ASSOCIAZIONE E MAPPATURA GENETICA NEGLI EUCARIOTI

Principi di genetica - Robert J. Brooker
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SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 20
Domande concettuali
C1. Si potrebbe concludere che la donna porta una delezione nel gene che è riconosciuto dalla sonda. Per clonare
questo gene, potresti iniziare con un marcatore conosciuto che risulta vicino alla banda p11, e spostarti (per
chromosome walking) nell'altra direzione. Questo esperimento verrebbe eseguito sul DNA derivante da una
persona sana, e confrontato con il DNA della persona descritta nel problema. A un certo punto si incontrerà un
clone che nella persona con la malattia contiene una delezione, ma il DNA sarebbe presente in una persona sana.
Questo frammento di DNA nella persona sana dovrebbe ibridare anche con la sonda.
C2.
A. Sì
B. No; questo è solamente un cromosoma nel genoma
C. Sì
D. Sì
C3. Quali delle seguenti affermazioni riguardanti i marcatori molecolari sono vere?
A. Falso, essi non portano geni.
B. Vero
C. Falso, il marcatore non porta un gene che influisce sul fenotipo.
D. Vero
E. Vero
Domande sperimentali
S1. A. Mappatura citogenetica
B. Mappatura di associazione
C. Mappatura fisica
D. Mappatura citogenetica
E. Mappatura di associazione
F. Mappatura fisica
S2. Essi sono complementari.
S3. L'ibridazione in situ è un metodo citogenetico di mappatura. Una sonda complementare a una sequenza
cromosomica viene usata per localizzare il gene mediante il microscopio all'interno di una miscela di molti
cromosomi diversi. Perciò, essa può essere usata per mappare citologicamente la localizzazione di una sequenza
genica. Quando viene impiegata più di una sonda, è possibile determinare l'ordine dei geni lungo un particolare
cromosoma.
S4. Siccome le cellule normali contengono due copie del cromosoma 14, ci si aspetterebbe che una sonda ibridi con
le sequenze di DNA complementari su entrambi i cromosomi. Se la sonda riconosce solamente uno dei due
cromosomi, questo potrebbe significare che una copia del cromosoma 14 sia stata persa, oppure che essa abbia
subito una delezione nella regione complementare alla sonda. Rispetto al cancro, la perdita di questo materiale
genetico può essere in relazione alla crescita cellulare incontrollata.
S5. Il termine fissazione si riferisce alle procedure che arrestano chimicamente le cellule e ne impediscono la
degradazione. Dopo la fissazione, le cellule non variano in morfologia. In un certo senso, esse sono congelate in
un determinato posto. Per un esperimento di FISH, questa procedura mantiene vicini tra loro tutti i cromosomi
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all'interno di una cellula; essi non possono spostarsi all'interno del vetrino e mescolarsi con i cromosomi di altre
cellule. Perciò, quando osserviamo un gruppo di cromosomi in un esperimento di FISH, questo gruppo di
cromosomi deriva da una singola cellula.
È necessario denaturare il DNA cromosomico per permettere il legame della sonda al DNA. La sonda è un
segmento di DNA complementare al DNA di interesse. I filamenti di DNA cromosomico devono essere separati
(cioè denaturati) in modo che la sonda possa legare le sequenze complementari.
S6. Dopo che le cellule e i cromosomi sono stati fissati ai vetrini, è possibile aggiungere due o più sonde diverse che
riconoscano diverse sequenze (quindi siti diversi) all’interno del genoma. Ogni sonda ha una diversa lunghezza
d’onda di emissione della fluorescenza. Solitamente, un ricercatore usa dei programmi informatici di analisi di
immagine che riconoscono la lunghezza d’onda di ogni sonda e assegnano a ciascuna un colore. Il colore visto
dal ricercatore non è il reale colore emesso dalla sonda; esso è un colore secondario assegnato dal computer. In un
certo senso, le sonde, con l’aiuto del computer, sono “verniciature” delle regioni cromosomiche riconosciute da
una sonda: un esempio di chromosome painting è illustrato nell’approfondimento web 20.1. In questo esempio, il
cromosoma 5 umano è colorato con sei diversi colori.
