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L’utilizzo degli UV nel trattamento delle acque destinate al consumo umano Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi Roberto Porro Genova, 19 ottobre 2006 Spettro elettromagnetico Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Spettro ultravioletto UV–A (315-400 nm) 9 Principale frazione di luce UV solare che raggiunge la Terra, poiché minimamente trattenuta dall’atmosfera. 9 Scarso potere germicida. 9 Nell’uso “commerciale” UV-A è impiegato soprattutto nelle lampade abbronzanti. UV–B (280-315 nm) 9 Componente UV solare trattenuta al 90% dall’atmosfera. 9 Limitato potere germicida. 9 Applicazioni ospedaliere (psoriasi, vitiligine, ittero neonatale), laser ad eccimeri (cataratta, miopia). Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Spettro ultravioletto UV–C (200-280 nm) 9 Frazione UV solare totalmente assorbita dall’atmosfera (ma il “buco dell’ozono” ne ha ridotto le proprietà filtranti). 9 Elevato potere germicida. 9 Applicazione nei processi di trattamento acque potabili e reflue. Vacuum UV (100-200 nm) 9 Spettro UV fortemente assorbito dall’acqua e dall’ossigeno atmosferico. 9 Efficace potere germicida, ma limitato a pochi mm d’acqua. 9 A contatto con l’acqua genera radicali altamente reattivi: utilizzo come processo di ossidazione avanzata (AOP) per la fotodegradazione di inquinanti organici. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Caratteristiche degli UV Effetti sull’uomo Spettro UV Assorb. atmosf. Potere germicida Applicaz. industriali A Minimo Basso Lampade abbronz. - Cataratta + Pigmentaz. melaninica - Bruciature epidermiche + Sintesi vitamina D - Immunosop. B ∼90% Basso Ospedali - Fotocheratite - Congiuntivite - Eritema - Cancro + Sintesi vitamina D C ∼100% Elevato Lampade disinfett. - Fotocheratite - Cecità temporanea - Eritema - Cancro Vacuum ∼100% Elevato AOP Occhi Pelle Organismo + effetti positivi - effetti negativi Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Effetti biologici degli UV Fonte: Pratesi R. (1993). Radiazioni non ionizzanti, ed. Pitagora Meccanismi di inattivazione di agenti chimici/fisici in ambito industriale Bersaglio Agente Effetti Parete cellulare 9 Aldeidi 9 Tensioattivi anionici 9 Ozono Interazione con gruppi –NH2 della parete Lisi cellulare Membrana citoplasmatica 9 Sali quaternari di ammonio 9 Ipoclorito Alterazione della permeabilità: fuoriuscita di citoplasma e materiale a basso peso molecolare Acidi nucleici Rottura della catena DNA/RNA 9 Composti alchilanti 9 Radiazioni ionizzanti Cross link 9 Radiazioni UV Alterazione degli acidi nucleici Enzimi o proteine 9 Ioni metallici 9 Composti alchilanti 9 Biossido di cloro, acido peracetico Rottura gruppi –SH degli enzimi Alterazione/legame con la struttura delle proteine Fonte: Block S.S. (1991). Disinfection, Sterilization and Preservation; 4th ed. Lea & Febiger, Philadelphia DNA Meccanismi di inattivazione con UV ¾ La radiazione UV induce danni agli acidi nucleici (DNA o RNA) dei microrganismi: l’alterazione molecolare delle basi azotate impedisce la replicazione degli agenti patogeni. ¾ In pratica vengono inibite anche le fasi di trascrizione (DNA → mRNA) e di traduzione (mRNA → proteina). ¾ Il danno agli acidi nucleici dei microrganismi non inibisce comunque le funzioni metaboliche. Tuttavia, non potendo riprodursi, gli agenti patogeni non sono in grado di infettare l’ospite. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Adsorbanza UV L’adsorbanza di luce UV da parte del DNA è dovuta al contributo delle adsorbanze delle basi azotate, con picco massimo attorno a 260 nm (254 nm) e minimo a 230 nm Danni indotti dall’UV I più frequenti danni al DNA sono i dimeri di pirimidine adiacenti nello stesso filamento, ovvero 9 Dimero T-T 9 Fotoprodotto (6-4) Ma è possibile, seppure con minore frequenza, la formazione di dimeri C-C e T-C. Nei virus a RNA l’irraggiamento UV induce soprattutto la formazione di dimeri C-C e U-U. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Dimero di Timine I fotoni di luce UV destabilizzano i legami idrogeno tra basi complementari T-A favorendo la messa in comune di 2 elettroni tra timine adiacenti lungo lo stesso filamento. Il legame covalente T-T (dimero) “distorce” la struttura elicoidale del DNA, impedendo la fase di replicazione. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Danni indotti dall’UV Altri danni agli acidi nucleici possono verificarsi, in genere, con percentuale inferiore al 5%: 9 alterazione delle basi puriniche (A e G); 9 fotoidrati di pirimidina (T e U). Infine, altre alterazioni del DNA possono avvenire con dosi UV più alte di quelle impiegate nella disinfezione di acque potabili: 9 rottura doppia o singola dell’elica del DNA; 9 “cross-links” (legami covalenti tra due eliche di DNA) Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Dose UV-risposta Come per i disinfettanti chimici, anche il processo con UV può essere rappresentato dal modello C • t: al posto di C si considera l’intensità d’irraggiamento I, ovvero la potenza (W o mW) per unità di superficie (m2 o cm2). Quindi la Dose UV si ottiene dalla relazione: (mJ/cm2) D = dose UV I = intensità (mW/cm2) t = tempo di esposizione (sec.) D=I • t Variando I e t si ottengono differenti dosaggi in funzione delle necessità di riduzione microbica (log inattivazione), poiché l’efficacia degli UV varia secondo la specie di microrganismo: Virus Batteri Criptosporidium (oocisti) Giardia (cisti) Resistenza agli