ISTRUZIONI PER L'USO
TERRENI SU PIASTRA
PRONTI ALL'USO
PA-254489.02
Rev.: giugno 2003
BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (Biplate)
USO PREVISTO
BD CHROMagar Orientation Medium/Columbia CNA Agar (Biplate) (terreno di coltura di
orientamento BD CHROMagar/agar Columbia CNA (doppia piastra) viene utilizzato per
l'isolamento dei batteri comunemente responsabili di infezioni del tratto urinario. Mentre
CHROMagar Orientation Medium è un terreno non selettivo per l'isolamento, l'identificazione o
la differenziazione degli agenti patogeni del tratto urinario, l'agar Columbia CNA è un terreno
selettivo per l'isolamento di batteri Gram-positivi.
PRINCIPI E SPIEGAZIONE DELLA PROCEDURA
Metodo microbiologico.
CHROMagar Orientation Medium: I gruppi di Escherichia coli, enterococchi, KlebsiellaEnterobacter-Serratia e Proteus-Morganella-Providencia sono gli organismi che più
frequentemente causano infezioni del tratto urinario. Il 60 – 70% delle infezioni urinarie sono
causate da E. coli in coltura pura o unitamente ad enterococchi. Lo Staphylococcus
saprophyticus e lo Streptococcus agalactiae si riscontrano, anche se con minor frequenza, nelle
infezioni del tratto urinario di pazienti donne.
Alcuni degli organismi in questione producono enzimi per il metabolismo del lattosio o glucosidi,
oppure entrambi, mentre altri non producono nessuno di questi enzimi. Ad esempio, l'E. coli
produce enzimi del metabolismo del lattosio ma è negativa per quanto riguarda la ß-glucosidasi.
Altri membri della famiglia delle Enterobacteriaceae sono positivi alla ß-glucosidasi ma non
contengono gli enzimi necessari per la fermentazione del lattosio, mentre altri possono
contenere entrambi i tipi di enzimi o nessuno di essi. Le beta-glucosidasi si trovano anche nei
cocchi Gram-positivi ad esempio Enterococcus spp. e Streptococcus agalactiae. La triptofano
deaminasi è un enzima che di solito si trova negli organismi del gruppo Proteus-MorganellaProvidencia.
CHROMagar Orientation Medium consente l'identificazione di E. coli, enterococchi e gran parte
dei ceppi di Staphylococcus saprophyticus e S. simulans direttamente sulla piastra di
isolamento; inoltre la rilevazione dei gruppi Klebsiella-Enterobacter-Serratia (=KES) e ProteusMorganella-Providencia (=PMP) è possibile mediante la colorazione della colonia e del terreno
di coltura.1-3 Dato che CHROMagar Orientation Medium non è selettivo, la crescita riguarderà
anche altri agenti patogeni del tratto urinario, ma sono necessari test biochimici per la loro
identificazione.
CHROMagar Orientation Medium è stato sviluppato da A. Rambach e viene venduto da BD
Diagnostic Systems su licenza di CHROMagar, Parigi, Francia.