S7. Se il campione è stato ottenuto da un individuo sano, si osserverebbero due segnali (uno in ciascuna copia del
cromosoma 21). Si osserverebbero tre segnali se il campione fosse stato ottenuto da una persona con la sindrome
di Down, perché la persona ha tre copie del cromosoma 21.
S8. Un contig è una collezione di cloni che contengono segmenti sovrapposti di DNA corrispondenti a una
particolare regione di un cromosoma. Per determinare se due cloni sono sovrapposti, è possibile eseguire un
esperimento di Southern blot. In questo approccio, uno dei cloni viene usato come sonda. Se esso è sovrapposto
con il secondo clone, in un Southern blot esso ibriderà con il primo. Per cui, il secondo clone viene fatto correre
su gel, e il primo clone viene impiegato come sonda. Se la banda corrispondente al secondo clone viene marcata,
questo significa che i due cloni sono sovrapposti.
S9. Un vettore BAC può contenere frammenti estremamente grandi di DNA, quindi esso viene impiegato in un primo
passaggio per allineare segmenti di DNA in uno studio di mappatura fisica. Tuttavia, è difficile lavorare con
questi vettori nel subclonaggio e negli esperimenti di sequenziamento del DNA. I cosmidi, per confronto,
contengono segmenti più piccoli di genoma. Le localizzazioni dei cosmidi possono essere determinate ibridandoli
a vettori BAC. I cosmidi possono essere usati per il subclonaggio e nel sequenziamento del DNA.
S10. I vettori di clonaggio BAC hanno proprietà di replicazione tipiche dei cromosomi batterici e proprietà di
clonaggio dei plasmidi. Per replicarsi come un cromosoma, un vettore BAC possiede un’origine di replicazione
derivante dal fattore F. Perciò, in una cellula batterica, il BAC può comportarsi come un cromosoma. Come un
plasmide, i BAC possiedono anche dei marcatori di selezione e degli opportuni siti di clonaggio per l’inserzione
di grandi segmenti di DNA. Il principale vantaggio è la possibilità di clonare frammenti di DNA molto grandi.
S11. Un polimorfismo si riferisce alla variabilità genetica in un particolare locus all'interno di una popolazione. Se il
polimorfismo si verifica all'interno delle sequenze geniche, si parla di variabilità allelica. Un polimorfismo può
verificarsi anche all'interno dei marcatori genetici come è il caso degli RFLP. Le basi molecolari per un RFLP
sono le differenze nelle sequenze di DNA di due individui distinti, e alcune di esse possono influire sulle
localizzazioni relative dei siti riconosciuti dagli enzimi di restrizione. Siccome questo si presenta relativamente di
frequente tra due individui non consanguinei, è possibile identificare molti RFLP. Essi possono essere
riconosciuti mediante digestione con enzimi di restrizione e separazione tramite elettroforesi su gel e Southern
blotting. Essi sono utili negli studi di mappatura perché è relativamente facile identificarne molti lungo un
cromosoma, dove fungono da punti di riferimento nelle mappe genetiche. In questo contesto, essi possono essere
impiegati nel clonaggio genico come punti di partenza per un chromosome walking.
S12. Il gene per la resistenza sembra essere associato all’RFLP 4B.
S13. Se i geni non erano associati, ci aspetteremmo un rapporto 1:1:1:1 tra le quattro combinazioni di progenie. In un
totale di 272 individui, ci aspetteremmo 68 individui della progenie in ciascuna categoria, in accordo con
l'assortimento indipendente.
χ2 = Σ (O – E)2/ E
χ2 = [(40 – 68)2/ 68] + [(98 – 68)2/ 68] + [(97 – 68)2/ 68] + [(37 – 68)2/ 68]
χ2 = 51,2
Con 3 gradi di libertà, questo elevato valore di chi quadrato si verificherebbe per caso solamente in meno dell'1%
dei casi. Perciò, rifiutiamo l'ipotesi che gli RFLP assortiscano in modo indipendente.
In questo esempio, la progenie ricombinante contiene gli RFLP 5200, 4500, e 2100 e 4500, 2100, e 3200
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Distanza di mappa = (40 + 37)/ (40 + 98 + 97 + 37) x 100
Distanza di mappa = 28,3 u.m.
