Sorveglianza di laboratorio di infezioni antibioticoantibioticoresistenti: Caratterizzazione fenotipica e genotipica
di specie batteriche antibioticoantibiotico-resistenti responsabili
di infezioni invasive in Italia (2006(2006-2008)
Anno finanziamento 2004
N° 61
Annalisa Pantosti, Fabio D’
D’Ambrosio, Monica Monaco, Romina Camilli, Maria Del Grosso.
Grosso.
Dipartimento di Malattie infettive, parassitarie ed immunomediate,
immunomediate, Istituto Superiore di Sanità
Sanità, Roma
OBIETTIVI
METODI
RISULTATI
L’obiettivo dello studio è stato quello di ottenere una
caratterizzazione
delle
principali
specie
patogene
antibiotico-resistenti responsabili di infezioni invasive
(meningiti e/o sepsi) allo scopo di descrivere la circolazione
e l’andamento in Italia di particolari gruppi clonali.
E’ stato chiesto ai 39 laboratori partecipanti alla rete
per la sorveglianza dell’antibiotico-resistenza AR-ISS di
inviare in ISS: 1. tutti i ceppi di Streptococcus
pneumoniae isolati da sangue o liquor; 2. i ceppi delle
specie Enterococcus faecalis ed Enterococcus faecium
isolati da sangue e resistenti alla vancomicina (VRE); 3.
un campione (10 ceppi per laboratorio) di ceppi di
Staphylococcus aureus sensibili (MSSA) o resistenti alla
meticillina (MRSA) isolati da sangue. Per tutte le specie
sono stati eseguiti saggi fenotipici per confermare
l’identificazione, la sensibilità agli antibiotici e, ove
opportuno, il sierotipo e a studi molecolari per la
rilevazione dei geni di resistenza (mediante PCR) e per
la tipizzazione molecolare mediante Pulsed Field Gel
Electrophoresis(PFGE), Multi Locus Sequence Typing
(MLST) o spa typing..
Nel periodo Gennaio 2006 – Aprile 2008 39
laboratori
partecipanti
alla
rete
di
sorveglianza dell’antibiotico-resistenza ARISS hanno inviato ceppi: 32 laboratori hanno
inviato ceppi di S.pneumoniae, 8 laboratori
hanno inviato ceppi di Enterococcus faecalis /
faecium, 17 laboratori hanno inviato ceppi di
S. aureus.
Distribuzione sul territorio
dei laboratori partecipanti
Streptococcus pneumoniae
Sono stati inviati 242 ceppi di S. pneumoniae: 171 (70,1%) ceppi
da sangue, 55 (22,7%) da liquor, 3 (1,2%) da altri materiali e 13
(5,4%) non noto (Fig.1).
33 (13,6%) ceppi provenivano da bambini <5 anni e 73 (30,2%)
da anziani >65 anni.
Il 14% dei ceppi è risultato non sensibile alla penicillina, ed il
35.5% resistente alla eritromicina (Fig.2).
La maggior parte dei ceppi resistenti ai macrolidi presentavano il
gene ermB (Fig.3).
Nella popolazione generale i sierotipi più frequenti sono risultati: 14 (12%), 3 (10,4%), 1 (9,7%) e
19A (9,4%)(Fig.4).
Nei bambini <5 anni i sierotipi più frequenti sono risultati: 14 (28,8%), 19A ( 12,1%), 1 (7,6%) e 7F
( 7,6%) (Fig.5).
Nei bambini <5 anni la percentuale di sierotipi vaccinali (VS) cioè contenuti nel vaccino eptavalente
(PCV7) è diminuita rispetto a quanto osservato prima dell’introduzione del vaccino (Fig.6).
I ceppi resistenti alla penicillina e/o multiresistenti analizzati tramite PFGE e MLST appartenevano a
un numero limitato di cloni antibiotico-resistenti a diffusione globale: Spain9V-3 (30,4%), Sweden15A-25
(30,4%), Denmark14-32 (17,4%), England14-9 (13%), Spain23F-1 (4,3%) e Netherlands3-31 (4,3%).
Fig.1
Fig.3
Fig. 5
Fig. 2
Fig. 6
Fig. 4
*
E
A
= sierotipi PCV7
= altri sierotipi PCV13
* = 10°,15B/C, 20, 33F, 38, nt
= sierotipi non vaccinali (NVS)
= sierotipi correlati al vaccino (VR)
Enterococcus faecalis/faecium
= sierotipi vaccinali (VS)
L’analisi dei profili elettroforetici ottenuti mediante PFGE ha
evidenziato:
• In E. faecalis, una
maggiore omogeneità genotipica
rispetto a quanto osservato in passato;
• In E.faecium sono risultati distinguibili 8 pulsotipi
(Tab.2), prevale nettamente il pulsotipo A (Fig.2), che
include 26 ceppi portatori del gene vanA, isolati in
laboratori dislocati in diverse regioni italiane.
Questo
pulsotipo individua un clone già identificato in Italia
durante precedenti sorveglianze.
Dalla sorveglianza AR-ISS risulta che in Italia la resistenza
alla vancomicina è ca. 4% in E. faecalis e 20% in E.
faecium. Sono stati inviati in ISS 43 VRE, 37 E. faecium e 6
E. faecalis. Mediante PCR multipla (Fig.1), sono stati
identificati i geni specie-specifici e i geni van che
conferiscono resistenza alla vancomicina: il gene più
comune è risultato essere vanA e solo in 4 ceppi E. faecium
era presente il gene vanB (Tab.1).