In BD CHROMagar Orientation Medium i nutrienti sono forniti da peptoni appositamente
selezionati. La miscela cromogena è costituita da substrati artificiali (cromogeni) che rilasciano
composti di colore diverso a seconda della degradazione di enzimi microbici specifici,
assicurando in tal modo la differenziazione diretta di alcune specie o la rilevazione di determinati
gruppi di organismi, mediante semplici test di conferma
Columbia CNA Agar: Ellner e colleghi hanno documentato lo sviluppo di una formulazione di
agar contenente sangue, definito agar Columbia.4 Questo terreno consente di ottenere colonie
di dimensioni più grandi e una crescita maggiore rispetto a quanto avviene su basi agar
contenenti sangue paragonabili e viene utilizzato per terreni di coltura contenenti sangue e per
formulazioni selettive. Ellner e colleghi hanno riscontrato che un terreno contenente 10 mg di
colistina e 15 mg di acido nalidixico per litro in una base di agar Columbia, arricchito con 5% di
sangue di montone, facilita la crescita di stafilococchi, streptococchi emolitici ed enterococchi,
mentre inibisce la crescita di Proteus, Klebsiella e Pseudomonas spp.4
L'agar Columbia fornisce un terreno di base altamente nutritivo. L'aggiunta di agenti
antimicrobici, colistina e acido nalidixico rende il terreno selettivo per i microorganismi GramPA-254489.02
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positivi, soprattutto streptococchi e stafilococchi. Al terreno viene aggiunto sangue di montone
per consentire la rilevazione di reazioni emolitiche.4,5
REAGENTI
BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (Biplate)
Formule approssimative* per litro di acqua purificata
CHROMagar Orientation Medium
Cromopeptoni
16,1 g
Miscela cromogena
1,3
Agar
15,0
pH 6,9 ± 0,2
Digerito pancreatico di caseina
Digerito peptico di tessuto animale
Estratto di lievito
Estratto di carne bovina
Amido di granturco
pH 7,3 ± 0,2
Columbia CNA Agar
12,0 g
Cloruro di sodio
5,0
Agar
3,0
Colistina
3,0
Acido nalidixico
1,0
Sangue defibrinato di montone
5,0 g
13,5
0,01
0,015
5%
*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di rendimento.
PRECAUZIONI
. Solo per uso professionale.
Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazioni cromatiche,
essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento.
Per maneggiare i prodotti in condizioni asettiche, riconoscere i rischi biologici e smaltire i
prodotti usati, consultare le ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO.
CONSERVAZIONE E VITA UTILE
Alla consegna, conservare le piastre al buio a 2 – 8 °C nella confezione originaria fino a
immediatamente prima dell'uso. Evitare congelamento e surriscaldamento. Le piastre possono
essere inoculate sino alla data di scadenza (v. l'etichetta sulla confezione) e incubate per i
tempi di incubazione raccomandati.
Le piastre prelevate dalle confezioni da 10 già aperte possono essere usate per una settimana
se conservate in luogo pulito a 2 – 8 °C. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce prima e
durante l'incubazione, in quanto la luce distrugge i cromogeni inclusi in CHROMagar
Orientation Medium.
CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE
Inoculare i campioni rappresentativi con i seguenti ceppi (per informazioni più dettagliate, v.
ISTRUZIONI GENERALI PER L'USO). Incubare le piastre in aerobiosi a 35 – 37 °C per 20 –
24 h.
Ceppi per test
Enterococcus
faecalis
ATCC 29212
Streptococcus
agalactiae
ATCC 12386
Staphylococcus
aureus
ATCC 25923
Escherichia coli
ATCC 25922
PA-254489.02
CHROMagar Orientation Medium
Crescita da buona a eccellente,
piccole colonie dal verdazzurro al blu
Columbia CNA Agar
Crescita da buona a eccellente, colonie
grigie; assenza di emolisi
Crescita da discreta a buona; piccole
colonie blu
Crescita da buona a eccellente, colonie
dal bianco al grigio; beta-emolisi
Crescita da buona a eccellente,
colonie dal bianco al giallastro
Crescita da buona a eccellente, colonie
biancastre, beta-emolisi
Crescita da discreta a eccellente,
colonie medie, trasparenti, rosa
Inibizione completa
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Ceppi per test
Klebsiella
pneumoniae
ATCC 27736
Proteus vulgaris
ATCC 8427
Non inoculate
CHROMagar Orientation Medium
Crescita da buona a eccellente,
colonie medie, blu scuro con o senza
alone
Crescita da discreta a eccellente;
colonie verdazzurre; il terreno
circostante è da ambra a marrone
Da incolori a beige chiaro, trasparenti
Columbia CNA Agar
Inibizione da parziale a completa
Inibizione da parziale a completa
Rosse (color sangue)
PROCEDURA
Materiali forniti
BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (doppie piastre impilate Stacker
da 90 mm). Microbiologicamente controllate.