S14. Per la maggior parte degli organismi, è solitamente facile localizzare molti RFLP distribuiti lungo il genoma. Gli
RFLP possono essere usati come marcatori molecolari per costruire una mappa del genoma. Questo viene
eseguito seguendo la strategia descritta nella Figura 20.4. Per mappare un gene funzionale, si seguirebbe la stessa
strategia generale descritta nella Figura 20.4, eccetto che i due ceppi porterebbero anche una differenza allelica
nel gene di interesse. Il ricercatore dovrebbe eseguire degli incroci, come incroci tra diibridi, e determinare nella
progenie il numero degli individui parentali e ricombinanti sulla base degli alleli e degli RFLP ereditati. Se un
allele e un RFLP sono associati, ci sarà una percentuale molto inferiore (cioè inferiore al 50%) di progenie
ricombinante.
S15. I figli 1 e 3 sono attribuibili al padre 2; i figli 2 e 4 appartengono al padre 1; il figlio 5 potrebbe appartenere a uno
dei due padri.
S16. Risultato dedotto
S17. Una spiegazione è che il tasso di ricombinazione tra i cromosomi omologhi è diverso durante l'oogenesi rispetto
alla spermatogenesi. La mappatura fisica misura la distanza reale (in bp) tra i marcatori. La mappatura fisica dei
cromosomi nei maschi e nelle femmine rivela che essi sono della stessa lunghezza. Perciò, le dimensioni dei
cromosomi nei maschi e nelle femmine sono identiche. Le differenze ottenute nelle mappe di associazione sono
dovute alle differenze nei tassi di ricombinazione durante l'oogenesi rispetto alla spermatogenesi.
S18.
A. Un omologo contiene STS-1 da 289 bp e STS-2 da 422 bp, mentre l’altro omologo possiede STS-1 da 211 bp
e STS-2 da 115 bp. Questo è basato sull’osservazione che 28 spermatozoi hanno le bande da 289 bp e da 422
bp oppure le bande da 211 bp e da 115 bp.
B. Ci sono due spermatozoi ricombinanti; vedi le corsie 12 e 18. Dato che ci sono due spermatozoi ricombinanti
su un totale di 30,
distanza di mappa = 2 / 30 x 100 = 6,7 u.m.
C. In teoria, questo metodo potrebbe essere usato. Tuttavia, in uno spermatozoo non c’è sufficiente DNA per
eseguire un’analisi degli RFLP a meno che il DNA non venga amplificato mediante PCR.
S19. Essi sembrano essere associati. Se non fossero associati, ci aspetteremmo uguali quantità dei quattro tipi di
progenie. Tuttavia, come si osserva nei dati, vi è una proporzione molto maggiore di combinazioni parentali
(rossi, piccoli e porpora, grandi) rispetto alle combinazioni non parentali. La distanza di mappa è
Distanza di mappa = (111 + 109)/ (725 + 111 + 109 + 729) x 100 = 13,2 u.m.
Rispetto all'eredità degli RFLP, sono attesi i seguenti risultati:
725 fiori rossi e piccoli con RFLP 4000 bp e 1600 bp
111 fiori grandi e rossi con RFLP 4000 bp e 7200 bp
109 fiori porpora e piccoli con RFLP 3400 bp e 1600bp
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729 fiori porpora e grandi con RFLP 3400 bp e 7200 bp
S20. Una possibilità è che il genetista provi a usare un diverso enzima di restrizione. Forse c’è una variazione della
sequenza in prossimità del gene per la resistenza ai pesticidi che influisce sul pattern di digestione di un enzima di
restrizione diverso da EcoRI. Ci sono centinaia di enzimi di restrizione differenti che riconoscono una miriade di
sequenze diverse.
