Genetica del cancro
Lezione 19
By NA
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Il tumore come network
Carcinoma del colon
Le cellule mutate
iniziano a duplicarsi in
modo incontrollato
Displasia. Le
cellule perdono
morfologia
Cancro invasivo
Le cellule
divengono
invasive e
metastatizzano
Processo di vascolarizzazione
Iperplasia Le
cellule
conservano
morfologia
Cancro in situ
Le cellule
perdono il
contatto con il
tessuto
Esempio di progressione a tappe da tumore benigno a tumore maligno
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Modalita’ di espressione
Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche?
/Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi
gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse)
M Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della
cellula non dell’individuo!
Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismo
ci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno
un allele wild-type . Una cellula di questi cloni per caso muta l’allele
wild-type : perde la funzione e si manifesta il tumore
Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile
alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne
pregiudica la funzione.
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Oncosoppressori gatekeepers
Questi oncosoppressori vengono definiti “gatekeepers”:
(guardiani) perche’ regolano funzioni cellulari fondamentali
come l’innesco della proliferazione, del differenziamento e
dell’apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha
introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA .
MAPLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata
funzionalita’ di un allele non provoca la comparsa del fenotipo,
ma mette la cellula in condizioni di “debolezza”. La cellula e’
eterozigote e il gene puo’ ancora svolgere la funzione, ma e’
una funzione non completamente efficace
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Oncosoppressori gatekeepers
esempi
LLa perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di
tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita’ di ras.
LAPC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla
superficie cellulare al nucleo, che porta all’espressione di c-MYC
LLa perdita di
p53 genera la
sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo
le cellule al processo di apoptosi
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5
Altri oncosoppressori
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6
Retinoblastoma
Servira’come modello per chiarire la teoria del doppio
colpo che e’stata formulata da Knudson per spiegare il
diverso comportamento nei due tipi di retinoblastoma
ereditario e non.
E servira’come modello per comprendere come si puo’
impostare la ricerca dei geni che controllano le funzioni
di base della vita cellulare
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Retinoblastoma
* e’un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi
anni di vita
* puo’essere monolaterale (solo un occhio colpito) o
bilaterale (entrambi gli occhi)
* si puo’manifestare in forme sporadiche o ereditarie
diagnosticate a 7-10 anni,
generalmente monofocali (solo
in un punto dell ’occhio)
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diagnosticate nel primo
anno di vita, multifocali
(piu ’punti di un occhio)
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Genetica del retinoblastoma
retinoblastoma bilaterale
retinoblastoma monolaterale
non-penetrante
Apparente trasmissione dominante...
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Alfred Knudson
Nel 1971 Alfred Knudson analizzo ’casi di bambini con
retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale
Osservo’che:
* al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero
sviluppato tumori bilaterali erano piu’piccoli di quelli per i
quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali;
* con l’aumentare dell’eta’, la frequenza con cui venivano
diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera
esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali
aumentava molto piu’lentamente.
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Modello del “doppio colpo”
Knudson propose un modello ( two-hit hypothesis ) secondo il quale,
affinche ’si abbia il retinoblastoma, e ’necessario che in una
linea di cellule retiniche si verifichino due
distinti eventi
mutazionali
I evento
(“hit”)
II evento
(“hit”)
* I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale,
pertanto, e ’presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e
evento perche ’si produca il tumore.
’necessario un secondo
* Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali
indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio ’si realizza piu ’raramente, per cui
l ’insorgenza e ’piu ’tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali.
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Il gene del retinoblastoma
(Rb)
Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e ’stato
fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali,
concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita ’
delezion
e 13q13q14
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L ’analisi cromosomica di questi
pazienti ha dimostrato la presenza
di una delezione del braccio lungo
del cromosoma 13 di dimensione
variabile ma con condivisione delle
bande 13q13-q14: questa
osservazione suggeriva che in tale
regione si localizzasse un gene
predisponente al retinoblastoma
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Rb ed esterasi
/Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del
gene per l ’enzima esterasi D , enzima di funzione sconosciuta ma
facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli,
evidenziabile mediante elettroforesi di proteine.
/I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta
’
della quantita ’normale di esterasi D ed esprimevano invariabilmente
un solo allele.
IL’esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento
ideale per studiare il gene del retinoblastoma
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Linkage di esterasi e Rb
L ’analisi di linkage
esaminando la segregazione
del polimorfismo
dell ’esterasi D in famiglie
con retinoblastoma
ereditario e prive di
delezione:
gli alleli dell ’esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere
retinoblastoma (lod score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente
alla malattia fosse localizzato a livello della banda 13q14.
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14
Verifica dell ’ipotesi di Knudson
*Una mutazione in un gene del cromosoma 13 che
costituirebbe al primo evento secondo l ’ipotesi di Knudson e ’
presente nelle cellule normali dei portatori
*Il secondo evento
sarebbe consistito nella perdita della copia normale
rimanente di questo gene...
Per testare questa ipotesi si e ’usata nuovamente l ’esterasi D , espressa
nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero
espressi
II tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti
eterozigoti per il polimorfismo dell ’esterasi D e non portatori
di delezione costituzionale del cromosoma 13.
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Verifica dell ’ipotesi di Knudson
J Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi
L Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati
?
Mil secondo evento consisteva probabilmente in una
delezione che includeva i loci sia dell’esterasi D che del
retinoblastoma
Per la verifica del secondo evento, si puo ’ricorrere a tecniche di
biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una
famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la
perdita di eterozigosita ’(LOH)
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16
LOH
*La LOH si puo ’applicare sia ai tumori familiari che a quelli
sporadici, suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che
conducono allo sviluppo del tumore interessino un locus sul
cromosoma 13.
I C’e’ una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo
stesso background genetico delle normali perche’ appartengono allo
stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo
tumorale, non alla variabilita’ genetica e questo permette di utilizzare
anche gli sporadici
* Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano
invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto
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Clonaggio del gene del retinoblastoma
* la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14
e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule
retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti
affetti da retinoblastoma familiare
*il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un
gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote
corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla
regione 13q14
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Clonaggio del gene del retinoblastoma
*Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni
molto diversi dal normale
*pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con
delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti
costituzionali.....
Ipotesi di Knudson confermata!
Rb e ’un
oncosoppressore
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19
Ricerca delle mutazioni
MIn molti casi le mutazioni non consistono in delezioni
o alterazioni a carico del gene tali da poter essere
individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi
piu’difficili da evidenziare
Itest molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per
rivelarle
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Meccanismi di acquisizione della seconda
mutazione
+
+
Rb --
+ Rb
Non disgiunzione
e duplicazione
mutazione
puntiforme
C.O mitotico
+
delezione
Rb
Conversione genica
Rb
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Rb
+ Rb
Rb
Rb
Rb
+
Rb
x
Rb
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Perdita di eterozigosita’ LOH
famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D
Cellule
tumorali
omozigote
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eterozigote
eterozigote
LOH
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Perdita di eterozigosi per identifiare un TS
By NA
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Perdita di eterozigosi / instabilita’
By NA
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come funzionano i TS
By NA
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controllo dell’integrita’
del genoma
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Il materiale didattico e’ presente in rete:
http://www.dipartimentodibiologiabari.it/didattica
NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
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