Materiali non forniti
Terreni di coltura accessori, reagenti e apparecchiature di laboratorio necessarie.
Tipi di campioni
BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar è utilizzato esclusivamente per
l'isolamento, la conta e la differenziazione dei batteri nelle urine. Si può utilizzare l'urina della
minzione o del catetere, o quella raccolta mediante puntura vescicale ipogastrica (v. anche
PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA). Osservare le
tecniche asettiche per il prelievo dei campioni urinari. Strisciare l'urina direttamente sul terreno
non più tardi di 2 h dopo il prelievo o conservarla in frigorifero (non oltre 24 h) per evitare
l'eccessiva crescita di agenti infettivi o contaminanti prima dell'inoculazione del terreno.6-8
Procedura del test
Prelevare un campione di urina ben miscelata e non diluita usando un'ansa calibrata (0,01 o
0,001 mL). Per l'inoculazione dei terreni in piastre doppie è preferibile usare anse da 0,001 mL
(= 1 µL). Verificare che l'ansa sia caricata correttamente con il campione. In primo luogo
inoculare il campione in una piccola area della superficie di CHROMagar Orientation Medium;
quindi inoculare il restante terreno. In seguito, raccogliere un nuovo campione di urine e
procedere nello stesso modo per Columbia CNA Agar. Se si utilizzano anse da 10 µL, si
consiglia di prediluire dieci volte il campione di urina in soluzione fisiologica sterile. Incubare la
piastra inoculata in posizione invertita a 35 – 37 °C in aerobiosi per 20 – 24 h. Non è
consigliabile incubare la doppia piastra in un'atmosfera arricchita di anidride carbonica. Ridurre
al minimo l'esposizione alla luce durante l'incubazione, in quanto la luce potrebbe
distruggere i cromogeni inclusi in CHROMagar Orientation Medium. Una volta che i colori
delle colonie si sono sviluppati l'esposizione alla luce è consentita.
È obbligatorio l'uso di anse calibrate o altre tecniche comunemente utilizzate per il
posizionamento sulla piastra dei campioni di urina al fine di ottenere colonie isolate, con le
tipiche forme e colori.
Risultati
Dopo l'incubazione i terreni dovrebbero presentare colonie isolate nelle aree in cui l'inoculo è
stato correttamente diluito. Per l'identificazione o la differenziazione utilizzare lo Schema 1
oppure servirsene come linee guida per ulteriori reazioni di conferma su CHROMagar
Orientation Medium. Per la verifica dei risultati possono essere utilizzati una colorazione di Gram
o l'indagine microscopica.
La crescita di batteri Gram-positivi, se presenti, può avvenire sull'agar Columbia CNA. Per
ulteriori informazioni e l'interpretazione della crescita su questo terreno, consultare la
bibliografia.5,9
Test di conferma
Eseguire i necessari test di conferma per CHROMagar Orientation Medium (Schema 1). Non
applicare reagenti di rilevazione, ad es. il reagente per l'indolo alla DMACA o altri reagenti
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direttamente sulle colonie in questo terreno. I test devono invece essere eseguiti su filtri di carta
con crescita proveniente dalle rispettive colonie.
Per le colonie di E. coli non utilizzare reagente Kovac per l'indolo, in quanto il colore di queste
colonie può interferire con il colore rosso indice di positività dei test per l'indolo; utilizzare in
sostituzione reagente per l'indolo alla dimetilaminocinnamaldeide (DMACA).
Se si utilizzano altri test di conferma o sistemi di identificazione biochimici, seguire le relative
istruzioni.
Calcolo e interpretazione dei risultati6-9
Contare il numero di colonie (UFC) su ciascun terreno. Se è stata utilizzata un'ansa da
0,001 mL, ogni colonia corrisponde a 1000 UFC/mL di urina.7
Urina della minzione e del catetere: le direttive vigenti stabiliscono che se un singolo isolato ha
una densità di ≥105 UFC/mL è presente infezione, se la densità è <105 UFC/mL si ha
contaminazione uretrale o vaginale, mentre una densità tra 104 e 105 UFC/mL rende necessario
un riesame alla luce dei dati clinici.
