viene
raffreddato su ghiaccio (reazione esotermica)
La lunga esposizione a temperatura ambiente al
DMSO
può danneggiare irreversibilmente le cellule
(tempi ridotti per la preparazione delle aliquote da
congelare)
Controllo della velocità di raffreddamento
Domodossola 20 ottobre 2012
Punti Critici
Se la velocità di raffreddamento è troppo bassa , la cellula è
esposta a [ ] crescenti di soluti cellulari dovute alla
formazione di ghiaccio nel mezzo di soluzione
ALTA [ ] SOLUTI
DISIDRATAZIONE
VARIAZIONI DI pH
> PRESSIONE OSMOTICA
Domodossola 20 ottobre 2012
Punti Critici
Se la velocità di raffreddamento è troppo alta , si avrà la
formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione
che all’interno della cellula
DANNO MECCANICO
CRISTALLI INTERNI
CRISTALLI ESTERNI
DISTRUZIONE DELLA MEMBRANA
CELLULARE
ESISTE LA VELOCITA’ IDEALE?
•Il raffreddamento deve essere lento in modo tale da evitare
la formazione di ghiaccio!
•Il raffreddamento deve essere nello stesso tempo rapido in
modo tale da non danneggiare la cellula per disidratazione!
OTTIMIZZAZIONE DELLA
VELOCITA’ NEL VALORE DI
-1°C/MINUTO
Prima di congelare è necessario ….
Determinazione delle Cellule CD34 nella sacca
Applicazione della Metodica in Citometria a Flusso
Determina il valore assoluto delle cellule CD34+ (0,10,5%) che risulta di vitale importanza ai fini
trapiantologici.
Determinazione emocromo per cellularità
della sacca da congelare
Domodossola 20 ottobre 2012
In pratica …..
Preparazione della soluzione crioprotettiva
Essa è costituita da:
•10% ACD, anticoagulante
•10% di Dimetilsulfossido, l’agente crioprotettivo.
Si aggiunge alla sacca da congelare una quota di
soluzione crioprotettiva pari al 20% del volume finale
da congelare
Fase congelamento
Si inserisce la sacca da congelare nel
Congelatore Programmabile
1°C/min
-25°C
5-10°C/min
-100°C
Trasferimento in Tanica Criogenica
Domodossola 20 ottobre 2012
Il congelamento programmato
Passaggio di stato
Domodossola 20 ottobre 2012
LA CONSERVAZIONE
•A lungo termine a
-196 °C,
•a -80°C per brevi
periodi
Domodossola 20 ottobre 2012
LA FASE DI SCONGELAMENTO (1)
I danni cellulari possibili durante la fase di
scongelamento sono causati dal fenomeno della
ricristallizzazione e per lo shock da diluizione
dovuto alla fusione dei cristalli di ghiaccio con
conseguente ipotonicità del liquido
extracellulare.
Ciò provoca il rigonfiamento delle cellule fino alla
lisi
Lo scongelamento rapido protegge da questi
possibili problemi.
LA FASE DI SCONGELAMENTO (2)
IN CONDIZIONI DI MASSIMA STERILITA’!
Ricordiamoci che il paziente è in aplasia
midollare!!
•Scongelamento delle sacche a bagno
maria sterile (37-38°C)
nel più breve tempo possibile.
•Reinfusione solitamente attraverso
catetere venoso centrale
Domodossola 20 ottobre 2012
A QUESTO PUNTO LE “NOSTRE “
STAMINALI COSA FANNO??
Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche
Con il termine Homing si definisce quel
processo biologico che conduce le cellule
staminali
ematopoietiche
trapiantate
a
raggiungere la loro cavità, ovvero “nicchia” nel
midollo osseo.
Domodossola 20 ottobre 2012
HOMING
(un altro aspetto essenziale della cellula staminale )
• Circa il 5% di progenitori umani CD34+ raggiunge la
nicchia midollare dell’ospite!
• La nicchia midollare si può definire come una
microstruttura spaziale nella quale alloggiano le CSE ,
che interagendo, con stimoli esterni , vanno incontro ad
autorinnovamento
“santuario della staminalità “
La percentuale è leggermente variabile e correla con lo
stato del ciclo cellulare delle cellule primitive trapiantate;
L’attecchimento è massimo in cellule quiescienti ( le
cellule possono perdere temporaneamente l’antigene
CD34)
Domodossola 20 ottobre 2012
L’esito dell’homing e la sua efficienza
influenzano il successo
dell’attecchimento di un trapianto…
Domodossola
20 ottobre 2012
Grazie per l’attenzione
Domodossola 20 ottobre 2012