UV Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Dose UV-risposta Dosi medie (mJ/cm2) di inattivazione (Studi bench-scale con collimatore di luce UV) Fonte: Wright H.B. and Sakamoto G. (1999). UV dose required to achieve incremental log inactivation of bacteria, virus and protozoa. Trojan Technologies, Inc., London, Ontario, Canada Dose UV-risposta • In realtà, la dose UV trasferita dalla lampada di un reattore ai microrganismi non può essere valutata direttamente dalla relazione D = I • t poiché nel sistema dinamico tali grandezze non possono essere misurate con l’adeguata accuratezza. • Nel reattore UV la variabilità delle caratteristiche chimiche dell’acqua (trasmittanza, ecc.), la geometria del reattore (turbolenze), le variazioni di portata e il progressivo calo di efficienza della lampada (invecchiamento) possono causare un sensibile scostamento dal caso “ideale”. • Il manuale U.S.EPA (Ultraviolet Disinfection Guidance Manual) descrive le procedure di validazione dei reattori UV con test microbiologici in condizioni statiche (collimatore UV) e dinamiche (biodosimetria). • Con il bioassay si opera in differenti condizioni di potenza della lampada, di portata, di trasmittanza e di concentrazione microbica. I risultati di inattivazione sono interpolati con le curve dose/risposta ottenute in bench scale, considerando opportuni fattori di sicurezza. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Cinetica di inattivazione L’andamento della riduzione microbica è rappresentato dall’equazione: Log inattivazione = log10 N0/N L’andamento lineare di 1° ordine (caso “ideale”) può differire dalle condizioni “reali” (reattore UV). Spesso possono verificarsi scostamenti quali: “Shoulder” Inattivazione poco efficace a basse dosi UV, cui segue un andamento lineare o esponenziale con l’incremento della dose (es. Bacillus subtilis). “Tailing” Diminuzione dell’efficacia di inattivazione (“appiattimento” della curva), dopo il raggiungimento di un certo log (es. microrganismi aggregati o legati a particelle, tipico delle acque reflue). Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Cinetica di inattivazione Fonte: Chang J.C.H. et al. (1985). UV Inactivation of Pathogenic and Indicator Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology 49, n.6: 1361-1365. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Meccanismi biologici di riparazione Il danno agli acidi nucleici in seguito all’esposizione UV non inibisce, tuttavia, le reazioni cellulari del microrganismo. In alcune circostanze specifici enzimi cellulari possono riparare i danni molecolari al DNA. In questo caso, l’agente patogeno riacquista l’infettività. I meccanismi di riparazione enzimatica sono essenzialmente due: 1 - Fotoriattivazione 2 - Dark repair Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Fotoriattivazione Processo di riparazione enzimatica che può avvenire solo in presenza di luce. È catalizzata dall’enzima fotoliasi: 1. si lega alla sezione di DNA danneggiato, in assenza di luce; 2. è attivato dall’esposizione a range di luce tra 310-490 nm; 3. separa il dimero T-T per monomerizzazione. Le reazioni di fotoriparazione sono molto efficienti, rapide e non richiede rottura del segmento di DNA danneggiato. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Fotoriattivazione Fattori che influenzano la fotoriattivazione: 9 log inattivazione raggiunto (la probabilità che si verifichi riparazione è inversamente proporzionale alla dose UV applicata); 9 specie e ceppo di microrganismo; 9 tempo intercorso tra esposizione agli UV e luce riattivante; 9 condizioni ambientali (pH, temperatura, “nutrienti”). Virus a DNA sono privi della fotoliasi, ma la riattivazione può avvenire utilizzando l’enzima cellulare dell’ospite. Non si evidenzia fotoriattivazione di Giardia e Cryptosporidium con dosi UV comprese tra 16 e 40 mJ/cm2. In definitiva: la fotoriattivazione non avviene in sistemi UV a canale chiuso (tipici delle acque potabili) ma può verificarsi in quelli a canale aperto (disinfezione di acque reflue). Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Differenza di dose UV necessaria ad ottenere determinati log inatt. in microrganismi con e senza fotoriattivazione Fonte: Knudson G.B. (1985). Photoreactivation of UV-irradiated Legionella pneumophila and other Legionella species. Applied and Environmental Microbiolgy 49, n.4:975-980. Dark repair La definizione “riparazione al buio è ambigua poiché può avvenire in presenza di luce e non richiedere, quindi, oscuramento. Contrariamente alla fotoriattivazione (specifica per i dimeri pirimidinici), la dark repair può riparare diverse tipologie di danno agli acidi nucleici. La maggior parte dei batteri possiedono gli enzimi necessari per la reazione. Come per la fotoriattivazione, non è dimostrata dark repair in Giardia e Cryptosporidium con dosi UV impiegate nella potabilizzazione. I virus a DNA possono utilizzare gli enzimi di riparazione della cellula ospite, quelli a RNA no. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro Dark repair Processo enzimatico che avviene in 4 fasi: 1 - l’endonucleasi riconosce la frazione di DNA danneggiato e separa la doppia elica; 2 - l’endonucleasi scinde la sezione di DNA alterata; 3 - la DNA polimerasi ricostruisce la sezione rimossa utilizzando l’elica complementare; 4 - la ligasi riunisce la doppia elica del DNA. Caratteristiche degli UV e inattivazione dei microrganismi – Roberto Porro
![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