I batteri contaminanti in genere appaiono in numero ridotto e in colonie di differenti forme.
Urina prelevata mediante puntura vescicale ipogastrica: poiché la vescica è sterile nei soggetti
non infetti, le UFC eventualmente osservate indicano la presenza di un'infezione.
Gli agenti patogeni del tratto urinario di solito danno luogo a conte elevate, con colore e
morfologia delle colonie uniformi in questo terreno di coltura.
PRESTAZIONI METODOLOGICHE E LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
BD CHROMagar Orientation Medium/Columbia CNA Agar (Biplate) viene utilizzato per
l'isolamento, l'identificazione o l'identificazione presuntiva di batteri comunemente responsabili di
infezioni del tratto urinario.
CHROMagar Orientation Medium è un terreno di coltura cromogeno per l'identificazione diretta,
la differenziazione e la conta di agenti patogeni comuni del tratto urinario. Il terreno di coltura è
usato per l'isolamento di numerosi microrganismi a crescita aerobica, ad es.
Enterobacteriaceae, Pseudomonas e altri bacilli Gram-negativi non fermentanti, enterococchi,
stafilococchi e molti altri presenti nei campioni urinari.
Consente l'identificazione diretta dell'Escherichia coli mediante il colore delle colonie e un test
per l'indolo di conferma, oltre all'identificazione diretta dell'enterococco e dello Streptococcus
agalactiae mediante il colore delle colonie e un test PYR di conferma o, in alternativa un test di
agglutinazione sierologico per la determinazione del gruppo Lancefield. È inoltre possibile
identificare altri organismi dopo l'esecuzione di alcuni test di conferma oppure può essere
necessaria un'identificazione biochimica completa, a seconda delle specie. Dato che la maggior
parte delle infezioni del tratto urinario sono causate da E. coli e/o enterococchi, l'uso di questo
terreno di coltura riduce significativamente il carico di lavoro e il tempo necessari per inoculare e
leggere i sistemi di identificazione obbligatori quando per l'isolamento si utilizzano terreni di
coltura convenzionali.
Columbia CNA Agar è un terreno standard per l'isolamento e la coltura di molti microorganismi
Gram-positivi a crescita aerobica, ad es. streptococchi, stafilococchi, corineformi, Listeria spp. e
altri.5,7,9
Risultati delle prestazioni2,10
Sono state condotte due valutazioni indipendenti delle prestazioni di CHROMagar Orientation
Medium. In entrambi gli studi il terreno cromogeno ha rilevato più agenti patogeni dei terreni
tradizionali utilizzati a confronto. I particolari della prima valutazione sono stati pubblicati e i
risultati del primo e del secondo studio sono riportati nel documento delle istruzioni per l'uso di
BD CHROMagar Orientation Medium (n. cat. 254102).2
Limitazioni della procedura
CHROMagar Orientation Medium: Le colonie che si presentano del loro colore naturale e non
reagiscono con i substrati cromogeni devono essere ulteriormente differenziate con test
biochimici o sierologici adeguati. Consultare la bibliografia.9,11
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I bacilli Gram-negativi diversi da quelli appartenenti al gruppo KES possono dare luogo a grandi
colonie di colore blu e quindi per la loro identificazione potrebbero essere necessari ulteriori test
biochimici.11
In casi molto rari nell'urina potrebbero essere presenti Listeria monocytogenes o altre specie di
Listeria (ad es., in conseguenza di aborto dovuto a questi agenti). La Listeria produce piccole
colonie dal blu al verdazzurro.
PYR-negative, somiglianti allo Streptococcus agalactiae (vedere lo Schema 1). Pertanto
potrebbe essere utile preparare una colorazione di Gram di tutti i ceppi che, su questo terreno di
coltura, danno luogo a piccole colonie di colore dal blu al verdazzurro PYR-negative. La
presenza di bacilli Gram-positivi può essere indice di Listeria spp. Sono necessari ulteriori test
biochimici per accertare la presenza di questi agenti.