Alternativamente, il genetista potrebbe abbandonare l’approccio degli RFLP e provare a identificare uno o più siti
di sequenze sequenza etichettata (STS) che si trovano vicino al gene per la resistenza ai pesticidi. In questo caso,
il genetista desidererebbe identificare gli STS che siano anche microsatelliti. Come illustrato nella Figura 20.6,
negli incroci genetici è possibile seguire la trasmissione dei microsatelliti . Perciò, se il genetista potesse
identificare i microsatelliti in prossimità del gene per la resistenza ai pesticidi, questo darebbe la possibilità di
prevedere il risultato degli incroci. Per esempio, supponiamo che un microsatellite associato al gene per la
resistenza ai pesticidi esista in tre forme: 234 bp, 255 bp, e 311 bp. Supponiamo anche che la forma da 234 bp sia
associata all’allele per l’elevata resistenza, la forma da 255 bp sia associata all’allele per la resistenza moderata, e
la forma da 311 bp sia associata all’allele che determina un basso grado di resistenza. Secondo questo esempio
ipotetico, il genetista potrebbe predire il livello della resistenza di una pianta di erba medica analizzando
l’ereditarietà di questi microsatelliti.
S21. I risultati attesi sarebbero stati uguali quantità dei quattro profili di RFLP. Ci sarebbero stati circa 25 di ciascuno
dei quattro tipi.
S22. Quando il DNA cromosomico viene isolato e digerito con un enzima di restrizione, si ottengono migliaia di
frammenti di DNA di dimensioni diverse. Questo rende impossibile identificare una particolare banda su gel dopo
una semplice colorazione per rivelare il DNA. Il Southern blot permette di identificare uno o più RFLP
complementari alla sonda radioattiva usata.
S23. Oltre a un marcatore selezionabile e un'origine di replicazione attiva in E. coli, i vettori YAC necessitano anche di
due sequenze telomeriche, un centromero, e una sequenza ARS. I telomeri sono necessari per impedire
l'accorciamento delle estremità del cromosoma artificiale. Il centromero è necessario per la corretta segregazione
del cromosoma artificiale durante la meiosi e la mitosi. La sequenza ARS di lievito è l'equivalente dell'origine di
replicazione, necessaria per la replicazione del DNA dello YAC.
S24. Sulla base di questi risultati, è probabile che l’allele per l’anemia falciforme si sia originato in un individuo con
RFLP da 13 kb. Questo spiegherebbe perché l’allele HbS sia solitamente trasmesso con l’RFLP da 13 kb. In
alcuni casi, tuttavia, si verifica un crossing-over nella regione compresa tra il gene per la β-globina e il sito distale
HpaI.
Dopo il crossing-over, l’allele HbS risulta associato all’RFLP da 7,6 kb.
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S25. Il frammento di 13 kb non è sempre associato all'allele HbS perché in rari casi avviene un crossing-over tra il sito
di restrizione e l'allele. Tuttavia, nella popolazione umana il frammento di 13 kb è solitamente associato all'allele
HbS. Perciò, se una persona è eterozigote per il frammento di 13 kb, questa avrà una maggiore probabilità di
essere portatore eterozigote per l'allele HbS. Questa informazione può essere utile per predire la probabilità di
avere un figlio malato.
S26. La PFGE è un metodo elettroforetico che viene utilizzato per separare piccoli cromosomi e grandi frammenti di
DNA. L’apparecchio elettroforetico usato in questo caso ha due corredi di elettrodi, che producono impulsi di
corrente alternati facilitando la separazione dei grandi frammenti di DNA (Approfondimento web 20.3).
È importante trattare con cura il campione per prevenire la rottura del DNA dovuta a forze meccaniche. Le cellule
vengono dapprima inglobate in blocchetti di agarosio, e poi i blocchetti vengono caricati nei pozzetti di un gel.
L’agarosio mantiene il campione molto stabile e ne impedisce la rottura meccanica. Successivamente le cellule
all’interno dei blocchi vengono lisate, e, se desiderato, possono essere aggiunti gli enzimi di restrizione per
digerire il DNA. Per la PFGE, deve essere usato un enzima di restrizione che tagli sporadicamente.
La PFGE può essere utilizzata come tecnica preparativa per isolare e purificare cromosomi oppure grandi
frammenti di DNA. La PFGE può essere anche usata, in associazione con il Southern blot, come tecnica per la
mappatura.
S27. L'ordine corretto è: A, C, D, B.
1. Clonare i grandi frammenti di DNA per costruire una libreria di BAC.
2. Subclonare i frammenti BAC per costruire una libreria cosmidica.
3. Subclonare i frammenti cosmidici per il sequenziamento del DNA.
4. Determinare la sequenza di DNA dei subcloni da una libreria cosmidica.
S28. Nota che l’inserto del cosmide B è contenuto interamente all’interno dell’inserto del cosmide C.
