07 BIOTEC GenMol 10_11 CF

Fibrosi Cistica
Lezione 7
By NA
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Perche’ la Fibrosi cistica
Per ragioni storiche: e’ stato uno dei primi geni di cui non
si conosceva la funzione clonato e sequenziato
perche’
costituisce un esempio di come si utilizza il
linkage e linkage disequilibrium per la mappatura
perche’
e’ un ottimo esempio per la difficolta’ della
diagnostica
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Cos’e’ la Fibrosi cistica
ECCESSIVA PRODUZIONE DI SECREZIONI DENSE.
Malassorbimento
cronico che comporta incapacita’ di crescere normalmente(deficit della
secrezione degli enzimi pancreatici e quindi insufficiente digestione delle proteine e grassi).
Frequenti infezioni del tratto respiratorio da semplici raffreddori a polmoniti (ostruzione
delle vie respiratorie minori da parte di un muco denso e loro colonizzazione da parte di
batteri).
SECREZIONE DI NaCl NEL SUDORE(TEST DIAGNOSTICO)
1 affetto/2500
H-W
1 portatore/25
q2 = 1/2500 ⇒q=1/50 ⇒p=1-q=49/50 ⇒ ⇒ 2pq=2x49/50x1/50= 1/25
LA CF E’ SOGGETTA AD EFFETTO DEL FONDATORE E AL
VANTAGGIO DELL’ETEROZIGOTE
(e’ presente in molte popolazioni, ma e’ piu’ frequente nella
popolazione del Nord-Europa)
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Fibrosi Cistica
un po’ di storia
 1985: Analisi di linkage
: il gene della fibrosi cistica (CF) viene
associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora la
localizzazione.

Perche’ il linkage?
Perche’ non si hanno informazioni sulla natura del
prodotto del gene: si sa solo che da qualche parte
del genoma c’e’ un locus la cui sequenza, quando mutata,
provoca la Fibrosi cistica. Si applica il clonaggio posizionale
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Ripuntualizziamo la definizione di gene
 il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta identificata dalla modalita’
di segregazione e dalla mappatura in un locus
 il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante con una
organizzazione definita: 5’UTR, esoni,introni, 3’UTR .... corrispondente
ad una sequenza amminoacidica o piu’genericamente ad un trascritto
 il locus e’ una regione genomica la cui espressione porta ad un fenotipo:
per cui e’ piu’ giusto parlare di locus-malattia che di gene-malattia. Il locus
puo’ essere piu’ grande del gene molecolare. Il linkage si fa fra locus,
non fra geni molecolari
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Come fare il linkage
Testando tutte le famiglie in cui e’ presente almeno un affetto con
polimorfismi del DNA di cui si conosce la localizzazione. Quando si
trova il linkage ho mappato fisicamente il locus
Ho trovato il gene?!
NO!!!
Non ho trovato il gene corrispondente al mio carattere :
adesso so dove andarlo a cercare
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Linkage-lod score
 Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro
distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici
che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano
dovuti al caso . Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia
raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la
difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da
piu’ famiglie.
P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati
Odds
ratio=
P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti
(1- Θ)n Θr
(1/2)n+r
Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi
sommare. Un valore di 3 indica linkage.
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Linkage disequilibrium
 Il linkage disequilibrium e’ una situazione per cui un particolare aplotipo e’
statisticamente piu’ probabile in un sottogruppo di una popolazione. Indica che la
popolazione deriva da un comune ancestore o, nel caso delle mutazioni patogene,
che la mutazione e’ avvenuta su un cromosoma ancestrale comune alla popolazione.
Il linkage disequilibrium non ha niente a che fare con la presenza della mutazione
patogena e’ una osservazione che facilita la mappatura genetica. Indica che
fisicamente associato al locus A polimorfico c’e’ un altro locus che, quando mutato
origina la malattia. Essendo un fenomeno legato all’origine comune degli individui
della popolazione, in un’altra popolazione il disequilibrium riguardera’ un altro allele
del locus A
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Linkage disequilibrium

E’ necessario considerare tutte le cause
disequilibrium e’ solo una delle cause
dell’associazione: il linkage
 Causa-effetto
e selezione naturale: Un certo allele rende piu’ suscettibili a
manifestare la malattia o permette alle persone malate di sopravvivere e di avere
figli