Molto raramente, gli isolati di Aeromonas hydrophila possono produrre colonie dal rosa al rosa
acceso. È possibile differenziarle dall'E. coli mediante un test per l'ossidasi (Aeromonas =
positivo; E. coli = negativo).
Occasionalmente, le colonie di stafilococchi coagulasi-negativi diversi dallo S. saprophyticus, ad
es., S. simulans, S. xylosus e S. intermedius, possono assumere una colorazione dal rosa al
rosa acceso. È pertanto necessario eseguire ulteriori test (vedere lo Schema 1) su questi isolati.
BD CHROMagar Orientation Medium non supporta la crescita di organismi esigenti, quali
Neisseria, Haemophilus o Mycoplasma spp.
L'uso di questo terreno di coltura per campioni clinici e non clinici diversi dall'urina non è stato
convalidato.
Prima di utilizzare per la prima volta BD CHROMagar Orientation Medium, si consiglia di far
pratica con l'aspetto di una colonia tipica utilizzando ceppi definiti, ad es. i ceppi citati in
CONTROLLO DI QUALITÀ A CURA DELL'UTENTE.
Columbia CNA Agar: su questo terreno possono crescere batteri che mostrano resistenza agli
ingredienti selettivi.
La Candida ed altri funghi non sono inibiti su questo terreno.
Sebbene si tratti di batteri Gram-positivi, gli organismi aerobici che formano spore, ad es.
Bacillus spp., possono risultare inibiti in Columbia CNA Agar with 5% Sheep Blood.
Benché alcuni test diagnostici possano essere eseguiti direttamente sul terreno, per completare
l'identificazione sono necessari test biochimici e, all'occorrenza, immunologici, eseguiti usando
colture pure.
L'agar Columbia ha un contenuto relativamente alto di carboidrati e quindi gli streptococchi
beta-emolitici possono produrre una reazione emolitica verdastra che può essere confusa con
l'alfa-emolisi.
BIBLIOGRAFIA
1. Merlino, J., S. Siarakas, G. J. Robertson, G. R. Funnell, T. Gottlieb, and R. Bradbury. 1996.
Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiation and presumptive identification of
gram-negative bacilli and Enterococcus species. J. Clin. Microbiol. 34: 1788-1793.
2. Hengstler, K.A., R. Hammann, and A.-M. Fahr. 1997. Evaluation of BBL CHROMagar
Orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens.
J. Clin. Microbiol. 35: 2773-2777.
3. Samra, Z., M. Heifetz, J. Talmor, E. Bain, and J. Bahar. 1998. Evaluation of use of a new
chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J. Clin. Microbiol. 36: 990-994.
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medical bacteriology. Am. J. Clin. Pathol. 45:502-504.
5. MacFaddin, J. F. 1985. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical
bacteria, vol. 1, p. 269-275.Williams & Wilkins, Baltimore, MD.
6. Barry, A.L., P.B. Smith, and M. Turck. 1975. Cumitech 2, Laboratory diagnosis of urinary tract
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D.C.
7. Forbes, B.A., and P.A. Granato. Processing specimens for bacteria. 1995. In: Murray, P. R.,
E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical
microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
PA-254489.02
-5-
8. Clarridge, J.E., M.T. Pezzlo, and K.L. Vosti. 1987. Cumitech 2A, Laboratory diagnosis of
urinary tract infections. Coordinating ed., A.S. Weissfeld. American Society for Microbiology,
Washington, D.C.
9. Isenberg, H. D. (ed.). 1992. Interpretation of aerobic bacterial growth on primary culture
media, Clinical microbiology procedures handbook, vol.1, p. 1.6.1-1.6.7. American Society
for Microbiology, Washington, D.C.
10. Data on file. BD Diagnostic Systems Europe, Heidelberg, Germany.
11. Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). 2003.