M
1
2
3
4
c1
c2
c3
M
1 2
3
4
5 6
7
8
kb
291
194
145
97
48.5
Fig. 2. PFGE di E.faecium con
pulsotipo A. 1-8, ceppi in
studio; M, marker lambda.
Tab. 2. Caratteristiche di 37 E. faecium
Pulsotipo
A
B
C
D
E
F
G
H
E.faecalis
vanA
vanB
E.faecium
Fig.1. PCR multipla.
1-4, ceppi in studio; c1c3, controlli; M, marker
di peso molecolare.
Tab.1. Geni di resistenza alla vancomicina
N° ceppi
vanA+
N° Ceppi
vanB+
6
-
6
E. faecium
33
4
37
Totale
39
4
43
Ceppo Anno
AE67
AE89
Area
geografica
2006
C
2006
N
Gene atpA
van
vanA 15
vanA
1
AE01
AE12
2001
2002
vanA
vanB
C
N
ddl
15
37
gdh purk gyd pstS adk
MLST
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
1
1
ST78
ST202
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
ST78
ST209
La maggior parte dei ceppi E. faecium circolanti in
Italia nel periodo 2006-2007, come già in
precedenza nel periodo 2001-2003, appartengono
Mediante MLST, realizzata su 2 isolati rappresentativi del
al complesso clonale CC17 che comprende ceppi
clone prevalente, sono stati identificati i relativi ST, ST78 e
da epidemie ospedaliere con diffusione mondiale.
ST202 di cui il primo già identificato in precedenza in Italia
(Tab.3).
N° Totale ceppi
E. faecalis
Tab. 3. MLST di E. faecium
N° ceppi
Lab.
Gene di resistenza
26
IT14, IT19, IT31, IT62, IT70
vanA
2
IT59
vanA
2
IT59
vanA, vanB
1
IT14
vanA
1
IT19
vanA
2
IT59
vanA
1
IT12
vanB
2
IT19
vanB
Staphylococcus aureus
Sono stati sottoposti a tipizzazione molecolare mediante spa typing 147 ceppi di S. aureus isolati da batteriemie, di cui 81 MSSA e 66 MRSA. Tra gli MRSA, che in Italia
presentano una delle percentuali di resistenza alla meticillina più alte (40%) se confrontate a livello europeo, sono stati identificati 14 spa type diversi, di cui i più frequenti
sono stati t041 (23 ceppi) e t008 (19 ceppi) (Tab.1-2). Lo spa type t041 include ceppi tipicamente ospedalieri, multiresistenti, alcuni con resistenza intermedia (VISA) o
eterogenea (etero-VISA) alla vancomicina. Lo spa type t008 include ceppi meno antibiotico-resistenti con caratteristiche simili agli MRSA comunitari, anche se privi dei geni
per la tossina di Panton-Valentine (Tab.3).
FIG 1. Distribuzione delle MIC in MSSA e MRSA
Tab 1. Tipi spa in MSSA e MRSA
Tab 2. MRSA: Correlazione tra tipi spa ed SCCmec
N° MSSA
N° Totale
t001
9
0
9
t002
0
2
2
t008
19
0
19
t012
0
6
6
t015
0
4
4
t021
0
2
2
t024
1
1
2
t030
1
0
t032
1
1
t041
23
t084
0
t091
0
8
8
t159
0
2
2
t179
0
2
2
t242
3
0
3
t267
0
Tipo Spa
9
I
Vancomicina
40
6
12
1
IV
IVA
I
t041
21
1
1
I
IV
IVA
1
t242
3
II
2
t515
3
IV
0
23
Altri
9
I, IA, IIIvar IV, IVA
8
8
2
Teicoplanina
50
t008
30
20
10
0
0,5
0,75
1
1,5
2
3
35
30
25
20
15
10
5
0
0,25
0,38
0,5
%MSSA
MSSA: MIC50 =MIC90 = 1.5 mg/ml
MRSA: MIC50 = 1.5 mg/ml
mg/ml
0,75
1
1,5
2
3
4
M IC (µ
µµ g/ml)
MIC (µ
µ g/ml)
%MRSA
MIC90 = 2
%MRSA
%MSSA
MSSA: MIC50 = 1 mg/ml
MIC90 = 1.5 mg/ml
MRSA: MIC50 = 1.5 mg/ml
MIC90 = 3 mg/ml
MSSA: nessun ceppo con sensibiltà intermedia alla vancomicina (VISA)
Tab 3. Percentuale di resistenza agli antibiotici
nei tipi spa più frequenti tra gli MRSA
2
MRSA: 3 ceppi con sensibilità intermedia alla vancomicina (VISA)
FIG 2. Screening per l’identificazione di ceppi con resistenza eterogenea (etero-VISA)
% DI CEPPI RESISTENTI A:
3
0
3
Tipi nuovi
2
8
10
4
35
39
t041
66
81
147
t008
totale
Tipo SCCmec
t001
t515
Altri
N° di isolati
% s tra in s
N° MRSA
% strains
Tipo spa
Tipo Spa
SCCmec
RIFA
CIPRO
ERITRO
CLINDA
I
22
100
100
100
100
5
100
42
52
52
IV - IVA
GENTA
MSSA: nessun ceppo etero-VISA
MRSA: 13 ceppi etero-VISA
CONCLUSIONI
Questo studio ha dimostrato che per quanto riguarda i principali patogeni batterici gram-positivi ospedalieri (S. aureus, Enterococcus spp.) o comunitari (S. pneumoniae) la
resistenza ai principali antibiotici si mantiene ai livelli osservati in passato. Per questi patogeni la diffusione dell’antibiotico-resistenza è legata all’espansione di cloni
antibiotico-resistenti circolanti nel paese e spesso a diffusione mondiale.
