Quorum sensing definitivo 27 08 2007

Quorum sensing microbico e igiene degli alimenti
Valerio Giaccone
Dipartimento di “Sanità pubblica, Patologia comparata e Igiene veterinaria”, Facoltà
di Medicina veterinaria, Università degli Studi di Padova.
1. PREMESSA
I batteri sono esseri viventi come tutti gli altri, solo un po’ meno complessi come
struttura. Per decenni sono stati visti come esseri viventi molto individualisti che
conducono la loro esistenza come singole cellule libere in un mezzo, alla costante
ricerca di nutrienti per sopravvivere e, se ci sono le possibilità, riprodursi. In realtà
oggi sappiamo che i batteri fanno parte di una società piuttosto complessa e che
sono in grado di comunicare fra loro. Non si può dire che parlino o cantino, così come
accade all’uomo o come fanno (in modo più elementare) delfini e balene, ma certo si
scambiano informazioni rilasciando nell’ambiente una serie di messaggi che i loro
consimili percepiscono.
Per esempio, i batteri periodicamente fanno il censimento della popolazione e tastano
il terreno, ossia verificano praticamente in tempo reale le condizioni dell’ambiente
che li circonda, sia esso l’ambiente esterno o l’interno di un essere animato come una
pianta, un animale o l’uomo stesso.
In questo contesto i batteri producono e rilasciano nell’ambiente circostante alcuni
composti chimici specifici che fungono da trasmettitori del messaggio; altri batteri li
captano, li interpretano e rispondono producendo a loro volta dei messaggi, diciamo
così, odorosi.
Nella società dei batteri (o meglio, nell’ambiente in cui una certa popolazione
microbica è inserita) corrono costantemente dei segnali chimici, molecole di piccole
dimensioni simili agli anticorpi e chiamati autoinduttori. Queste molecole si
accumulano al di fuori delle singole cellule microbiche, ma finché la carica microbica
è bassa e diluita nell’ambiente esterno non succede nulla. Quando però la stessa
popolazione si accresce e supera un certo livello (un quorum, visto come numero
legale per una votazione) le molecole che si sono accumulate possono innescare una
serie di eventi che si succedono per lo più con effetto “a cascata” determinando
qualche reazione o qualche effetto. Questo sistema di comunicazione è chiamato,
appunto, quorum sensing. Il quorum sensing, in altri termini, è un sistema complesso
di comunicazione “cellula-cellula” con il quale i batteri sono in grado di comunicare
fra loro.
Grazie a questo sistema i batteri sono capaci di mettere in atto attività coordinate,
una capacità che un tempo si riteneva propria soltanto degli esseri viventi superiori.
Questa capacità di comportarsi come un organismo complesso coordinato ha parecchi
vantaggi per una popolazione microbica, quali la capacità di migrare verso un altro
ambiente dove si trovino migliori condizioni di habitat e di nutrienti o l’adozione di
nuovi modelli di sviluppo che potrebbero costituire una difesa contro le aggressioni
esterne.
Alla luce delle nuove acquisizioni in questo settore si profila all’orizzonte una nuova
disciplina, la “socio-microbiologia” che dovrebbe studiare i comportamenti di una
singola popolazione batterica che funziona come un aggregato coordinato di esseri
viventi e non come un insieme caotico e disordinato di singoli entità (Parsek e
Greenberg, 2005; Gobbetti et al., 2007).
Sfruttando il quorum sensing i batteri possono regolare:
1)
l’emissione di bioluminescenza
2)
la formazione di biofilm sulle superfici di lavoro nelle industrie alimentari
3)
la crescita competitiva tra differenti popolazioni e la sporulazione
4)
la sintesi di antibiotici e di batteriocine
5)
l’induzione di fattori di virulenza nelle piante o negli umani
6)
i processi di infezione degli organismi superiori
7)
la differenziazione di linee cellulari a partire da cellule primigenie.
Il presupposto essenziale perché i microrganismi possano colloquiare fra loro e
coordinarsi nelle loro attività sta proprio nelle concentrazioni dei mediatori chimici del
messaggio nel mezzo in cui i batteri sono immersi. È indispensabile qui ricordare che
i batteri possono essere presenti nell’ambiente in due forme di vita:
a) la forma libera nel mezzo acquoso, definita forma planctonica
b) la forma sessile, adesa a una qualsiasi superficie e immersa in
una matrice amorfa di sostanza organica al cui interno i batteri
possono sopravvivere e moltiplicare. Questo speciale aggregato
di batteri e sostanza organica (EPS Extracellular Polymeric
Substances) è chiamato biofilm.
