La reazione enzimatica

SEQUENZIAMENTO
DEL DNA
Il metodo di Sanger per determinare la
sequenza del DNA
Il metodo manuale
™La reazione enzimatica
™ Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide
™ Autoradiografia
Il metodo automatico
™ La reazione enzimatica
™ Elettroforesi in un sequenziatore automatico
Il metodo di Sanger: la reazione enzimatica
Reagenti della reazione enzimatica:
• DNA da sequenziare a singolo filamento
• DNA polimerasi
• Innesco
• dNTP (di cui almeno uno è marcato con 32P o 33P o 35S in posizione α)
• 2’,3’-dideossinucleotidi (a più bassa concentrazione rispetto ai dNTP)
Si preparano 4 diverse miscele di reazione,
ognuna contenente un diverso dideossinucleotide
Il metodo di Sanger: la corsa elettroforetica
Le 4 reazioni enzimatiche vengono caricate in
4 diversi pozzetti di un gel ad alta risoluzione
di poliacrilammide e urea per poter separare
le varie molecole di DNA che differiscono tra
loro in lunghezza anche per una singola base.
La matrice di poliacrilammide, di solito al 68%, garantisce l’alto potere risolutivo mentre
l’urea 8 molare serve per creare la condizione
denaturante,
denaturante necessaria per minimizzare la
formazione di strutture secondarie del DNA
che
interferiscono
con
la
mobilità
elettroforetica delle molecole
Il metodo di Sanger: l’autoradiografia
Lettura e trascrizione
manuale della sequenza
polylinker di M13mp7
innesco
La reazione di sintesi inizia
sempre nello stesso punto
indipendentemente dal sito
di restrizione utilizzato per il
clonaggio
E’ possibile sequenziare anche una qualsiasi molecola di DNA a doppio filamento purchè
si abbia a disposizione un primer complementare a uno dei due filamenti che funga da
innesco per la reazione di sintesi. In tal caso il DNA va denaturato prima della reazione
Se la molecola è clonata in un vettore, si possono utilizzare sequenze del vettore stesso
che si trovano a monte e a valle del polylinker (primer universali: T3, T7 SP6). Se il DNA è
amplificato per PCR, si può utilizzare come innesco uno dei due primer utilizzati
nell’amplificazione (primer specifici)
Il sequenziamento automatico del DNA
Ogni dideossinucleotide è marcato
con
un
diverso
colorante
fluorescente in modo che i
frammenti di DNA terminati da
differenti
ddNTP
emetteranno
fluorescenza ad una diversa
lunghezza d’onda
Il vantaggio principale del sequenziamento
automatico è la rapidità poiché gli attuali
sequenziatori:
1. utilizzano dei capillari di vetro sottili che
permettono di caricare e analizzare 96
campioni simultaneamente
2. sono sistemi automatizzati. Tutti i
sequenziatori automatici posseggono
programmi per l’analisi dei dati ottenuti:
convertono i segnali di fluorescenza in
sequenza di DNA
Elettroferogramma
Accuratezza della sequenza
La lunghezza massima che si può sequenziare con una
singola reazione è di circa 1000 nucleotidi, tuttavia dopo le
prime 400 basi la frequenza di errori aumenta.
L’accuratezza media per ogni singola corsa è del 98-99 %.
Per migliorare il grado di accuratezza è necessario
sequenziare più volte la stassa regione di DNA,
preferibilmente da cloni diversi
SEQUENZIAMENTO
DI INTERI GENOMI
E
IL PROGETTO
GENOMA UMANO
Obiettivi del Progetto Genoma Umano
1 Ottobre 1990
• Determinare la sequenza dell’intero genoma umano e di
altri organismi comunemente usati negli studi genetici
• Identificare tutti i geni umani
• Immagazzinare le informazioni in banche dati pubbliche
• Sviluppare strumenti per l’analisi dei dati
• Affrontare aspetti di ordine etico, legale e sociale che
potrebbero sorgere dalla realizzazione del progetto
genoma
…..con il progetto genoma umano nasce la GENOMICA
• Genomica strutturale
per mappare e sequenziare interi genomi
• Genomica funzionale
per analizzare la funzione dei geni e delle sequenze non geniche
• Genomatica comparativa
per confrontare i genomi interi di specie diverse
Sequenziamento di interi genomi con il
metodo shotgun
Per
genomi
di
piccole dimensioni
(virali e batterici)
Per
genomi
più
complessi (eucarioti
superiori)
• Costruzione di una genoteca con frammenti casuali e parzialmente sovrapponibili
• Sequenziamento casuale dei cloni
• Assemblaggio delle sequenze contigue con sofisticati software
Banche dati di sequenze
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ensembl.org/
MUTAGENESI
MIRATA
Mutagenizzare vuol dire introdurre mutazioni nella
sequenza nucleotidica di un gene o di una sequenza
regolativa.
Le mutazioni che vengono introdotte più frequentemente
in una molecola di DNA quando si lavora in vitro sono
sostituzioni,
sostituzioni delezioni e inserzioni di singoli o pochi
nucleotidi.
Perché mutagenizzare?
1) Per effettuare analisi funzionali dei geni e delle
sequenze regolative
2) Per modificare le proteine
™ Mutagenesi a cassetta
™ Mutagenesi per estensione di un primer
™ Mutagenesi per PCR
Mutagenesi a cassetta
Vantaggio: efficienza di mutagenesi vicina al 100%
Svantaggio: necessità di siti unici di restrizione ai lati della regione da
mutagenizzare
Mutagenesi per
estensione di un primer
Svantaggi
‰ Il DNA deve essere a singolo filamento
‰ Efficienza di mutagenesi bassa (~10%)
per selezione negativa della molecola
mutata non metilata da parte del sistema
cellulare di riparo del DNA
‰ I saggi per il riconoscimento dei fagi
mutanti sono laboriosi
Mutagenesi per PCR
Vantaggio: efficienza
di mutagenesi vicina
al 100%
Svantaggio: bassa
fedeltà replicativa
delle Taq polimerasi