S29. Un sito di sequenza etichettata (STS) è un segmento di DNA, solitamente abbastanza breve (cioè lungo dalle 100
alle 400 bp), che rappresenta un sito unico nel genoma. Gli STS vengono identificati usando dei primer in una
reazione di PCR. Gli STS costituiscono dei marcatori molecolari negli studi di mappatura genetica. Talvolta, la
regione compresa in un STS può contenere un microsatellite. Un microsatellite è un breve segmento di DNA di
lunghezza variabile, solitamente costituito da una breve sequenza ripetuta. Quando un microsatellite si trova
all'interno di un STS, la lunghezza dell'STS sarà variabile tra individui diversi, oppure lo stesso individuo potrà
essere eterozigote per l'STS. Questo rende l'STS polimorfico. Gli STS polimorfici possono essere usati nelle
analisi di associazione perché la loro trasmissione può essere seguita nei pedigree e negli incroci tra organismi da
laboratorio.
S30.
A. La strategia generale è illustrata nella Figura 20.12. Il ricercatore parte da un certo sito e poi “cammina” verso
il gene di interesse. Si parte con un clone che presenta un marcatore che mappa relativamente vicino al gene di
interesse. Una porzione del DNA alla fine dell’inserto viene subclonata e usata in un Southern blot per
identificare un clone adiacente all’interno di una libreria cosmidica. Questo è il primo “passo”. L’estremità di
questo clone viene subclonata per proseguire con il passaggio successivo, e così via. Alla fine, dopo molti
passaggi, arriverai al gene di interesse.
B. In questo esempio, inizi a livello di STS-3. Se eseguiti dopo qualche alcuni passaggi o venisse identificato
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STS-2 sapresti di avere proseguito nella direzione sbagliata.
C. Questo è un aspetto difficile del chromosome walking. Sostanzialmente, dovresti proseguire verso il gene X
usando il DNA di un individuo normale e il DNA di un individuo con il gene X mutante. Quando identifichi un
sito in cui le sequenze dell’individuo normale e mutante sono diverse, è possibile che tu abbia identificato il
gene X. Dovrai infine confermare questo dato analizzando la sequenza nucleotidica di questa regione e
dimostrare che essa contiene un gene funzionale.
S31. La prima informazione da cui partire è la localizzazione di un gene oppure di un marcatore che risulta vicino al
gene di interesse da precedenti studi di mappatura. Dovresti iniziare da un clone contenente questo gene (o
marcatore) e seguire la procedura del chromosome walking per raggiungere il gene di interesse. Un contig rende
questa procedura molto più semplice perché non dovrai eseguire una serie di esperimenti di subclonaggio per
raggiungere il gene. Invece, potrai semplicemente analizzare i membri del contig.
S32. Possiamo calcolare la probabilità che una base non venga sequenziata usando questo approccio mediante la
seguente equazione:
P = e–m
dove
P è la probabilità che una base non sia sequenziata
e è la base del logaritmo naturale; e = 2,72
m è il numero delle basi sequenziate diviso per la dimensione totale del genoma
In questo caso m = 19 diviso per 4,4, che equivale a 4,3
P = e–m = e–4,3 = 0,0136 = 1,36%
Questo significa che se venissero sequenziate casualmente 19 Mb, sarebbero omesse le sequenze pari all’1,36%
del genoma. Con un genoma di 4,4 Mb, non sarebbero sequenziate circa 57 840 coppie di basi su circa 4 400 000.
S33. Nell'approccio gerarchico, il genoma viene mappato per creare un contig di YAC o di BAC per ciascun
cromosoma. Gli inserti di ciascun contig vengono poi sottoposti al sequenziamento shotgun. Al contrario,
nell'approccio del sequenziamento shotgun dell’intero genoma, il passaggio della mappatura viene eliminato.
Invece, l'intero genoma viene ridotto in piccoli frammenti, che vengono sequenziati a partire da entrambe le
estremità. Quest'ultimo metodo è più veloce perché elimina la fase di mappatura, che può richiedere molto tempo.