I biofilm sono un universo in miniatura e per i microrganismi costituiscono un
ambiente di vita in cui la crescita o la riduzione della popolazione microbica è regolata
dal quorum sensing in base alle condizioni più o meno favorevoli del substrato. Come
tali, i biofilm costituiscono un aspetto importante per l’igiene degli alimenti perché è
proprio grazie ai biofilm che batteri alteranti o pericolosi per la salute (come Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus) possono sopravvivere su
superfici di lavoro anche in assenza di nutrienti e resistere all’azione dei disinfettanti.
Inoltre, sempre grazie al quorum sensing all’interno della loro popolazione i batteri
possono modulare la manifestazione di determinate caratteristiche fenotipiche
rispetto ad altre secondo le necessità.
Immersi in un biofilm o liberi nell’ambiente in forma planctonica, i batteri comunicano
fra di loro sintetizzando e liberando nel mezzo dei messaggi di tipo chimico costituiti
da specifici composti. I più conosciuti e studiati sono gli AHL ossia gli acil-omoserinalattoni.
Posto di fronte a un sistema di comunicazione piuttosto complesso che si fonda su
una cascata di reazioni biochimiche e sulle interazioni di geni che codificano questa
sintesi, un igienista degli alimenti, da buon “praticone”, è portati a chiedersi a che
cosa possa servire entrare così a fondo nella vita intima di una comunità batterica, a
cosa serva studiare i sofisticati meccanismi biochimici di comunicazione dei batteri.
L’importanza di una simile conoscenza diventa evidente se ricorriamo, come
paragone, all’esempio dei codici cifrati utilizzati dai Comandi militari giapponesi nella
Seconda Guerra mondiale per emanare ordini alle truppe dislocate lontano dalla
madrepatria. Quando gli Americani riuscirono a decifrare il codice cifrato utilizzato dai
Nipponici, le sorti della guerra si ribaltarono perché i primi riuscirono a inserirsi nelle
comunicazioni del nemico e a scoprire quali fossero i bersagli degli attacchi.
Traslando il concetto, conoscere i meccanismi che regolano la comunicazione tra i
singoli componenti di una popolazione microbica immersa in un biofilm può
permetterci di tenerla meglio sotto controllo e di dominarla, facendo in modo che
quella rallenti il suo sviluppo (come nel caso di germi patogeni o alteranti) o lo
accentui, nel caso di batteri utili nelle fermentazioni microbiche. In questa sede mi
prefiggo soltanto di riassumere i concetti essenziali del quorum sensing rimandando i
lettori ai riferimenti bibliografici citati alla fine del documento per ulteriori
approfondimenti sull’argomento.
È importante sottolineare subito che i batteri possono scambiarsi messaggi sia
all’interno di una stessa specie sia tra generi microbici differenti. Tuttavia, i
meccanismi chimici sui quali si fonda il quorum sensing dei batteri Gram negativi
sono differenti da quelli che permettono ai Gram positivi di comunicare fra loro: in
pratica, i mediatori chimici in gioco non sono gli stessi.
2. QUORUM SENSING DEI BATTERI GRAM NEGATIVI
Il primo meccanismo di quorum sensing scoperto ha riguardato proprio un batterio
Gram negativo, Vibrio fischeri, un batterio bioluminescente che vive come simbionte
negli organi luminosi specializzati di un particolare cefalopode decapode (Euprymna
scolopes) e del pesce Monocentres japonicus. Questo sistema è sempre preso a
paradigma per dare una prima idea e spiegare meglio i meccanismi del quorum
sensing.
Il gene luxI, racchiuso in un operone chiamato luxICDABE, codifica la sintesi di una
specifica sintetasi che a sua volta porta alla sintesi di una molecola specifica, N-(3ossoesanoil)-omoserina lattone (OHHL) che è l’autoinduttore.
Il gene luxR, a sua volta, codifica la produzione di un fattore trascrizionale il quale,
dopo avere interagito con l’autoinduttore prima citato, va a legarsi all’operone
luxICDABE rendendo possibile e attivando la trascrizione di tutti i geni ivi contenuti
che portano alla sintesi di tutti i componenti del sistema luciferasi così come a un
aumento esponenziale della sintesi di LuxI.