Errori per la stratificazione della popolazione o per mancata correzione
statistica: se una popolazione e’ composta di sottoinsiemi geneticamente distinti
entrambi i marker possono essere piu’ frequenti, ma senza che questo implichi
un’associazione. Nel secondo caso i dati non vengono confermati da studi successivi
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Fibrosi Cistica e linkage disequilibrium
Il gene della Fibrosi Cistica e’ stato clonato
grazie alla presenza del linkage disequilibrium.
CHR CF
(254 con mut)
CHR NORMALI
(318 wild-type)
ALLELE di
XV-2C
ALLELE di
KM-19
numero
percentuale
numero
percentuale
A
1
1
17
6.7
74
28.9
B
1
2
218
86.5
35
16.4
C
2
1
7
2.8
110
44
D
2
2
10
4
31
10.7
APLOTIPO
Incerto
2
4
Dati ottenuti su 114 famiglie britanniche con un figlio affetto. Il
cromosoma CF, identificato perche’ presente nell’affetto, tende a
portare gli alleli X1 e K2.
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Possibili cause del linkage disequilibrium
Potrebbe essere causa dell’
dell’effetto
del fondatore:
fondatore la mutazione potrebbe essere comparsa
in un antenato della popolazione Nord-Europea che portava l’aplotipo B e probabilmente gli
eventi di ricombinazione non hanno avuto sufficiente tempo per rispristinare una situazione
di equilibrio, cioe’ ad una associazione casuale. Cio’ significa anche che gli eventi di
ricombinazione sono rari tra il gene CF e i due marcatori cioe’ il locus malattia e’
e’ strettamente
associato ai due marcatori XV-2C e KM-19
La
presenza di un particolare aplotipo potrebbe conferire un vantaggio selettivo
nell’
nell’individuo che lo porta (come accade per gli antigeni HLA: particolari aplotipi sembrano
migliorare la risposta immunitaria e percio’ sono sottoposti a pressione selettiva)
La conoscenza del linkage disequilibrium oltre a dare una indicazione della localizzazione
precisa del locus malattia, risulta utile per la consulenza: permette di calcolare con
maggiore precisione il rischio di trasmissione. Es: normalmente 1/25 portatori nella
popolozione nord-europea, ma se un individuo ha aplotipo BB il rischio e’ maggiore, mentre e’
molto ridotto per aplotipi AA.
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Clonaggio del gene della CF
Tecniche utilizzate
Gene walking
Chromosome jumping
Zoo- blot
RICERCA DELLE MUTAZIONI
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CFTR
1989:
una volta clonato il gene putativo, bisogno’ dimostrare che era il gene della
fibrosi cistica. Furono pertanto esaminati gli affetti e si trovo’ che il 70% dei cromosomi
CF presentavano la delezione di una tripletta (ΔF508) senza che venisse alterata la ORF.
Il prodotto del gene e’ stato definito CFTR( cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator).
OUT
IN
Nterm
NBD1
ATP
ADP+ Pi
R
Domain
Cterm
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NB21
ATP
ADP+ Pi
13
Conferma del coinvolgimento di CFTR
La presenza in omozigosi della ΔF508 in individui gravemente affetti non
era conclusiva, anche se molto convincente: la delezione avrebbe potuto
essere un polimorfismo come altri in linkage disequilibrium strettissimo
con il gene. La identificazione del coinvolgimento di CFTR nel trasporto
dello ione cloro attraverso le membrane apicali e la caratterizzazione di
alcune mutazioni il cui effetto era piu’ evidente sull’espressione del gene
confermarono che CFTR era il gene della Fibrosi cistica.
CFTR
cloro
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Diagnosi di CF
Oggi sono state descritte oltre 1000 mutazioni nel gene CFTR
Molte vengono definite mutazioni private, perche’ individuate in una sola
famiglia. In molti casi non e’ certo che siano patogene, potrebbero essere
sequenze varianti in un cromosoma in cui e’ presente un allele CF.
Non ci sono altre mutazioni molto frequenti, sono tutte mutazioni con
frequenza che non supera qualche punto percentuale. Sono state trovate
mutazioni di diverso genere lungo tutto il gene e probabilmente altre devono
essere ancora scoperte
La presenza di centinaia di mutazioni diverse rende molto
difficili i test diagnostici per la CF
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Screening per PCR e
successiva ibridazione con
oligonucleotidi
Amplificazione specifica con primer
che legano sequenze mutate
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Tipi di mutazione
SONO STATE TROVATE MUTAZIONI DI VARIO GENERE:
Mancata produzione della proteina(frameshift e non senso)
Mancato processamento della proteina e conseguente ripiegamento
anomalo della stessa e incapacita’ di fuoriuscire nel lume cellulare(ΔF508)
Non corretta regolazione della proteina: il canale ionico e’ regolato
tramite fosforilazione da parte di kinasi cAMP dipendenti, mutazioni nei
domini regolatori della proteina portano al mancato funzionamento di
questo sistema.
Mutazioni puntiformi che distruggono il canale stesso.
Alcuni soggetti presentano mutazioni in omozigosi e sono affetti piu’
gravemente.
Esistono anche casi di eterozigosi composta con mutazioni diverse
nello stesso soggetto.






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Ricerca delle mutazione nel gene CFTR
Le mutazioni CF sono piu’ di 800, le piu’ comuni hanno
frequenza diversa nelle popolazioni:
ΔF508 va dal 50% nel mediterraneo all’85% in Danimarca e nei paesi
baschi, in media il 70% degli ALLELI MUTATI sono ΔF508. Altre 12
mutazioni hanno una frequenza combinata del 15%. quindi le frequenze
medie dei genotipi dei MALATI di fibrosi cistica sono :
49% ΔF508/ΔF508
21% ΔF508/mutaz. comune non ΔF508
21% ΔF508/mutaz.rara
4.5% mutaz. comune non ΔF508/mutaz. rara
2.25% mutaz. comune non ΔF508/ mutaz. comune non ΔF508
2.25% mutaz. rara/mutaz. rara
Circa il 90% degli affetti ha almeno un allele ΔF508 e sara’ comunque
possibile in Europa identificare circa il 70% dei genotipi utilizzando i
test per le mutazioni comuni
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Il materiale didattico e’ presente in rete:
http://www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.html
NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
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