Manual of clinical microbiology, 8thed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
CONFEZIONE/DISPONIBILITÀ
BD CHROMagar Orientation Medium / Columbia CNA Agar (Biplate)
N. di cat. 254489
Terreni su piastra pronti all'uso, confezioni da 20
ULTERIORI INFORMAZIONI
Per ulteriori informazioni, rivolgersi al rappresentante BD di zona.
BD Diagnostic Systems
Tullastrasse 8 – 12
D-69126 Heidelberg/Germany
Phone: +49-62 21-30 50
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11 rue Aristide Bergès
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Tel: +33-476 68 3636 Fax: +33-476 68 3292
http://www.bd.com
BD, BD logo and Stacker are trademarks of Becton, Dickinson and Company
CHROMagar is a trademark of Dr. A. Rambach
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection
2003 Becton, Dickinson and Company
Schema 1: linee guida per l'aspetto delle colonie, le prestazioni dei test di conferma e la
differenziazione o identificazione che ne risulta su BD CHROMagar Orientation Medium
Piccole colonie dal verdazzurro al blu
↓
Test PYRb
↓
↓
rosse (+)
incolori (-)a
Enterococcus spp. Cocchi: Str. agalactiae
Bacilli: Listeria spp.
Grandi colonie blu:
Gruppo Klebsiella-Enterobacter-Serratia (KES)
↓
Identificare le specie con test biochimici
Grandi colonie rosa, trasparenti:
↓
Test per l'indolo alla DMACAc
↓
↓
verdi (+)
da incolori a rosse (+)
E. coli d Identificare le specie con test biochimici
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Piccole colonie opache, dal rosa acceso al rosa:
↓
Disco di novobiocina da 5 µg e
↓
↓
resistente suscettibile
Staphylococcus saprophyticus f, S. Xylosus f S. simulans f S. intermedius g
↓
↓
Identificare le specie con test biochimici
Colonie da incolori a beige su terreno da ambra a marroneh:
Gruppo Proteus-Morganella-Providencia (PMP)
↓
Test dell'indolo alla DMACA c
↓
↓
verdi (+)
da incolori a rosa (-)
Proteus vulgaris H2S + i Proteus mirabilis ( ODC +) j
Providencia spp. H2S- Proteus penneri (ODC -)
Morganella spp. H2S a
È consigliata la colorazione di Gram.
Test del piroglutamato per la pirrolidonil arilamidasi. Per il gruppo Lancefield è possibile utilizzare test
sierologici anziché il test PYR per la differenziazione di Enterococcus spp. da Streptococcus agalactiae.
c
DMACA= Reagente alla dimetilaminocinnamaldeide per la produzione di indolo. Applicare il reagente su
filtro di carta e strofinare una colonia con l'area contenente il reagente sul filtro di carta. Attendere 10 – 20
sec. Il colore verde è indice della produzione di indolo (rosso o incolore = negativo). Non utilizzare il
reagente Kovac per l'indolo su colonie di colore rosa!
d
Su tutte le grandi colonie rosa positive all'indolo può essere eseguito un test per l'ossidasi al fine di
escludere l'Aeromonas (= ossidasi-positiva).
e
Inoculare per strisciamento una piastra Mueller Hinton II Agar con l'isolato. Posizionare un disco alla
novobiocina (da 5 µg) sulla piastra inoculata. Incubare per 18 – 24 h a 35 – 37 °C e misurare le
dimensioni della zona di inibizione (resistente: ≤ 16 mm, suscettibile: > 16 mm).
f
Noti come patogeni umani, possono essere isolati anche dalle urine.
g
Non è noto se possano essere isolati dalle urine umane.
h
Il colore dall'ambra al marrone è dovuto alla positività alla triptofano deaminasi (TDA) comune a tutti gli
organismi che fanno parte del gruppo PMP. Circa il 50% dei ceppi di P. vulgaris producono colonie blu su
terreno da ambra a marrone.
i
Test convenzionale per l'acido solfidrico.
j
Test convenzionale per la ornitina decarbossilasi.
b
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