Per passare alla forma attiva il trascrittore LuxR richiede la presenza di due distinte
chaperonine, GroEL e GroESL (Adar et al., 1992). In sintesi, quindi, l’autoinduttore fa
sapere a tutti i batteri che essi esistono all’interno di un organo luminescente e che
non sono, invece, immersi nel mare dove sarebbero così dispersi da non potere
creare mai le concentrazioni sufficienti per dare origine al messaggio.
Nei batteri Gram negativi il quorum sensing è mediato dagli acil-omoserina-lattoni
(AHL), la cui sintesi prende le mosse da due differenti gruppi di composti, l’Sadenosil-metionina (SAM) e una proteina acil-acil carrier (acil-ACP).
Il LuxI promuove la formazione di un legame ammidico tra acil-ACP e SAM, e dalle
successive reazioni si origina un AHL. In tutti i segnali sinora individuati le molecole
hanno come denominatore comune proprio l’anello omoserina-lattone (Parsek e
Greenberg, 2005). Le molecole possono poi contenere catene laterali con un numero
di atomi di carbonio che varia tra 4 e 14 e altre piccole differenze strutturali e di
composizione.
La membrana dei batteri Gram negativi è permeabile agli AHL e man mano che la
cellula li sintetizza, li emette nell’ambiente esterno, dove devono avere la possibilità
di accumularsi. Finché le concentrazioni microbiche sono basse l’AHL diffonde
passivamente al di fuori delle singole cellule a causa del gradiente di concentrazione
(maggiore all’interno della cellula e più basso al di fuori di essa). Quando però il
numero di batteri presenti in un ambito piuttosto ristretto comincia a diventare
notevole, la concentrazione di AHL al di fuori delle singole cellule batteriche diventa
presto superiore a quello presente all’interno di ciascuna di esse. A questo punto,
l’AHL deve prima accumularsi all’interno della cellula finché la sua concentrazione
diventa superiore a quella presente all’esterno. Solo a quel punto potrà fuoriuscirne
dell’altro.
Le principali specie batteriche di interesse alimentare in cui è documentata la
presenza di proteine LuxI sono: Vibrio fischeri, Burkholderia cepacia, Enterobacter
agglomerans, Erwinia carotovora, Escherichia coli, Pseudomonas aureofaciens, Ps.
aeruginosa, Ralstonia solanacearum, Salmonella enterica ser. typhimurium, Serratia
liquefaciens, Yersinia enterocolitica.
2.1. QUORUM SENSING E ALTERAZIONI DEGLI ALIMENTI DA BATTERI GRAM NEGATIVI
Con i dovuti distinguo, si può generalizzare ricordando che la flora microbica delle
carni fresche refrigerate in via di putrefazione è costituita essenzialmente da:
(1)
pseudomonadacee che possono arrivare a cariche fino a 109 ufc/g se le
carni sono conservate in aria
(2)
batteri lattici ed enterobatteri (fino a 105-107 ufc/g) nel caso delle carni
confezionate in pellicola plastica sotto vuoto.
Parecchi autori, tra cui cito Jay e coll. (2003) e Medina-Martinez e coll. (2006) hanno
rilevato la presenza di AHL in campioni di carni prelevati direttamente dal circuito
commerciale, pervenendo alla conclusione che batteri quali Pseudomonas possano
formare dei biofilm sulla superficie delle carni alterate e che il quorum sensing sia
uno dei meccanismi che facilitano la formazione di questi biofilm.
È sempre grazie al quorum sensing che i batteri regolano la produzione di enzimi
idrolitici e che coordinano fra loro attività quali la loro mobilità e la colonizzazione di
un substrato. Alla luce di queste considerazioni si è anche ipotizzato che siano proprio
gli AHL a favorire e accentuare la sintesi enzimatica quando la carica microbica degli
enterobatteri raggiunge valori soglia sufficienti, contribuendo alla comparsa di
modificazioni sensoriali sgradevoli nelle carni fresche anche se la CMT non ha ancora
raggiunto valori, diciamo così, “esplosivi” (Gram et al., 1999). In effetti, nella carne si
può riscontrare la presenza evidente di AHL quando la carica ha appena raggiunto le
106 ufc/g, una concentrazione microbica che non è ancora sufficiente per parlare
nelle carni di vera e propria putrefazione.
Fra gli enterobatteri che formano una delle due principali componenti della flora
microbica delle carni fresche confezionate sotto vuoto, predominano Hafnia alvei e
Serratia spp. (Riddel e Korkeala, 1997). Sottoponendo a gascromatografia il
surnatante di colture di ceppi di questi due batteri isolati dalle carni, Bruhn e coll.
(2004) hanno dimostrato che fra tutti gli AHL presenti la molecola più abbondante
era costituita dall’OHHL, molecola citata più sopra.
Anche Yersinia enterocolitica è in grado di sintetizzare degli acil-omoserina-lattoni
come l’OHHL e l’N-esanoil omoserina-lattone, se fatta crescere in estratti di carne e
anche di pesce (Medina-Martinez et al., 2006).
Tutto ciò ha portato Hentzer e coll. (2003) a ipotizzare che in futuro si potrebbe
aumentare la conservabilità delle carni e dei prodotti ittici freschi e confezionati sotto
vuoto utilizzando particolari additivi conservanti che siano specificamente in grado di
inibire la sintesi di AHL e che potrebbero essere definiti come “inibitori del quorum
sensing”. Va però rimarcato che non tutti i ricercatori sono concordi con queste
proposte; alcuni studiosi (Bruhn et al., 2004) fanno notare che il quorum sensing, pur
essendo un fattore che favorisce lo scadimento sensoriale delle carni, non è e non
può essere considerato la causa fondamentale della putrefazione delle carni fresche.
Dal punto di vista diagnostico, il rilevamento dei AHL nei substrati in cui si sospetta
una parte attiva del quorum sensing nei processi degradativi può essere fatto con
due tipi di controlli analitici:
(a)
prove biologiche che utilizzano vari ceppi batterici, in cui si punta a
inattivare il gene luxI omologo responsabile della produzione degli
AHL. Eliminato il gene suddetto in una certa popolazione batterica, è
evidente che l’espressione del gene sopra indicato diventerà
possibile solo se nel substrato che si vuole esaminare si ha la
presenza di altro AHL
(b)
vettori di plasmidi che rispondono all’inattivazione degli omologhi
LuxR, come è stato fatto in colture di E. coli. Grazie alla specificità di
ciascun omologo del LuxR diventa possibile individuare le differenti
molecole di AHL e di distinguerne il profilo di produzione.
Con questi sistemi diagnostici, i brasiliani Pinto e coll. (2007) hanno condotto indagini
sulla presenza dei principali mediatori chimici del quorum sensing, gli acil-omoserinalattoni, nelle flore microbiche Gram negative isolate dal latte crudo refrigerato. Già
Liu e Griffiths (2003) avevano rimarcato che i difetti del latte crudo provocati da un
eccessivo sviluppo di Pseudomonas fluorescens potevano essere correlabili alla
capacità del batterio di produrre AHL e di sintetizzare proteasi extracellulari. I
ricercatori brasiliani hanno studiato la liberazione di AHL da parte della flora
microbica Gram negativa isolata da latte crudo. In totale hanno isolato e identificato
53 differenti ceppi di batteri dei generi Acinetobacter, Aeromonas, Burkholderia,
Cedecea, Chryseomonas, Chryseobacterium, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella,
Moraxella, Pantoea, Providencia, Pseudomonas, Rahnella e Serratia. Gli autori hanno
evidenziato che quasi l’85% di tutti questi ceppi era in grado di produrre AHL e che,
di conseguenza, fra i batteri Gram negativi responsabili delle alterazioni del latte
crudo il quorum sensing gioca un ruolo di estrema importanza.
3. QUORUM SENSING DEI BATTERI GRAM POSITIVI
I batteri Gram positivi mettono in atto il quorum sensing utilizzando molecole
“segnale” e modalità differenti da quelle utilizzate dai Gram negativi. I Gram positivi
sfruttano come molecola di trasmissione del segnale un oligopeptide di origine
ribosomiale chiamato peptide autoinduttore (AIP o “peptide feromone”). Il gene che
codifica la sintesi di questa molecola messaggero, sovente è adiacente a un gene che
codifica il sistema regolatore a due componenti (2CRS). I Gram positivi che si sono
sinora rivelati in grado di produrre questo composto sono: Bacillus subtilis,
Carnobacterium maltaromaticum e C. piscicola, Enterococcus faecalis, Lactobacillus
plantarum e L. casei, Lactococcus lactis, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pneumoniae. Mancano ancora dati certi sull’esistenza di un quorum sensing in
Listeria monocytogenes e nelle listeria in genere, anche se ciò è probabile.
L’insieme dei due geni associati prende nome di “sistema regolatore a 3 componenti”
(3CRS). È opportuno ricordare che in tutti i batteri il sistema 2 CRS, formato da
istidina-proteina-chinasi (HPK) di membrana e da un regolatore di risposta (RR), è il
principale sistema di trasduzione di segnale attraverso la membrana cellulare. È
grazie a questo sistema 2CRS che i batteri possono percepire le modificazioni di pH,
concentrazioni di soluti, temperatura ecc. che intervengono nell’ambiente in cui sono
inseriti.
Nei batteri Gram negativi le molecole di AHL diffondono passivamente attraverso la
membrana del batterio, fluendo dal suo interno all’esterno; perché una seconda
cellula riesca a captare questo messaggio, invece, bisogna che il mediatore chimico
sia trasportato attivamente all’interno della cellula, se si vuole ottenerne una
reazione.
Nel caso dei batteri Gram positivi, invece, il modello peptide-feromone non prevede
quest’ultima fase, proprio grazie al fatto che la proteine sensore vista prima è già
collocata sulla faccia esterna della membrana. Il sistema 3CSR tiene sotto controllo e
regola la manifestazione di alcuni aspetti fenotipici dei batteri Gram positivi:
a)
sintesi di batteriocine in Carnobacterium piscicola, Lactobacillus plantarum,
L. casei ed Enterococcus faecium
b)
trasferimento di plasmidi mediante coniugazione in Enterococcus faecalis
c)
competenza genetica in Streptococcus pneumoniae e Bacillus subtilis
d)
espressione dei fattori di virulenza negli stafilococchi
e)
sporulazione di Bacillus subtilis
f)
formazione di biofilm
g)
risposte che i batteri mettono in atto contro gli stress subletali.
Studiando le sequenze genomiche complete esistenti di Streptococcus thermophilus
scopriamo che tutte comprendono i geni che codificano la sintesi del sistema 2CRS;
ne desumiamo, quindi, che tutti i ceppi del batterio sono potenzialmente in grado di
mettere in atto il quorum sensing (Hols et al., 2005).
Autori giapponesi hanno segnalato, infine, che probabilmente nei batteri Gram
positivi il quorum sensing funziona anche con altre molecole-segnale differenti dal
sistema 3CRS, i gamma-butiro-lattoni. Il fatto non deve stupire perché queste
molecole sono strutturalmente simili agli AHL dei Gram negativi e sembrano
intervenire nello stimolare la produzione di antibiotici in Streptomyces (Takano et al.,
2001).
IN SINTESI …
… Xavier e Bassler (2003) definiscono il quorum sensing «un processo di
comunicazione tra cellule batteriche che comporta la sintesi, la liberazione e la
captazione di “molecole segnale” extracellulari chiamate autoinduttori».
… un requisito essenziale perché il fenomeno si realizzi è il raggiungimento da parte
della popolazione microbica di un valore soglia, perché si possa contare su una certa
quantità minima di molecole antoinduttrici per trasmettere il segnale (Bassler, 2002).
… la scoperta dell’esistenza del quorum sensing e le sempre maggiori conoscenze
che si accumulano su questo argomento cominciano a rivoluzionare l’approccio che i
ricercatori hanno nello studio dei microrganismi.
… con le conoscenze del quorum sensing si cominciano a giustificare meglio
comportamenti prima non ben spiegabili, come la sporulazione dei batteri sporigeni e
altri aspetti di fisiologia microbica.
… il quorum sensing ci fa comprendere che le popolazioni microbiche non sono dei
semplici aggregati più o meno caotici di microrganismi che vivono ciascuno per
proprio conto, bensì una comunità coordinata al cui interno fluiscono costantemente
informazioni che permettono alla comunità stessa di resistere alle condizioni avverse
e di avvantaggiarsi per il loro fine.
… per altro verso, le conoscenze che si stanno accumulando sul quorum sensing
microbico permetteranno all’uomo di comprendere meglio i meccanismi di
colonizzazione microbica degli alimenti e dei loro processi alterativi. Le possibilità che
si schiudono sono quelle di potere interferire, per via chimica, con il coordinamento
delle società microbiche, scardinandolo o quanto meno disturbandolo. In questo
modo si dovrebbe riuscire a tenere meglio sotto controllo le popolazioni microbiche,
avendo come risultati ultimi un migliore livello di salubrità e igiene dei prodotti e un
aumento della loro conservabilità commerciale.
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